劉瑜，陳洪琳，羅正凱，王淑榮，劉丹*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

督脈電針對慢性腦缺血大鼠OX2R及其配體表達(dá)的影響

劉瑜1，陳洪琳2，羅正凱2，王淑榮2，劉丹2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究督脈電針在慢性腦缺血時大鼠腦食欲素受體-2(OX2R)及其配體在不同時間點(diǎn)缺血后的變化。方法：實驗中運(yùn)用分次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法建立慢性腦缺血模型，將Wistar大鼠分4組，造模成功后給予督脈電針干預(yù)，免疫組織化學(xué)法觀察OX2R 的表達(dá)，同時運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測各組大鼠額葉皮質(zhì)區(qū)Orexin-A和Orexin-B的總含量變化。 結(jié)果：1個月、2個月時,模型組OX2R及其配體表達(dá)高于正常組，同時呈遞增趨勢；在相同時間進(jìn)行組間比較，1個月時，模型組和針刺治療組OX2R及其配體的表達(dá)無顯著差別，立即針刺組OX2R及其配體的表達(dá)較模型組有升高；2個月時針刺治療組OX2R及其配體表達(dá)較模型組有明顯升高，而立即針刺組與針刺治療組相比OX2R及其配體表達(dá)有升高。 結(jié)論：實驗觀察到OX2R及其配體的表達(dá)在1個月和2個月時隨著時間延長而升高,經(jīng)過督脈電針干預(yù)后促進(jìn)了OX2R及其配體表達(dá)，同時觀察到早期干預(yù)對OX2R及其配體表達(dá)的影響優(yōu)于針刺治療組。

督脈電針；慢性腦缺血；Orexin；OX2R

慢性腦供血不足(chronic cerebral circulatoryinsufficiency)是指大腦的血液供應(yīng)量降低的一種狀態(tài)[1]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)長期慢性腦供血不足可使腦組織產(chǎn)生慢性腦缺血,進(jìn)而出現(xiàn)不同程度上的病理損傷,如果治療不及時,可以導(dǎo)致認(rèn)知功能下降,重者會出現(xiàn)缺血性腦卒中以及癡呆、Alzheimer等疾病[2],有研究[3]表明慢性腦缺血會導(dǎo)致OX2R及其配體發(fā)生變化。近年來，慢性腦缺血導(dǎo)致的腦梗死及腦血栓等疾病也逐年增多，是導(dǎo)致中老年人致死、致殘的主要原因[4-5]。本研究通過結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法建立慢性腦缺血的大鼠模型，觀察大鼠腦內(nèi)OX2R及其配體的表達(dá)情況，同時運(yùn)用督脈電針在不同時期進(jìn)行干預(yù)，觀察干預(yù)后的療效，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 試劑與動物

選取黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供的Wistar大鼠70只,大鼠山羊抗多克隆OX2R抗體購于Santa Cruz公司，于北京中杉生物技術(shù)有限公司購買免疫組化SP試劑盒，CY3標(biāo)記山羊及FITC標(biāo)記小鼠Ⅱ抗熒光試劑購于武漢博士德生物試劑公司，CWB10購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 慢性腦缺血大鼠模型建立及實驗分組

參照劉丹[6]分次永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈制作腦缺血大鼠模型 ,實驗大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組、立即針刺組和針刺治療組，正常組無任何處理，模型組、立即針刺組及針刺治療組分別分為1個月和2個月2個亞組，每組大鼠10只，立即針刺組造模開始就進(jìn)行督脈電針干預(yù)，針刺治療組造模術(shù)后3周進(jìn)行督脈電針的干預(yù)。

1.3 操作方法

運(yùn)用督脈電針對針刺后的督脈穴(神庭和百會、風(fēng)府和大椎)進(jìn)行干預(yù)，給予持續(xù)脈沖電流及疏波，頻率和強(qiáng)度分別為2 Hz、2 mA，出現(xiàn)頭部輕微抖動最佳，并于每日同一時間進(jìn)行時長為20 min的針刺，每日1次。

1.4 腦組織切片的制備與腦組織OX2R的表達(dá)水平測定

于同一固定時間分別對2VO術(shù)后各組進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)本采集，兩個治療組的大鼠于治療結(jié)束后同一時間段進(jìn)行標(biāo)本采集。DAB顯色，在鏡下控制時間，運(yùn)用光鏡觀察。OX2R主要表達(dá)在海馬CA3區(qū)，隨機(jī)選擇5個鏡下視野的1 000個細(xì)胞，并于光鏡下計算其陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 ELISA法檢測

實驗過程中的1個月、2個月時，每組在每個時間點(diǎn)，均處理10只大鼠，取下大鼠腦內(nèi)組織，應(yīng)用組織蛋白抽提試劑盒，提取其相應(yīng)的組織蛋白，經(jīng)冷凍離心處理后，取其上清液，用BCA法測定其蛋白的濃度，用ELISA法檢測其中Orexin-A和Orexin-B的總含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OX2R 的表達(dá)

表1 OX2R陽性細(xì)胞數(shù)個/5個視野1 000個細(xì)胞)

注：與正常組比較，▲P<0.05；與同一時間點(diǎn)模型組比較，■P<0.05；與立即針刺治療組比較,★P<0.05

實驗結(jié)果表明： 造模開始后1個月模型組OX2R的表達(dá)較正常組升高，并在2個月時進(jìn)一步增高；同一時間點(diǎn)的組中OX2R表達(dá)，1個月時模型組與針刺治療組比較無明顯差異(P>0.05)，而立即針刺組高于模型組(P<0.05)；2個月時治療組明顯高于模型組(P<0.05)，立即針刺組與針刺治療組相比有升高(P<0.05)。

2.2 ELISA檢測

表2 皮質(zhì)區(qū)Orexin-A和Orexin-B的總含量

注：與正常組比較，▲P<0.05；與同一時間點(diǎn)模型組比較，■P<0.05；與針刺治療組比較,★P<0.05

實驗結(jié)果:造模成功后1個月時測定Orexin-A及Orexin-B的總含量，模型組與正常組相比較有升高(P<0.05),2個月時，模型組與正常組相比較明顯升高(P<0.05),即OX2R的表達(dá)有升高；同時1個月時，模型組與針刺治療組相比較無顯著性差異(P>0.05)，立即針刺組與模型組比較有升高(P<0.05),即OX2R的表達(dá)上升；2個月時，3組Orexin-A及Orexin-B的總含量呈“模型組、針刺治療組、立即針刺組”遞增趨勢，差異有顯著性意義(P<0.05),即OX2R的表達(dá)呈遞增趨勢。

3 討論

食欲素(orexin)系統(tǒng)是與攝食、睡眠-覺醒周期、消化、激素分泌活動調(diào)節(jié)有關(guān)的大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[7]。Orexin系統(tǒng)中包含Orexin-A與Orexin-B，能與2個與其配對的G蛋白受體食欲素受體1和食欲素受體2相結(jié)合后調(diào)控機(jī)體的營養(yǎng)和能量平衡、睡眠-覺醒周期，其中食欲素受體1對其配體有嚴(yán)格選擇性，但食欲素受體2對其配體(Orexin-A或Orexin-B)并沒有嚴(yán)格的選擇性[8-11]。在人類與小鼠中Orexin-A與Orexin-B均可通過Orexin系統(tǒng)的G蛋白耦聯(lián)受體OX2R而發(fā)揮作用。督脈電針對慢性腦缺血的治療在臨床應(yīng)用中療效較明顯，而督脈又有上達(dá)腦竅入髓海的作用，電針的應(yīng)用可以進(jìn)一步加強(qiáng)針刺督脈后對慢性腦供血不足的影響。實驗通過直接觀察慢性腦缺血大鼠在缺血后期腦內(nèi)OX2R及其配體的表達(dá)情況和測定Orexin-A與Orexin-B的含量變化情況反應(yīng)經(jīng)督脈電針干預(yù)后對OX2R產(chǎn)生的影響。實驗結(jié)果顯示的數(shù)據(jù)變化與呂瑞娟等[12]的研究結(jié)果是相一致的。同時Katsuki[13]等研究也表明在缺血2個月時大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力的好轉(zhuǎn)可能與OX2R介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。同時有研究表明，神經(jīng)元受損是缺血性腦損傷發(fā)病的重要機(jī)制之一[14]。因此Orexin受體-2在大鼠慢性腦缺血的病理過程中起到了調(diào)節(jié)作用，而督脈電針可以對OX2R的表達(dá)產(chǎn)生影響,說明經(jīng)過督脈電針的干預(yù)后能夠?qū)Υ笫竽X內(nèi)OX2R的表達(dá)情況起到良性的調(diào)節(jié)作用，可能提示督脈電針對慢性腦缺血大鼠缺血后期導(dǎo)致的大腦的神經(jīng)細(xì)胞的損傷有一定防治作用。

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Effect of Electronic Acupuncture of DU on OX2R and Its ligand Expression of Chronic Cerebral Ischemia Rats

LIU Yu1，CHEN Hong-lin2，LUO Zheng-kai2，WANG Shu-rong2，LIU Dan2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040,China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective：To explore the effect of electronic acupuncture of DU on OX2R and its ligand expression of rats with chronic cerebral ischemia in different time points. Methods：Establish the cerebral ischemic models by fractionally ligating bilateral carotid arteries. The Wistar rats were divided into four groups.After the success of building,the electronic acupuncture of DU was used for intervention and measure the OX2R expression by immunohistochemical technique. Orexin-A and Orexin-B in frontal cortex were examined via ELISA techniques.Results：After one month, the expression levels of OX2R and its ligand were higher and the level of OX2R and its ligand were significantly higher in the model group than those in control group.Compared between groups at the same time, there was no significant difference in statistics of one month between the model group and the acupuncture group, but the expression level of OX2R and its ligand in the immediate acupuncture group were higher than those in the model group. The OX2R and its ligand expression after two months in acupuncture group were increased obviously compared with those in the model group, and the OX2R and its ligand expression of immediate acupuncture group were increased compared with thos in the acupuncture group. Conclusion：The expression levels of OX2R and its ligand have an increased trend with the extension of time during one month and two months. The electronic acupuncture of DU can promote the expression levels of OX2R and its ligand,and the early intervention is superior to the acupuncture treatment group.

DU electronic acupuncture；Chronic cerebral ischemia；Orexin；OX2R

2016-10-24

2016-11-29

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12541760)

劉瑜(1991-)，女，碩士研究生，研究方向:針刺防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

*通訊作者：劉丹(1972-),女,博士,副教授,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師，研究方向:針刺防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

R245.9+R743

A

1002-2392(2017)01-0057-03