姬會春 劉軍權(quán) 周 燏 李 昳 陳復興 費素娟

(宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷223800)

阿托伐他汀對人 NK細胞殺傷結(jié)腸癌細胞的影響及其機制研究①

姬會春 劉軍權(quán)②周 燏②李 昳②陳復興②費素娟③

(宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷223800)

目的：探討阿托伐他汀對人NK細胞殺傷結(jié)腸癌細胞的影響及其機制。方法：不同濃度的阿托伐他汀作用于3株結(jié)腸癌細胞(HCT-116、SW-480、Caco-2)，CCK-8法測定阿托伐他汀對結(jié)腸癌細胞生長抑制率的影響。SCGM培養(yǎng)基體外擴增人NK細胞，自動生化分析儀測定NK細胞對3株結(jié)腸癌細胞的殺傷活性；流式細胞儀檢測結(jié)腸癌細胞MICA/B的表達率。結(jié)果：(1)NK細胞的培養(yǎng)：培養(yǎng)前CD3-CD56+的NK細胞占外周血單個核細胞的比例為4.5%，培養(yǎng)10 d時NK細胞的比例增至93.1%。(2)阿托伐他汀對3株結(jié)腸癌細胞生長抑制率的影響：阿托伐他汀作用48 h后，在濃度5～40 μmol/L的4個實驗組中，HCT-116細胞的生長抑制率較對照組升高(P<0.05)。作用96 h后，在1.25～40 μmol/L的所有濃度組(6個)中，HCT-116細胞的生長抑制率均顯著高于對照組(P<0.05)。另外， HCT-116細胞的生長抑制率隨著阿托伐他汀濃度的升高而逐漸上升，相關(guān)分析顯示，阿托伐他汀的濃度與HCT-116細胞的生長抑制率呈正相關(guān)(r[48 h]=0.13，r[96 h]=0.22，P<0.05)。(3)NK細胞經(jīng)阿托伐他汀作用96 h后，除濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時抑制率高于對照組，其他各組對NK細胞生長無明顯影響。(4)阿托伐他汀對NK細胞殺傷結(jié)腸癌細胞活性的影響：NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性在阿托伐他汀濃度2.5～10 μmol/L組均顯著高于對照組，對SW-480的殺傷活性在5～20 μmol/L組較對照組明顯升高，對Caco-2的殺傷活性在2.5～20 μmol/L組顯著高于對照組(P<0.05)，其中同一濃度時對HCT-116細胞殺傷作用最強。(5)阿托伐他汀對結(jié)腸癌細胞MICA/B表達的影響：在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組，HCT-116細胞MICA/B的表達率與對照組比較顯著升高(P<0.05)，在10 μmol/L及20 μmol/L組，SW-480細胞MICA/B表達率顯著高于對照組(P<0.05)，在2.5～40 μmol/L 組，Caco-2細胞MICA/B的表達率均較對照組顯著升高(P<0.05)。 結(jié)論：(1)阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細胞HCT-116、SW-480 及Caco-2的生長；(2)阿托伐他汀能夠增強NK細胞對結(jié)腸癌細胞的殺傷活性，可能與阿托伐他汀上調(diào)結(jié)腸癌細胞MICA/B的表達有關(guān)；(3)阿托伐他汀可以上調(diào)3株結(jié)腸癌細胞MICA/B的表達率，提高結(jié)腸癌細胞的免疫原性。

阿托伐他?。唤Y(jié)腸癌細胞；NK細胞；MICA/B

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，居我國惡性腫瘤發(fā)病率第五位，男性發(fā)病率的第五位，女性的第三位[1]。全球每年約有50萬患者死于結(jié)腸癌[2]。臨床上確診時大都已經(jīng)發(fā)展為中晚期，錯過了最佳手術(shù)期，其預后差、病死率高。結(jié)腸癌的非手術(shù)治療越來越受到業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注。 他汀類藥物是臨床常用的降血脂藥物。近年來有研究表明，他汀類藥物具有抗腫瘤作用[3]，阿托伐他汀為人工合成的他汀類降血脂藥物。自然殺傷(Natural killer，NK)細胞是人體第一道免疫防線的重要組成部分，有強大的抗腫瘤、抗感染及清除非己細胞等作用[4]。臨床上NK細胞過繼免疫治療多種腫瘤已取得了一些療效。但其臨床抗腫瘤的療效一直未能得到大幅度的提高，如何增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性是提高NK細胞抗腫瘤療效的關(guān)鍵。目前尚沒有阿托伐他汀與NK細胞聯(lián)合應用進行抗腫瘤研究的報道。本文擬探討阿托伐他汀對NK細胞殺傷結(jié)腸癌細胞的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)；人結(jié)腸癌細胞株HCT-116(低分化腺癌)、SW-480(低分化腺癌)和Caco-2(人克隆結(jié)腸腺癌細胞)(中科院上海細胞所)；無血清培養(yǎng)基和NK細胞培養(yǎng)基(浙江博納生物科技有限公司產(chǎn)品)；PE標記MICA/B(美國BD公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；PE標記的CD3、FITC標記的CD56(美國BD公司)；ST-360酶標儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司)；Encore自動生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司)；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 NK細胞的培養(yǎng)和鑒定 使用淋巴細胞分離液常規(guī)分離健康個體外周血獲得單個核細胞，PBS洗滌2次，將細胞加入含有rhIL-2 和人AB血漿的NK培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)10 d的NK細胞，PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1×107ml-1。取100 μl細胞懸液，分別加入 FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌并重懸細胞，F(xiàn)CM進行表型檢測。

1.2.2 CCK-8測阿托伐他汀對結(jié)腸癌細胞生長的影響 為了篩選出阿托伐他汀對結(jié)腸癌細胞(HCT-116、SW-480和Caco-2細胞)抑制最佳藥物濃度和作用時間。收集對數(shù)生長期的HCT-116細胞，PBS洗滌3次，使用含10%小牛血清的McCoy′S5A培養(yǎng)基將細胞配成1×104ml-1的細胞懸液；SW-480和Caco-2細胞按同樣的方法收集，并置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，配成1×104ml-1的細胞懸液。3株細胞分別加入96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的阿托伐他汀(終濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，同時設(shè)DMSO溶劑對照組，每組設(shè)3個復孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72和92 h每孔加入CCK-8 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕搖勻，于酶標儀450 nm波長處測OD值。按下列公式計算結(jié)腸癌細胞的生長抑制率。生長抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 阿托伐他汀誘導NK細胞的方法 收集培養(yǎng)10 d的NK細胞，PBS洗滌3次，用NK細胞培養(yǎng)基將細胞配成1×105ml-1的細胞懸液，加入96孔板，200 μl/孔。然后加入終濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的阿托伐他汀，同時設(shè)DMSO溶劑對照組，每組設(shè)5個復孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72和92 h每孔加入CCK-8 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕搖勻，于酶標儀450 nm波長處測OD值。按下列公式計算NK細胞生長抑制率：生長抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4 LDH釋放法檢測NK細胞對結(jié)腸癌細胞殺傷活性 將復蘇后的結(jié)腸癌細胞HCT-116、SW-480和Caco-2體外傳代培養(yǎng)，對數(shù)生長期時分別給予胰酶消化，收集3株結(jié)腸癌細胞，洗滌3次，使用相應的培養(yǎng)基將細胞配成5×105ml-1的細胞懸液，加入6孔細胞培養(yǎng)板。分別將不同濃度的阿托伐他汀(終濃度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)加入細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集培養(yǎng)第48小時結(jié)腸癌細胞，將細胞密度調(diào)整為2×105ml-1，作為靶細胞。以培養(yǎng)10 d后的NK 細胞為效應細胞，調(diào)整細胞密度為2×106ml-1，按效靶比10∶1接種于試管中。同時設(shè)效應細胞自然釋放組、靶細胞自然釋放組、靶細胞最大釋放組，置 37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，1 000 r/min離心5 min，吸取上清液，自動生化分析儀測LDH值。按下列公式計算NK細胞的殺傷活性。NK細胞的殺傷活性 =(實驗組LDH值-效應細胞自然釋放組LDH值)/(靶細胞最大釋放組LDH值-靶細胞自然釋放組LDH值)×100%。

1.2.5 結(jié)腸癌細胞MICA/B表達的檢測 分別收集3株結(jié)腸癌細胞，調(diào)整細胞密度為5×105ml-1，以每孔5 ml接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的阿托伐他汀(終濃度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS洗滌，細胞密度調(diào)至1×107ml-1，取細胞懸液100 μl，加入PE-MICA/B 20 μl，室溫避光孵育15 min，同時設(shè)同型IgG1對照。PBS洗滌并重懸細胞，F(xiàn)CM檢測MICA/B的表達。

2 結(jié)果

2.1 NK細胞的鑒定 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)前血CD3-CD56+的NK細胞占外周血單個核細胞的比例為4.5%。培養(yǎng)10 d時NK細胞的比例增至93.1%，符合實驗要求，見圖1。

2.2 不同濃度的阿托伐他汀對3株結(jié)腸癌細胞生長的影響

2.2.1 阿托伐他汀對HCT-116細胞生長的影響 由表1、圖2可見，不同濃度的阿托伐他汀作用24、48、72和96 h時，結(jié)腸癌細胞HCT-116(低分化腺癌)的生長抑制率均較對照組升高，統(tǒng)計分析顯示，作用48 h后，阿托伐他汀濃度5～40 μmol/L的4個實驗組中，HCT-116細胞的生長抑制率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。作用96 h后，阿托伐他汀1.25～40 μmol/L的所有濃度組(6個)中，HCT-116細胞的生長抑制率均顯著高于對照組(P<0.05)。另外， HCT-116細胞的生長抑制率隨著阿托伐他汀濃度的升高而逐漸上升，相關(guān)分析顯示，阿托伐他汀的濃度與HCT-116細胞的生長抑制率呈正相關(guān)(r[48 h]=0.13，r[96 h]=0.22，P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時，HCT-116細胞的生長抑制率在24 h和48 h組與72 h和96 h組之間比較，除1.25、2.5和5 μmol/L組外，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示，阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制HCT-116細胞的生長，且延長作用時間可以增強阿托伐他汀對HCT-116細胞生長的抑制作用。其他結(jié)果見表1。

2.2.2 阿托伐他汀對SW-480細胞生長的影響 阿托伐他汀作用24 h和48 h后，濃度1.25～40 μmol/LNote：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.的6個濃度組中，結(jié)腸癌細胞SW-480(低分化腺癌)的生長抑制率均顯著高于對照組，統(tǒng)計分析差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；作用72 h和96 h后，阿托伐他汀濃度2.5～40 μmol/L的5個濃度組中，SW-480細胞的生長抑制率均較對照組顯著升高(P<0.05)。另外，隨著阿托伐他汀濃度的增高，SW-480細胞的生長抑制率逐漸升高，相關(guān)分析結(jié)果顯示，SW-480的生長抑制率與阿托伐他汀濃度呈正相關(guān)(r[48 h]=0.16，r[96 h]=0.19，P<0.05)，阿托伐他汀濃度相同時，較高濃度組(10～40 μmol/L)中，SW-480細胞的生長抑制率在96 h組顯著高于24 h和48 h 組(P<0.05)。上述結(jié)果提示阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細胞SW-480的生長，且較高濃度時延長作用時間能夠提高阿托伐他汀對SW-480細胞的生長抑制作用，見表2、圖3。

圖1 NK細胞的鑒定(FCM檢測)Fig.1 FCM results of NK cells cultured before and after 10 days

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)InhibitionrateofHCT?116cells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125120±008208±018635±0441)2)836±0181)2)25130±009160±015745±0541)2)961±0201)2)5279±011379±0381)812±0591)2)851±0281)2)10312±012352±0341)999±0761)2)1158±0441)2)20595±0341)726±0141)1473±1211)2)1912±1251)2)401256±1221)2168±1401)4126±3121)2)4546±1961)2)

2.2.3 阿托伐他汀對Caco-2細胞生長的影響 阿托伐他汀作用24、48、72和96 h時后，濃度1.25～40 μmol/L的6組中，結(jié)腸癌細胞Caco-2(人克隆腺癌細胞)的生長抑制率均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而且，Caco-2細胞的生長抑制率隨阿托伐他汀濃度增加而逐漸升高，相關(guān)分析顯示，兩者呈正相關(guān)(r[48 h]=0.20，r[96 h]=0.23，P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時，除40 μmol/L 組外，Caco-2細胞的生長抑制率在48 h組與72 h和96 h組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結(jié)果證實，阿托伐他汀能夠有效抑制結(jié)腸癌細胞Caco-2的生長，且呈劑量依賴性，但延長作用時間并不能提高阿伐他汀對Caco-2細胞生長的抑制作用。其他結(jié)果見表3、圖4。

圖2 阿托伐他汀對HCT-116細胞生長的影響Fig.2 Effect of different concentrations of atorvastatin on HCT-116 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Inhibitionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125423±0351030±0781)823±0531)311±03225733±0561)1525±1221)1026±0981)583±0401)51218±1141)2431±1941)1836±1321)2491±2101)101631±1121)2212±1961)2598±1971)3631±3921)2)202247±1191)2651±2111)3265±2361)2)3941±1671)2)402636±1291)3173±2231)4023±3381)2)4523±3771)2)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.

2.3 不同濃度的阿托伐他汀對NK細胞生長的影響 NK細胞經(jīng)不同濃度的阿托伐他汀作用24～96 h后，除誘導96 h濃度為20 μmol/L和40 μmol/L 兩組對NK細胞抑制率高于對照組外(差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05)，其他各組阿托伐他汀對NK細胞生長均無明顯影響，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖5。

圖3 阿托伐他汀對SW-480細胞生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of atorvastatin on SW-480 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Inhibitionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125325±024405±015423±031436±02525957±0431)1331±1051)915±0641)772±0371)51639±1291)2495±1991)2036±1981)2163±1911)102037±1911)2372±2271)2145±1731)2398±2391)202378±1871)2928±2641)2948±2571)3359±2851)402967±2061)3307±2891)3649±3121)4418±3541)2)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.

2.4 阿托伐他汀對NK細胞殺傷結(jié)腸癌細胞活性的影響 從表5、圖6可見，NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性在阿托伐他汀2.5～10 μmol/L的3個濃度組中均顯著高于對照組(P<0.05)，對SW-480的殺傷活性在5～20 μmol/L的3個濃度組較對照組顯著升高(P<0.05)，而對Caco-2的殺傷活性在2.5～20 μmol/L的4個濃度組中均顯著升高(P<0.05)。另外，在阿托伐他汀2.5 μmol/L及5 μmol/L 的2個濃度組中，NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性均顯著高于對SW-480及Caco-2的殺傷活性(P<0.05)，其中，濃度5 μmol/L時NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性最高，濃度為10 μmol/L時NK細胞對SW-480、 Caco-2殺傷活性最強。以上結(jié)果提示阿托伐他汀能夠提高NK細胞對3株結(jié)腸癌細胞的殺傷活性，但對3株結(jié)腸癌細胞的作用存在差異，其中對HCT-116細胞的作用最強。

2.5 阿托伐他汀對3株結(jié)腸癌細胞MICA/B表達的影響 不同濃度的阿托伐他汀對3株結(jié)腸癌細胞MICA/B表達的影響存在差異，在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組，HCT-116細胞MICA/B的表達率與對照組比較顯著升高(P<0.05)，其中2.5 μmol/L組HCT-116細胞MICA/B表達率最高。

圖4 阿托伐他汀對Caco-2細胞生長的影響Fig.4 Effect of different concentrations of atorvastatin on Caco-2 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Reproductionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125008±001015±002018±002051±00825031±003045±005098±007073±0075054±006067±007064±005004±00510001±001007±001-091±009-101±04220-047±007-089±009-106±018-267±0381)40-054±011-119±027-214±0411)-278±0361)

Note：1)P<0.05 compared with the control group.

圖5 經(jīng)阿托他汀誘導96 h后的NK細胞生長情況Fig.5 Effect of after 96 h induced by atorvastatin on NK cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)KillingactivityofNKcellsHCT?116SW?480Caco?20(Controlgroup)4023±2343071±2743282±230255932±3901)2)3452±4424023±2771)56230±2461)2)3846±1901)4673±3321)105042±5641)4461±2351)4983±2501)204532±2393672±1271)4214±3981)403943±5463344±3253545±162

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the SW-480,Caco-2,2)P<0.05.

圖6 阿托伐他汀對NK細胞殺傷結(jié)腸癌細胞活性的影響Fig.6 Killing activity of NK cells to colon cancer cell which cultured with atorvastatinNote: *.P<0.05 compared with the control group;△.P<0.05 compared with the SW-480,Caco-2.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)ColoncancercellsMICA/Bexpressionrate(%)HCT?116SW?480Caco?20(Controlgroup)5129±280342±0582042±209257098±2101)400±0502891±1691)56487±3271)396±0293502±4131)105540±3831722±2441)4855±4421)204242±4471430±2411)4900±3231)402719±2781)430±0764036±2261)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

圖7 不同濃度的阿托伐他汀對結(jié)腸癌細胞MICA/B表達的影響Fig.7 Effect of different concentrations of atorvastatin on colon cancer cells MICA/B expression rateNote: *.P<0.05 compared with the control group.

SW-480細胞MICA/B表達率在阿托伐他汀10 μmol/L及20 μmol/L組顯著高于對照組(P<0.05)。在阿托伐他汀2.5～40 μmol/L的5個濃度組中，Caco-2細胞MICA/B的表達率均較對照組顯著升高(P<0.05)。其中，阿托伐他汀濃度10 μmol/L組 SW-480細胞的MICA/B表達率最高，20 μmol/L組Caco-2細胞的MICA/B表達率最高(見表6、圖7)。本組實驗結(jié)果證實，適宜濃度的阿托伐他汀可以上調(diào)3株結(jié)腸癌細胞MICA/B的表達率，提高結(jié)腸癌細胞的免疫原性。

3 討論

近年來，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展、人們生活習慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變及環(huán)境污染等，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，新發(fā)病例以每年4%的速度增長，每年新發(fā)病例超過17萬，現(xiàn)已成為我國發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一[5,6]， 且發(fā)病年齡越來越年輕化，病程較為漫長，反復發(fā)作，給患者帶來了極大的痛苦，嚴重威脅國人的健康。 根據(jù)目前結(jié)腸癌的發(fā)病形勢，傳統(tǒng)的手術(shù)治療仍然是治療結(jié)腸癌的主要手段，但因發(fā)現(xiàn)時機較晚，許多患者已經(jīng)失去手術(shù)治療的意義。而放化療副作用大，患者耐受力差，也限制了該治療方式的廣泛應用。積極尋找新的有效低毒的治療結(jié)腸癌的藥物具有重要的臨床意義。目前結(jié)腸癌的發(fā)病原因尚不明確，最近有報道表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，可能為自身免疫性疾病，細胞免疫與實體腫瘤的抗腫瘤機制有關(guān)[7]?，F(xiàn)在有越來越多臨床工作者正在研究利用藥物增強免疫細胞的抗腫瘤功能來達到腫瘤治療的目的。

他汀類藥物作為臨床常用的降血脂藥物已被廣泛用于治療心血管疾病，隨著對該類藥物研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有抗腫瘤作用，且已經(jīng)受到越來越多的學者關(guān)注。 他汀類藥物可通過抑制HMG-CoA還原酶阻斷膽固醇的合成，甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)是膽固醇合成的中間產(chǎn)物，可參與細胞生長和分化過程中所必需的GTP酶的戊烯化。多項研究表明他汀類藥物的抗腫瘤可能與以下機制有關(guān)：(1)他汀類藥物可通過阻斷MVA合成途徑影響細胞周期，使腫瘤細胞停滯于G0-G1期或G1-S期，從而抑制腫瘤細胞的增殖[8,9]。(2)他汀類藥物還可通過抑制基因轉(zhuǎn)錄后的異戊二烯化而抑制細胞生長，且MVA能夠逆轉(zhuǎn)上述作用，推測異戊二烯代謝物具有調(diào)節(jié)細胞增殖的作用[10]。(3)Ras突變是腫瘤發(fā)生過程中經(jīng)常發(fā)生的事件，他汀類藥物可以抑制Ras蛋白翻譯后修飾，干擾Ras活化，阻滯Ras信號傳導，從而抑制細胞的增殖，并誘導細胞分化或凋亡。Park等[11]報道，洛伐他汀能夠通過抑制Ras蛋白異戊二烯化抑制非小細胞肺癌細胞增殖。(4)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是細胞凋亡中起重要作用的一類蛋白水解酶，Caspase活化與凋亡的啟動有關(guān)，Bcl-2則可阻礙細胞的凋亡過程。 Cho等[12]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可上調(diào)Caspase-3蛋白表達，下調(diào)Bcl-2表達，誘導HCT-116細胞的凋亡，且可明顯抑制小鼠結(jié)腸癌移植瘤的生長。本實驗中應用不同濃度的阿托伐他汀作用于HCT-116、SW-480和Caco-2結(jié)腸癌細胞，結(jié)果顯示隨著阿托伐他汀濃度的升高，對結(jié)腸癌細胞的生長抑制作用逐漸增強，相關(guān)分析結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)，證實阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細胞的生長。

NK細胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對靶細胞的識別無主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)限制性，NK細胞表面NKG2D可與細胞表面的模型MICA結(jié)合，通過NKG2D-MICA系統(tǒng)同時參與調(diào)節(jié)固有性免疫應答和適應性免疫應答，發(fā)揮殺傷效應， 這種調(diào)節(jié)機制在腫瘤免疫、自身免疫及抗感染免疫等領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注[13,14]。腫瘤細胞表達的MICA分子與NK細胞表面的NKG2D交聯(lián)，可以促使NK細胞活化并產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶裂解靶細胞,從而提高NK細胞對腫瘤的殺傷活性[15]。細胞在腫瘤的微環(huán)境或受病毒感染以后NKG2D表達可上調(diào)[16-18]， Pende等[19,20]研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞對高表達MICA的腫瘤細胞殺傷活性明顯高于低表達者或者陰性者，殺傷活性增強的機理可能與腫瘤細胞MICA等配體的表達上調(diào)誘導NK細胞的活化有關(guān)。本實驗應用不同濃度阿托伐他汀作用48 h后的HCT-116、SW-480和Caco-2細胞與NK細胞配置成10∶1效靶比，發(fā)現(xiàn)NK細胞對HCT-116細胞的殺傷活性在阿托伐他汀5～10 μmol/L時顯著高于對照組，對SW-480的殺傷活性在阿托伐他汀濃度5～20 μmol/L時較對照組顯著升高，而對Caco-2的殺傷活性在阿托伐他汀2.5～20 μmol/L的4個濃度組中均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。證實阿托伐他汀可增強NK細胞對結(jié)腸癌細胞殺傷活性， 另外，實驗結(jié)果顯示阿托伐他汀能上調(diào)上述3株結(jié)腸癌細胞MICA/B的表達，推測阿托伐他汀提高結(jié)腸癌細胞表面活化型受體NKG2D的配體MICA/B表達可能與NK細胞的殺傷活性升高有關(guān)。

MHCⅠ類相關(guān)基因A( Major histocompatibility complex class Ⅰ chain related gene A,MICA) 是位于HLA-B 位點上游約46 kb的基因，具有豐富的多態(tài)性[21]，目前報道有85種MICA等位基因， 其編碼產(chǎn)物介導細胞應激時的信號轉(zhuǎn)導，該分子在正常細胞和組織中不表達， 但癌變、感染或應激狀態(tài)可上調(diào)其表達,MICA具有免疫原性，是一種腫瘤相關(guān)性抗原[22]。 Li等[23]運用免疫組化檢測82例卵巢癌患者腫瘤組織MICA/B表達，結(jié)果表明腫瘤組織中MICA/B表達率高達97.6 %, 而正常組織基本不表達。而Watson等[24]研究結(jié)果顯示 結(jié)直腸癌MICA高表達可作為結(jié)直腸癌預后良好的指標之一。本實驗資料顯示不同濃度阿托伐他汀作用于結(jié)腸癌細胞48 h后，在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組，HCT-116細胞MICA/B的表達率與對照組比較顯著升高，SW-480細胞MICA/B表達率在阿托伐他汀10 μmol/L及20 μmol/L組顯著高于對照組，而在2.5～40 μmol/L的5個濃度組均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證實阿托伐他汀可以上調(diào)結(jié)腸癌細胞MICA/B的表達，增強其免疫原性，有利于NK細胞表面NKG2D受體的識別，提高NK細胞的殺傷活性。

本研究證實阿托伐他汀能抑制腫瘤細胞的增殖，相同藥物濃度對NK細胞的生長無明顯影響。阿托伐他汀能上調(diào)HCT-116、SW-480和Caco-2表達MICA/B，增強NKG2D受體識別MICA/B的能力，從而達到增強NK細胞殺傷腫瘤細胞的敏感性。為藥物與NK細胞聯(lián)合抗腫瘤提供了新的實驗依據(jù)，但本實驗中及一些其他研究均表明存在著藥物劑量的依賴性，如何找到一種安全合適的劑量進行抗腫瘤治療是后來者需要解決的問題。另既往相關(guān)研究及本實驗均為體外實驗，體內(nèi)是否能達到同樣的效果，有待進一步的研究。

[1] 陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅,等.2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2015,24(1):1-10.

[2] Merika E,Saif MW,Katz A,etal.Review colon cancer vaccines:an update[J].In Vivo,2010,24(5)：607-628.

[3] 趙心彬,倪 敏,陶 霞.他汀類藥物多效藥理作用及其機制研究進展[J].藥學實踐雜志,2013,31(1):19-21.

[4] Kim R,Emi M,Tanabe K.Cancer immunoedifing from immune surveillance to immune escape[J]. Immunology,2007,121(1):1-14.

[5] Shaukat A,Mongin SJ,Geisser MS,etal.Longterm mortality after screening for colorectal cancer[J].N Engl J Med,2013,369(12)：1106-1114.

[6] Siegel R，Naishadham D,Jemal A．Cancer Statistics 2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1)：10-29.

[7] Barbera GE,Nelson MB,Barr B,etal.B lymphocyte pathology in human colorectal cancer,experimental and clinical therapeutic effects of partial B cell depletion[J].Cancer Immunol Immunother,2000,48(10):541-549.

[8] Dai Y,Khanna P,Chen S,etal.Statins synergistically potentiate 7-hydroxystaurospofine(UCN-01) lethality in human leukemia and myeloma cells by disrupting Ras faruesylation and activation[J].Blood,2007,109(10)：4415-4423.

[9] Zhong WB,Hsu SP,Ho PY,etal.Lovastatin inhibits proliferation of anaplastie thyroid cancer cells through up-regulation of p27 by interfeting with the Rho/ROCK-mediated pathway[J].Biochem Pharmacol,2011,82(11)：1663-1672.

[10] 蘇克莉,尹林林,李 靜.他汀類藥物抗腫瘤作用機制[J].國際腫瘤學雜志,2013,40(5)：342-344.

[11] Park IH,Kim JY,Jung JI.Lovastatin overcomes gefitinib resistance in human non-small cell lung canecr cells with K.Ras mutations[J].Invest New Drugs,2010,28(6)：791-799.

[12] Cho SJ,Kim JS,Kim JM,etal.Simvastafin induces apoptasis in human colon cancer cells and in tumor xenografts and attenuates colitis-associated colon cancer in mice[J].Int J Cancer,2008,123(4)：95l-957.

[13] Kim R,Emi M,Tanabe K.Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape[J].In Vivo,2010,24(5)：607-628.

[14] Eleme K,Taner SB,Onefelt B,etal.Cell surface organization of stress-inducible proteins MLBP and MICA that stimulate human NK cells and T cells via NKG2D[J].J Exp Med，2004，199(7)：1005-1010.

[15] Zwirner NW,Fuertes MB,Girart MV,etal.Cytokine-driven regμlation of NK cell functions in tumor immunity ： Role of the MICA-NKG2D system[J].Cytokine Growth Factor Rev,2007,18(1-2)：159-170.

[16] Strid J,Roberts SJ,Filler RB,etal.Acute upregulation of an NKG2D ligand promotes rapid reorganization of a local immune compartment with pleiotropic effects on carcinogenesis[J].Nat Immunol,2008,9(2)：146-154.

[17] Nausch N,Cerwenka A.NKG2D ligands in tumor immunity[J].Oncogene,2008,27 (45)：5944-5958.

[18] Spies T.Regulation of NKG2D ligands：a purposeful but delicate affair[J].Nat Immunol,2008,9(9)：1013-1015.

[19] Pende D,Rivera P,Marcenaro S,etal.Major histocompatibility complex class I-related chain A and UL16-binding protein expression on tumor cell lines of different histotypes:analysis of tumor susceptibility to NKG2D-dependent natural killer cell cytotoxicity[J].Cancer Res,2002,62(21)：6178-6186.

[20] Raffaghello L,Prigione I,Airoldi I,etal.Down regulation and/lease of NKG2D ligands as immune evasion strategy of human neuroblastoma[J].Neoplasia,2004,6(8)：558-568.

[21] Dragun D,Philippe A,Catar R. Role of non-HLA antibodies in organ transplantation[J].Curr Opin Organ Transplant,2012,17(4)：440-445.

[22] Cerwenka A,Lanier LL.NKG2D ligands：unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer[J].Tissue Antigens,2003,61(5)：335-343.

[23] Li K,Mandai M,Hamanishi J,etal. Clinical significance of the NKG2D ligands,MICA/B and ΜLBP2 in ovarian cancer： high expression of ΜLBP2 is an indicator of poor prognosis[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(5)：641-652.

[24] Watson NF,Spendlove I,Madjd Z,etal.Expression of the stress-related MHC class I chain-related protein MICA is an indicator of good prognosis in colorectal cancer patients[J].Int J Cancer,2006,118(6)：1445-1452.

[收稿2015-11-20 修回2016-05-25]

(編輯 張曉舟)

Effect and mechanism of atorvastatin on cytotoxicity of human NK cells to colon cancer cells

JIHui-Chun，LIUJun-Quan，ZHOUYu，LIYi，CHENFu-Xing，F(xiàn)EISu-Juan.

SuqianFirstHospital，Suqian223800，China

Objective:To explore the mechanism of the cytotoxicity of human NK cells induced by atorvastatin to colon cancer cell lines.Methods: After colon cancer cells (HCT-116,SW-480,Caco-2) were cultured with different concentrations of atorvastatin,CCK-8 assay was used to assess the effect of atorvastatin on growth of colon cancer cells.The amplification of human NK cells was induced by SCGM medium in vitro.Automatic biochemical analyzer was applied to test the cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells which cultured with different concentration of atorvastatin.FCM was used to detect the expression rate of MICA/B on the cells.Results: (1) The cultivation of NK cells: The proportion of NK cells attained to 93.1% from 4.5% after cultured for 10 days.(2) The effects of atorvastatin on the growth of the colon cancer cells: After cultured with atorvastatin,the inhibition rate of HCT-116 cells was higher than that in control when the density of atorvastatin increased from 5 μmol/L to 40 μmol/L after 48 h and from 1.25 μmol/L to 40 μmol/L after 96 h(P<0.05).Correlation analysis showed that the concentration of atorvastatin and the growth inhibition rate of HCT-116 cells were positively correlated(r[48 h]=0.13,r[96 h]=0.22,P<0.05).(3) The cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells effected after atorvastatin: In different atorvastatin concentrations groups,the cytotoxicity of NK cells to three colon cancer cell lines was all higher than that in control(P<0.05).The atorvastatin concentration was from 2.5 μmol/L to 10 μmol/L for HCT-116 cells,from 5 μmol/L to 20 μmol/L for SW-480 cells,and from 2.5 μmol/L to 20 μmol/L for Caco-2 cells.Among the three cell lines,the cytotoxicity of NK cells to HCT116 was the highest in the same concentration.(4)NK cells by atorvastatin cutting statins 96 h,the concentration of 20 mmol/L and 40 mmol/L inhibition rate was higher than that of control group,more than other groups on NK cell growth without significant effect. (5) The impact of atorvastatin on MICA/B expression of colon cancer cells: After cultured with different concentrations of atorvastatin,the expression of MICA/B on colon cancer cells was higher than that in control(P<0.05).The concentration was 2.5 μmol/L and 5 μmol/L for HCT-116 cells,10 μmol/L and 20 μmol/L for SW-480 cells,and from 2.5 μmol/L to 40 μmol/L for Caco-2 cells. Conclusion: Atorvastatin could inhibit the growth of colon cancer cells (HCT-116,SW-480 and Caco-2) in a dose-dependent manner;and it could enhance the cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells;it also could promote the expression of MICA/B of colon cancer cells,and improve the immunogenicity of colon cancer cells.

Atorvastatin;Colon cancer cell lines;Natural killer cells;MICA/B

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.004

①本文受南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新課題經(jīng)費資助項目(13MA039)資助。

姬會春(1982年-)，女，碩士，主治醫(yī)師， 主要從事消化道腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail：48587581@qq.com。

及指導教師：費素娟(1963年-)，女，碩士，教授，碩士生導師，主任醫(yī)師，主要從事消化系腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:feisj1031@yahoo.com.cn。

R735.3

A

1000-484X(2017)02-0178-08

②中國人民解放軍97醫(yī)院，徐州221000。

③徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科，徐州221000。