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        GeXP檢測rhIL-24聯(lián)合DDP對人肺腺癌A549/DDP細胞凋亡相關(guān)基因的實驗研究①

        2017-02-27 05:56:26郭錦錦王少慧孫萬邦宋明英唐艷麗
        中國免疫學(xué)雜志 2017年2期
        關(guān)鍵詞:肺癌檢測

        郭錦錦 王少慧 孫萬邦 宋明英 唐艷麗

        (遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地,珠海519041)

        GeXP檢測rhIL-24聯(lián)合DDP對人肺腺癌A549/DDP細胞凋亡相關(guān)基因的實驗研究①

        郭錦錦 王少慧②孫萬邦 宋明英 唐艷麗③

        (遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地,珠海519041)

        目的:利用多基因遺傳表達分析系統(tǒng)(GeXP)探討重組人白細胞介素-24(rhIL-24)聯(lián)合順鉑(DDP)誘導(dǎo)人肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP細胞6個凋亡相關(guān)基因的變化。方法:用rhIL-24、DDP及rhIL-24+DDP干預(yù)A549/DDP細胞,應(yīng)用多基因遺傳表達分析系統(tǒng)(GeXP)同時檢測Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、Rb與P53等6個凋亡相關(guān)基因。結(jié)果:rhIL-24蛋白可引起A549/DDP細胞Bax基因、Caspase3基因、Rb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào);Bcl-2基因、Survivin基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),但抑癌基因P53變化無規(guī)律,rhIL-24 聯(lián)合DDP 后Bax、Survivin、Rb表達較單獨rhIL-24組變化更加顯著。結(jié)論:rhIL-24蛋白可通過上調(diào)Bax,下調(diào)Bcl-2、Survivin,激活Caspase3,上調(diào)抑癌基因Rb誘導(dǎo)人肺腺癌A549/DDP細胞凋亡。

        多基因遺傳表達分析系統(tǒng);白細胞介素-24;肺腺癌;凋亡

        原發(fā)性肺癌是危害我國城鄉(xiāng)居民的惡性腫瘤之一,居我國癌癥死因首位,其中非小細胞肺癌約占所有肺癌的80%。目前肺癌較難治愈,主要以手術(shù),放化療為主,但由于80%的肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期,失去手術(shù)治療的最佳時期,所以化療在肺癌的治療中起重要作用。臨床上肺癌的化療主要是以順鉑為一線化療藥物多藥聯(lián)合應(yīng)用,但由于肺癌治療中多藥耐藥的出現(xiàn)以及化療藥物嚴重的副作用,肺癌的治療效果并不理想。IL-24作為一種新型的抑癌因子,為肺癌的治療提供了新的思路。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[1]人白細胞介素-24(human interleukin-24,hIL-24)可抑制人肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP細胞的生長,誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡、調(diào)控細胞周期等發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)作用,聯(lián)合順鉑(DDP)后生長抑制效果更加明顯,為了探究IL-24對A549/DDP細胞的凋亡誘導(dǎo)機制,我們將rhIL-24蛋白、DDP、rhIL-24聯(lián)合DDP作用于A549/DDP細胞,以Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb為目的基因,B2M、ACTB、ESD、YAP1、TBP為內(nèi)參基因,利用多基因表達分析系統(tǒng)進行檢測,對rhIL-24蛋白作用機制進行研究,以期為IL-24治療肺癌的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實驗室;rhIL-24蛋白購于美國R&D公司;RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司;胎牛血清購于Hyclon公司;DDP購于山東齊魯制藥;多基因遺傳表達分析系統(tǒng)購于美國貝克曼庫爾特(Beckman)公司。

        1.2 方法

        1.2.1 A549/DDP細胞培養(yǎng) A549/DDP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞,接種于無菌培養(yǎng)瓶,分別加入rhIL-24(160 ng/ml)、DDP(3 μg/ml)、rhIL-24(160 ng/ml)+DDP(3 μg/ml),培養(yǎng)24 h后收集細胞。

        1.2.2 RNA 的提取 將陰性組、rhIL-24組、DDP+ rhIL-24組A549/DDP細胞鋪于6孔板中,每孔加1 ml Trizol,晃動后吹打吸取,加入氯仿混勻,10 000 r/min 4℃離心15 min,吸取上層至離心管中,加入異丙醇,顛倒數(shù)次,室溫沉淀10 min。10 000 r/min 4℃離心10 min,棄上清。加入75%乙醇混勻, 8 000 r/min 4℃離心5 min,棄上清。加入20 μl DEPC水溶解,-70℃凍存。

        1.2.3 引物設(shè)計 引物由GeXP Express軟件設(shè)計,由上海生工生物工程股份有限公司合成,各引物序列及長度參考文獻[2]。

        1.2.4 RT引物驗證 配置RT反應(yīng)試劑,反應(yīng)條件為48℃,1 min、42℃,60 min、95℃,5 min、4℃,Hold;置XP-PCR反應(yīng)試劑,反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參考文獻[3]。

        1.2.5 RT引物濃度優(yōu)化 引物驗證之后,根據(jù)峰圖,將RT引物分為信號過強組與信號正常組,將信號過強組進行適當(dāng)?shù)南♂?,信號正常組同前,引物配置完成后,將信號過強組再進行倍比稀釋。根據(jù)調(diào)整過后RT引物配置RT反應(yīng)試劑,反應(yīng)條件如方法1.2.4;配置XP-PCR反應(yīng)試劑,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如1.2.4。GeXP上樣,運行樣本。

        1.2.6 RT引物濃度確認 引物濃度優(yōu)化之后,根據(jù)調(diào)整過后RT引物配置RT反應(yīng)試劑,反應(yīng)條件如1.2.4;配置XP-PCR反應(yīng)試劑,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻[3]。GeXP上樣,運行樣本。確定最終引物濃度。

        1.2.7 樣品檢測 處理樣品,使其濃度為10 ng/ml,根據(jù)之前所確認的引物濃度配置RT與XP-PCR反應(yīng)體系,上機檢測。

        2 結(jié)果

        2.1 GeXP檢測陰性組A549/DDP細胞凋亡相關(guān)基因表達水平變化 取對數(shù)生長期的A549/DDP細胞提取RNA,經(jīng)GeXP檢測Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb等基因,結(jié)果見圖1。

        2.2 GeXP檢測rhIL-24及聯(lián)合組作用A549/DDP后凋亡相關(guān)基因表達水平變化 將rhIL-24干預(yù)對數(shù)生長期的A549/DDP細胞,提取RNA,經(jīng)GeXP檢測Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb等基因,結(jié)果見圖2。

        2.3 GeXP檢測聯(lián)合組作用A549/DDP后凋亡相關(guān)基因表達水平變化 將rhIL-24聯(lián)合DDP干預(yù)對數(shù)生長期的A549/DDP細胞,提取RNA,經(jīng)GeXP檢測Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase3、P53、Rb等基因,結(jié)果見圖3。

        圖1 陰性組凋亡相關(guān)基因變化峰圖Fig.1 Apoptosis related gene changes of negative groupNote: 1.Bcl-2;2.Survivn;3.B2M;4.Rb;5.Caspase3;6.ACTB;7.Bax;8.ESD;9.YAP1;10.P53;11.TBP.

        圖2 rhIL-24組凋亡相關(guān)基因變化峰圖Fig.2 Apoptosis related gene changes of rhIL-24 groupNote: 1.Bcl-2;2.Survivn;3.B2M;4.Rb;5.Caspase3;6.ACTB;7.Bax;8.ESD;9.YAP1;10.P53;11.TBP.

        圖3 聯(lián)合組凋亡相關(guān)基因變化峰圖Fig.3 Apoptosis related gene changes of joint groupNote: 1.Bcl-2;2.Survivn;3.B2M ;4.Rb;5.Caspase3;6.ACTB;7.Bax;8.ESD;9.YAP1;10.P53;11.TBP.

        圖4 各組凋亡相關(guān)基因的分析Fig.4 Analysis of apoptosis related genes in each groupNote: A.Bcl-2 gene;B.Bax gene;C.Caspase3 gene;D.Survivin gene;E.Rb gene;F.P53 gene;*.P<0.05 compared with negative group,#.P<0.05 compared with rhIL-24 group.

        2.4 GeXP檢測各組作用A549/DDP后凋亡相關(guān)基因表達水平變化 將rhIL-24干預(yù)A549/DDP細胞24 h后經(jīng)GeXP檢測,結(jié)果顯示與陰性組相比引起rhIL-24組Bax基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),Survivin基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),Caspase3基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),抑癌基因Rb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),但引起抑癌基因P53基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)。聯(lián)合組作用A549/DDP細胞后與陰性組相比引起B(yǎng)ax基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào), Survivin基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),Caspase3基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),抑癌基因Rb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),聯(lián)合組抑癌基因P53與陰性組比較無明顯變化。聯(lián)合組作用A549/DDP細胞后與rhIL-24組相比Bax基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)明顯,Survivin基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)明顯,Rb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)明顯。結(jié)果見圖4。

        3 討論

        肺癌是全世界癌癥導(dǎo)致死亡的首位原因[4],化療在肺癌的治療中占有重要的地位,順鉑作為肺癌化療的一線藥物由于其嚴重的副作用以及耐藥性限制了其應(yīng)用。IL-24屬于IL-10家族成員[5],作為一種新型的細胞因子,研究發(fā)現(xiàn)其對肝癌、結(jié)腸癌、食管癌、神經(jīng)母細胞瘤等多種腫瘤都有抑制作用[6-9],而對正常細胞無毒副作用[10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)IL-24可以抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的生長,誘導(dǎo)其凋亡,聯(lián)合DDP后抑制效果更加明顯,為IL-24單獨或者聯(lián)合化療應(yīng)用于肺癌的治療,從而減小化療藥物的用量,降低化療藥物所帶來的副作用提供了實驗基礎(chǔ)。rhIL-24抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的生長,誘導(dǎo)其凋亡可能存在何種機制?為了解決這個問題,我們選取了在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的6個凋亡相關(guān)基因,經(jīng)干預(yù)后利用多基因遺傳表達分析系統(tǒng)分析凋亡相關(guān)基因的變化,探索IL-24的作用機制。

        Bcl-2是多基因家族,包括抗凋亡基因如Bcl-2、BAD等,促凋亡基因如Bax、Bak等。它們與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系, Bcl-2/Bax 的比值與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[11],比值越低凋亡抑制作用越明顯。其促進細胞凋亡的機制為Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜,它與促凋亡蛋白Bax相互拮抗,細胞受到凋亡誘導(dǎo)后,促凋亡蛋白由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)向線粒體形成跨膜通道,細胞色素C 自線粒體釋放至胞質(zhì),使Caspase 蛋白酶激活,從而導(dǎo)致細胞凋亡。研究顯示利用姜黃素干預(yù)肺癌細胞后,Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),Bax基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)[12],這表明Bcl-2與Bax轉(zhuǎn)錄水平的變化與肺癌有關(guān)聯(lián)。經(jīng)GeXP系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),rhIL-24蛋白可引起A549細胞的Bax基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),Bcl-2/Bax 的比值降低,Bcl-2/Bax比值rhIL-24組較陰性組降低,聯(lián)合組用藥后Bcl-2/Bax比值較陰性組降低,說明IL-24誘導(dǎo)人肺腺癌耐順鉑細胞株的凋亡與 Bcl-2基因家族有關(guān)。

        Survivin是凋亡抑制基因家族的新成員,Survivin具有腫瘤特異性,只表達于腫瘤和胚胎組織,Caspase3在細胞凋亡中起著不可替代的作用,為參與細胞凋亡執(zhí)行基因之一,是細胞凋亡的執(zhí)行者,被激活的執(zhí)行者Caspase3通過對Caspase靶蛋白的水解,促進細胞的凋亡。Survivin可直接作用Caspase,抑制Caspase3的活性,從而抑制腫瘤細胞凋亡,研究表明Survivin基因多態(tài)與肺癌的易感性有密切關(guān)系[13]。有研究顯示Caspase3在肺癌的發(fā)生發(fā)展中重要作用[14]。本研究經(jīng)多基因遺傳表達分析系統(tǒng)檢測后顯示單獨用rhIL-24組與聯(lián)合組Caspase3基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),Survivin基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),Caspase3基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)水平及Survivin的下調(diào)水平較陰性組有顯著性差異, 此結(jié)果說明IL-24可以通過下調(diào)凋亡抑制基因Survivin,降低其對Caspase3活性的抑制,從而促進人肺腺癌耐順鉑細胞株的凋亡。

        Rb (Retinoblastoma,Rb)基因即成視網(wǎng)膜細胞瘤基因,屬于抑癌基因的一種。Rb基因定位于chr13q上,而chr13q染色體區(qū)抑癌基因的丟失或失活與肺癌的發(fā)生有密切關(guān)系,Rb基因?qū)毎L控制能力的喪失可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,Liu等[15]用腺病毒介導(dǎo)的Rb基因治療小鼠非小細胞肺癌移植模型,腫瘤得到了改善。經(jīng)多基因遺傳表達分析系統(tǒng)檢測后顯示單獨用rhIL-24組與聯(lián)合組抑癌基因Rb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),其上調(diào)水平較陰性組有顯著性差異,且Rb基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)水平聯(lián)合組與單獨用rhIL-24組比較存在顯著性差異。IL-24可以通過上調(diào)抑癌基因Rb表達水平,增強Rb基因?qū)毎纳L控制能力,從而抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株的生長。且聯(lián)合DDP后,Rb表達水平更高。

        野生型P53為腫瘤抑制基因,其抑制腫瘤的生長,p53基因的失活對腫瘤的形成起重要作用。Kawabe等[16]將表達p53基因與不表達P53基因的兩種肺癌細胞進行Ad-IL-24聯(lián)合放療干預(yù),結(jié)果顯示IL-24都可以增強兩種細胞株的放療敏感性[16]。另有研究將不同肝癌細胞系轉(zhuǎn)入IL-24基因,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)IL-24抑制肝細胞的生長,誘導(dǎo)凋亡并不依賴于P53基因的狀態(tài),本實驗中抑癌基因P53轉(zhuǎn)錄無規(guī)律與上述結(jié)果一致[17]。

        綜上所述,rhIL-24可抑制人肺腺癌耐順鉑細胞A549/DDP細胞的生長,誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡,其凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化是其凋亡抑制效應(yīng)的重要機制之一,rhIL-24聯(lián)合DDP后效應(yīng)更加明顯,為肺癌的新型生物治療策略提供了理論和實驗依據(jù)。

        [1] 郭錦錦,王少慧,孫萬邦,等.重組人IL-24對人肺腺癌A549/DDP細胞增殖活性的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2014,30(9):1178-1181.

        [2] 王少慧,郭錦錦,孫萬邦,等.多基因遺傳表達分析系統(tǒng)檢測rhIL-24誘導(dǎo)人卵巢癌細胞凋亡相關(guān)基因的應(yīng)用[J].中國免疫學(xué)雜志,2013,29(12):1312-1316.

        [3] 郭錦錦,王少慧,孫萬邦,等.Genomelab TMGeXP檢測rhIL-24聯(lián)合順鉑對肺癌細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2017,33(1):44-47.

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        [收稿2016-07-07 修回2016-09-23]

        (編輯 倪 鵬)

        Effect of rhIL-24 combined with DDP on expression of apoptosis-related genes in human lung adenocarcinoma A549/DDP cells using GeXP

        GUOJin-Jin,WANGShao-Hui,SUNWan-Bang,SONGMing-Ying,TANGYan-Li.

        ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege&ImmunologicalGraduateEducationInnovationBastofGuizhouProvince,Zhuhai519041,China

        Objective:To investigate the change of apoptosis-associated genes in human lung adenocarcinoma cell lines A549/DDP cells,which were induced by the recombinant human interleukin-24(rhIL-24) combined with Cisplatin (DDP).Methods: Six genes expression level by GeXP genetic analysis system at the same time,after rhIL-24,DDP and rhIL-24+DDP were used to intervene in A549/DDP cells.Results: rhIL-24 could induce Bax gene,Caspase3 gene and Rb gene transcription up regulation;Bcl-2 gene and survivin gene transcription down regulation.But no regular change in the genes expression level of P53.Bax,Survivin and Rb were more obviously changed after rhIL-24 combined with DDP.Conclusion: RhIL-24 can induce apoptosis of A549/DDP cells through upregulated the genes expression level of Bax,Caspase3,Rb and down regulated of Bcl-2,Survivin.

        GeXP analysis system;Interleukin-24;Lung adenocarcinoma cell;Apoptosis

        10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.005

        郭錦錦(1986年-),女,碩士,實驗師,主要從事腫瘤免疫研究, E-mail:guojin1986719@163.com。

        及指導(dǎo)教師:孫萬邦(1950年-),男,教授,主要從事分子免疫學(xué)研究,E-mail:sunwb7224@sina.com。

        R392.5 R392.11

        A

        1000-484X(2017)02-0186-04

        ①本文為遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動資金項目(F-719)。

        ②廣州白云區(qū)人民醫(yī)院,廣州510545。

        ③深圳龍崗區(qū)婦幼保健院,深圳518172。

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