謝名君，焦亞斌，李環(huán)，林雨珊

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060)

中 藥 研 究

丹參飲精品中藥與普通中藥四種酚性成分的比較研究

謝名君，焦亞斌*，李環(huán)，林雨珊

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B的含量，比較丹參飲精品中藥與普通中藥上述四種成分的含量變化。方法：采用Genmini 5 μm C18110A(250 mm×4.60 mm,5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫,流速0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，進(jìn)樣量15 μL。結(jié)果：在40 min內(nèi)，丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B四種酚性成分能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離，并且濃度與峰面積在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≤0.999 8。與普通中藥相比，丹參飲精品中藥中丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛和原兒茶酸含量明顯增加。 結(jié)論：該分析方法專屬性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證可用于測(cè)定丹參飲中四種酚性成分的含量。

高效液相色譜法；丹參飲；酚性成分

隨著生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，心血管疾病已經(jīng)成為危害人類健康的一大殺手，給國(guó)家和人民帶來沉重的負(fù)擔(dān)。丹參飲出自《時(shí)方歌括》，由丹參，檀香和砂仁組成，主治心痛、胃脘諸痛。方中丹參為君藥，活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，養(yǎng)血安神。檀香善行胸膈脾胃之氣，而砂仁行氣調(diào)中，和胃醒脾。三者合用，增強(qiáng)活血化瘀、行氣止痛的功效。近年來，丹參飲廣泛應(yīng)用于心血管疾病[1]如冠心病，心力衰竭，慢性肺源性心臟病等的治療，取得了確切的療效。本課題組[2]研究丹參飲精品中藥和普通中藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)大鼠藥理作用，丹參飲能明顯降低AS模型大鼠血脂，且丹參飲精品中藥好于丹參飲普通中藥。鑒于精品中藥和普通中藥丹參飲藥理作用上的差異，本課題利用高效液相色譜法，研究丹參飲藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，并比較丹參飲精品中藥和丹參飲普通中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)的區(qū)別。

1 儀器與試藥

Agilent LC 1260高效液相色譜儀(在洗脫氣機(jī) G1322A ；二元泵 G1312B； 自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器 G1329B ；二極管陣列檢測(cè)器 G4212B)。CO-1000柱溫箱(武漢恒信儀器)；XS205分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；寶來陶瓷煎藥壺(廣興系列);SB 25-12DTDW超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

精品中藥丹參藥材(C2P063601，產(chǎn)地四川，深圳市和順堂本草藥業(yè)有限公司)；精品中藥檀香藥材(C2D037901，產(chǎn)地廣東，深圳市和順堂本草藥業(yè)有限公司)；精品中藥砂仁藥材(C2P063601，產(chǎn)地廣東，深圳市和順堂本草藥業(yè)有限公司)；普通中藥丹參藥材(130301，產(chǎn)地河北，深圳市康程醫(yī)藥有限公司)；普通中藥檀香藥材(130301，產(chǎn)地印度，深圳市康程醫(yī)藥有限公司)；普通中藥砂仁藥材(130301，產(chǎn)地廣東，深圳市康程醫(yī)藥有限公司)。

丹參素(對(duì)照品 HPLC≥98.0% 批號(hào) ZY150419)，丹酚酸B(對(duì)照品 HPLC≥98.0% 批號(hào) ZY150420)，原兒茶酸(對(duì)照品 HPLC≥98.0% 批號(hào) ZY150829)，原兒茶醛(對(duì)照品 HPLC≥98.0% 批號(hào) ZY150830)均購(gòu)自上海譜振生物科技(克拉瑪爾?)。乙腈(色譜純，批號(hào)130325，YiRenDa)，甲醇(色譜純，批號(hào)20150623，天津永大化學(xué)試劑)，三氟乙酸(分析純，T818778，Lot#：C10029827，麥克林)

2 方法

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的對(duì)照品適量，加70%甲醇水溶液制成濃度分別為0.248 3 mg/mL,0.011 49 mg/mL,0.012 77 mg/mL和1.050 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.2 供試品溶液的制備

取丹參藥材約90 g，砂仁約27 g，檀香約27 g，精密稱定。先將丹參藥材置于煎藥壺中，加入750 mL蒸餾水浸泡1 h，煎煮45 min后，加入約13.5 g砂仁和13.5 g檀香繼續(xù)煎煮15 min。將藥液用四層紗布過濾。然后補(bǔ)加600 mL蒸餾水煎煮45 min，將余下的砂仁和檀香加入煎藥壺中，補(bǔ)加150 mL蒸餾水繼續(xù)煎煮15 min，將藥液用紗布過濾，合并兩次藥液，得到丹參飲(3付藥的劑量)。然后取5 mL藥液至25 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，作為供試品溶液。置于4 ℃冰箱避光保存。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

取處方量的砂仁和檀香，精密稱定，照上述供試品溶液的制備方法，得到不含丹參的陰性對(duì)照溶液。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Genmini 5 μm C18110A(250 mm×4.60 mm,5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～7 min，2%A→10%A;7～20 min,10%A→23%A;20～35 min,23%A→27%A;35～38 min,27%A→38%A),流速0.8 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，進(jìn)樣量15 μL。在上述色譜條件下[3]，理論塔板數(shù)均不低于2 000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。混合對(duì)照品，陰性對(duì)照，精品中藥丹參飲和普通中藥丹參飲色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)、陰性對(duì)照品(B)、精品中藥丹參飲樣品(C)和普通中藥丹參飲(D)的高效液相色譜圖1.丹參素(danshensu);2.原兒茶酸(protocatechuic acid);3.原兒茶醛(protocatechualdehyde);4.丹酚酸B(salvianolic acid B)

2.5 線性范圍

精密吸取混合對(duì)照品溶液2、6、8、10、12、16、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積X對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量Y(μg)作圖，各對(duì)照品物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、線性范圍見表1。

表1 線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取丹參飲供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.18%、1.35%、1.48%、0.24%。

2.7 專屬性試驗(yàn)

精密吸取陰性對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，得到色譜圖C，說明處方中的砂仁和檀香不會(huì)影響丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的含量測(cè)定。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將丹參飲溶液于0、4、8、12、24、48 h過0.45 μm微孔濾膜(棄初濾液)置于進(jìn)樣小瓶中，精密吸取丹參飲供試品溶液10 μL注入液相色譜儀中，測(cè)得48 h內(nèi)丹參飲樣品中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.39%、2.33%、3.25%、0.13%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密移取已知濃度的丹參飲樣品9份，每份2 mL，分別置于5 mL的容量瓶中，再精密移取含丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B 分別為0.248 3 mg/mL,0.011 49 mg/mL，0.012 77 mg/mL和1.050 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1.6 mL(3份)，2.0 mL(3份)和2.4 mL(3份)，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜。精密吸取20 μL注入液相色譜儀中，各成分平均回收率分別為：100.5%、98.3%、95.7%和89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.57%、1.31%、0.17%、2.12%。

3 結(jié)果

取丹參飲精品中藥和普通中藥，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，各3份，按“3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量15 μL，記錄各化合物的峰面積，根據(jù)各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各化合物的濃度，含量=濃度×稀釋倍數(shù)/樣品量。與丹參飲普通中藥相比，丹參飲精品中藥中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的含量均增加，結(jié)果具有非常顯著差異。測(cè)定結(jié)果見表2和圖2。

表2 丹參飲中4中酚酸性成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

注：與普通中藥相比，*P<0.05，**P<0.01

圖2 丹參飲精品中藥與普通中藥的含量比較注：與普通中藥相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

4.1 復(fù)方制劑成呈多樣性和復(fù)雜性

對(duì)于中藥復(fù)方制劑，在定量指標(biāo)上選擇多指標(biāo)控制其質(zhì)量[4]。本研究在相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參飲中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和丹酚酸B的含量。方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，為建立丹參飲制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。同時(shí)也可以作為丹參藥材、飲片及其復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[2]，結(jié)合試驗(yàn)，以三氟乙酸溶為水相，乙腈為有機(jī)相，考察兩者梯度洗脫的時(shí)間和比例對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35～38 min內(nèi)，乙腈比例從27%→38%，對(duì)色譜分離效果最佳。色譜峰對(duì)稱性良好。

4.3 專屬性試驗(yàn)

對(duì)陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣分析，在0～40 min內(nèi)，檀香和砂仁未出現(xiàn)干擾峰。

4.4 加樣回收率試驗(yàn)的驗(yàn)證

用混合對(duì)照品作為加樣的對(duì)照品，丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛加樣量與樣品中的含量接近，測(cè)得回收率在95%～105%之間，而丹酚酸B加樣量(1.05 mg)與樣品量(2.654 mg)相差較大，回收率為89.2%。配制丹參素和丹酚酸B混合對(duì)照品，按樣品中丹參素和丹酚酸B的80%、100%和120%的加對(duì)照品量，測(cè)得丹參素和丹酚酸B的平均加樣回收率分別為103.6%和97.9%。相對(duì)應(yīng)的RSD(n=9)分別0.96%和0.92%。說明在該方法可行，可靠、可信。

4.5 精品中藥的特點(diǎn)

第一安全，第二優(yōu)質(zhì)。很多消費(fèi)者或患者是長(zhǎng)期服用中藥的，農(nóng)化殘留物無疑會(huì)對(duì)他們?cè)斐山】祮栴}。精品中藥在整個(gè)供應(yīng)鏈上嚴(yán)格把關(guān)，產(chǎn)品在種植前要先檢驗(yàn)土壤，在收成后也要檢驗(yàn)。在工廠加工前要檢驗(yàn)，在生產(chǎn)后也要檢驗(yàn)。確保在整個(gè)過程中沒有被污染，有效成分沒有喪失。采用科學(xué)的管理手段和現(xiàn)代化的檢測(cè)方法，嚴(yán)格控制精品飲片的有效成分、安全指標(biāo)，保證精品中藥飲片“道地、安全、有效、均一、穩(wěn)定”，能夠“還中醫(yī)藥本色，還中醫(yī)藥尊嚴(yán)”。

4.6 精品中藥是現(xiàn)代中醫(yī)的強(qiáng)大后盾和基礎(chǔ)

它不僅將大量的現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)應(yīng)用在中藥材的質(zhì)量管理上，而且令中藥中醫(yī)的真實(shí)價(jià)值得到體現(xiàn)。精品中藥解除了消費(fèi)者和患者對(duì)藥材安全問題的顧慮，放心地長(zhǎng)期使用，另一方面保證了療效，加強(qiáng)了患者對(duì)醫(yī)生的信心。整體而言，確立了中醫(yī)的權(quán)威性和科學(xué)性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明與丹參飲普通中藥相比，丹參飲精品中藥中四種酚性的含量均明顯增加。這有助于闡明本課題組之前的研究——丹參飲精品中藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠降血脂作用好于丹參飲普通中藥的原因。

[1] 陳惠，孫朦朦，安然，等.丹參飲在心血管疾病中的應(yīng)用[J].杏林中醫(yī)藥，2012，33(1):27.

[2] 李環(huán)，焦亞斌.丹參飲精品中藥與普通中藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠藥理作用的比較[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30(6):980.

[3] 李安平，楊錫，丁永輝.HPLC法同時(shí)測(cè)定丹參注射液中8種成分[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，38(3):34-37.

[4] 姜鴻，王光函，張穎，等. HPLC 法測(cè)定火絨草中原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和咖啡酸[J].中成藥，2011，33(11):2023-2025.

[5] 王偉，李焱，謝曉梅，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參中4中酚酸類成分的含量[J].藥物分析，2010,14(11)：1276-1278.

[6] 李曼玲，馮偉紅，康琛，等.丹參藥材水溶性成分含量的HPLC法分析[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008,15(8)：49-51.

[7] 潘英妮，袁丹，符文衛(wèi)，等.HPLC法測(cè)定丹參類注射液中4種水溶性成分含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,21(3)：196-200.

Determination of Four Phenolic Constituents between Boutique Salvia Decoction and Common Salvia Decoction by High Performance Liquid Chromatograph

XIE Ming-jun, JIAO Ya-bin, LI Huan, LIN Yu-shan

(SchoolofMedicine,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Objective: To establish an high performance liquid charomatography(HPLC) method for simultaneous determination of Danshensu, protocatechuic acid, protocatechualdehyde and salvianolic acid B in Salvia miltiorrhiza decoction, and to study the discrepancy of four phenolic constituents between Boutique salvia decoction and common salvia decoction.Methods:Analysis was performed on a Waters Symmetry C18(4.60 mm×250 mm,5 μm)column with gradient elution of acetonitrile (A)and 0.05% trifluoroacetic acid (B)at the flow rate of 0.8 ml/min.Detection wavelength was 288 nm and column temperature was set at 25℃.Results: Danshensu, protocatechuic acid, protocatechualdehyde and salvianolic acid B had a good linearity in certain ranges,with correlation eoefficientr≤0.999 8.Compared with the common salvia decoction,the contents of Danshensu,salviandic acid B,protocatechualdehyde and protocatechuic acid were increased obviously.Conclusion:This method is simple, accurate with high stability and good repeatability,which is helpful to control the quality of salvia miltiorrhiza decoction.

HPLC; Salvia decoction; Phenolic constituents

2016-09-09

2016-10-27

深圳市未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(JCYJ20150324141711654)；深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(JC201005250070A)

謝名君(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)及其藥物防治。

*通訊作者：焦亞斌(1970-),女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)及其藥物防治。

R284.1

A

1002-2392(2017)01-0044-03