婁序笙,胡京紅,葛東宇,魯衛(wèi)星*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,北京100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心,北京 100029)

金銀花對(duì)病毒性心肌炎小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制

婁序笙1,胡京紅2,葛東宇2,魯衛(wèi)星1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,北京100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心,北京 100029)

目的:研究中藥金銀花對(duì)柯薩奇B3(CVB3)病毒性心肌炎小鼠心肌的保護(hù)作用。方法:將BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，金銀花低劑量組、金銀花高劑量組，灌胃給藥3周。各組于CVB3感染后第7、14、21天分批處死,取心臟做組織病理學(xué)檢查,同時(shí)分別用黃嘌呤氧化酶法和硫巴比妥酸法測(cè)血清、丙二醛(MDA)含量與心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)活性,比較各組小鼠在第7、14、21天心肌組織檢測(cè)的SOD活性和MDA測(cè)定值。結(jié)果:高劑量組、低劑量組在第14天、21天小鼠活性均明顯高于病毒對(duì)照組,MDA含量明顯低于病毒對(duì)照組(P<0.05);高劑量組、低劑量組在第21天血清SOD活性和MDA含量基本恢復(fù)正常;各組小鼠在第7、14、21天心肌組織檢測(cè)的SOD活性和MDA測(cè)定值均出現(xiàn)不同程度的變化，各中藥組小鼠心肌炎癥性病理變化均明顯減輕。結(jié)論:金銀花能減輕CVB3感染小鼠氧自由基損傷,對(duì)VM小鼠心肌具有保護(hù)作用。

金銀花;病毒性心肌炎;柯薩奇病毒感染;氧自由基；保護(hù)作用；機(jī)制

病毒性心肌炎(VMC)在現(xiàn)今社會(huì)成為最普遍的心肌炎之一,感染率呈上升趨勢(shì),其中多于三分之一的病例有病變的可能,病死率極高[1]。至今為止沒(méi)有合適方法進(jìn)行根治。臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療有一定的成效,很多相關(guān)報(bào)道，中醫(yī)具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)且具有理論特色[2-6]。

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)的誘導(dǎo)因素較多，感染率也逐年上升[7]，病毒性心肌炎的關(guān)鍵病原體是柯薩奇病毒B3(CVB3)[8]，其發(fā)病機(jī)制主要是病毒侵入人體對(duì)心肌產(chǎn)生直接損傷以及免疫反應(yīng)[9]。最近幾年臨床數(shù)據(jù)的對(duì)比研究以及醫(yī)療器械的發(fā)展探索得知氧自由基也是導(dǎo)致心肌炎發(fā)病的因素之一。本文通過(guò)探究金銀花對(duì)VM小鼠血清及心肌組織中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及心肌病理改變的影響,探索金銀花的治療效果，為臨床提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

CVB3Nancy株為標(biāo)準(zhǔn)株,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所-80℃保存,實(shí)驗(yàn)前復(fù)蘇。病毒在HeLa細(xì)胞上傳代凍融3次,活化增殖后,采用Reed-Muench微量法滴定,其滴度為10-7TCID50/mL,實(shí)驗(yàn)用100 T CID50/mL。

1.1.2 藥品與試劑

超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,產(chǎn)品批號(hào)是SOD(A001-1),MDA(A003-1)。中藥金銀花購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房，藥品批號(hào):1102023。金銀花煎液:將中藥房金銀花常規(guī)煎煮3次,過(guò)濾去渣,混合,再濃縮配成0.5 kg/L和1 kg/L的煎液。

1.1.3 動(dòng)物與儀器

純種BALB/c小鼠,雄性,鼠齡4～6周,體質(zhì)量15～18 g，購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。

全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，美國(guó))。Trizol(Invitrogen 公司，美國(guó))，SYBR GreenⅠ熒光染料(KAPA Biosystem公司,美國(guó)),引物(上海生工公司合成),實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(ROCHE Light-Cycler480,美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 依據(jù)研究數(shù)據(jù)確定參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物和病毒數(shù)量

按隨機(jī)數(shù)表選取180只BALB/c小鼠，將其隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(A組,45只),病毒對(duì)照組(B組,45只),中藥低劑量組(C組,45只),中藥高劑量組(D組,45只),實(shí)驗(yàn)當(dāng)日正常對(duì)照組小鼠每只腹腔無(wú)菌注射不含CVB3的MEM Eagle’s液0.1 mL，飼養(yǎng)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。其他組腹腔無(wú)菌注射0.1 mL 1.0×10-5CVB3病毒,誘導(dǎo)小鼠VMC模型,在隔離實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。中藥金銀花煎液根據(jù)人與小鼠的標(biāo)準(zhǔn)公斤體重劑量折算方法[5],接種病毒0.5 h采用灌胃法給藥，金銀花低劑量組以0.5 kg/L金銀花煎液灌胃;金銀花高劑量組以1 kg/L的金銀花煎液灌胃;正常對(duì)照組和模型組以等量生理鹽水灌胃作為對(duì)照。各組按0.025 mL/g灌胃,1次/d,連續(xù)21天。(金銀花增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究)每組于接種病毒后7天、14天、21天處死。取心臟和血清標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本采集

標(biāo)本采集時(shí)間定于小鼠接受病毒接種后的第7、14、21天，這3天時(shí)在每組小鼠中隨機(jī)選取15只處死,在第21天時(shí)各組將剩余的小鼠處死,摘除小鼠的眼球并取血采用離心技術(shù)制得血清,將血清分裝在-20℃的環(huán)境中備用。在無(wú)菌環(huán)境中解剖小鼠取得心臟并稱其質(zhì)量，后取心臟左側(cè)部分運(yùn)用10%的中性甲醛進(jìn)行固定。

1.2.3 病理學(xué)檢查

使用常規(guī)的石蠟包埋從小鼠體內(nèi)取得的心肌標(biāo)本,在左心室方向進(jìn)行連續(xù)性的切片,后運(yùn)用光鏡研究HE染色心肌病理變化,依據(jù)Rezkalla方法對(duì)心肌病理組織學(xué)積分進(jìn)行計(jì)算。小鼠心肌標(biāo)本包埋、染色、切片和觀察在北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2.4 SOD和MDA檢測(cè)

運(yùn)用黃嘌呤氧化酶法對(duì)各組小鼠進(jìn)行SOD檢測(cè),運(yùn)用TBA(thibabituric acid,硫巴比妥酸)法對(duì)其進(jìn)行MDA檢測(cè),詳細(xì)操作試劑盒中有具體說(shuō)明。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況和生存率分析

對(duì)照組之外的其他組接種CVB3的小鼠第3天開(kāi)始松毛，進(jìn)食飲水減少或者拒食，懶動(dòng)，體質(zhì)量減輕，其中17只小鼠出現(xiàn)精神煩躁并好動(dòng)的現(xiàn)象。C、D組死亡率低于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組小鼠病死情況

圖1 各組小鼠生存率曲線

2.2 心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果

運(yùn)用光鏡對(duì)小鼠的心肌組織病理進(jìn)行檢查，患病小鼠在第7天出現(xiàn)首例小血管炎;在第14天各組小鼠均出現(xiàn)大量心肌變性、壞死以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的狀態(tài),此態(tài)正是傳統(tǒng)的病毒性心肌炎改變的標(biāo)志;在第21天各組小鼠體內(nèi)肌纖維出現(xiàn)鈣化以及溶解吸收的趨勢(shì),整體出現(xiàn)恢復(fù)性改變的特征(見(jiàn)表2)。中藥治療各組小鼠出現(xiàn)心肌病變的狀況相對(duì)而言明顯減輕,其中C、D兩組在第21天的心肌結(jié)構(gòu)一定程度上恢復(fù)正常。心肌組織病理學(xué)積分結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 CVB3病毒感染小鼠不同時(shí)期心肌病理積分

注：與B組比較,a、cP<0.002；與C組比較,b、dP<0.05

2.3 各組小鼠不同時(shí)期的SOD活性比較

第7天各組小鼠血清中的SOD活性無(wú)顯著變化,此后呈下降趨勢(shì),在第14天達(dá)到低谷。各用藥組小鼠的血清SOD活性相對(duì)于對(duì)照組升高。第7天時(shí)C、D兩組的小鼠的SOD活性較A組小鼠高,采用中藥治療的小鼠血清SOD活性在第21天一定程度上恢復(fù)正常,見(jiàn)表3。

2.4 各組小鼠不同時(shí)期的MDA值比較

在第7天各組小鼠血清MDA值增大,在第14天達(dá)到頂峰,在第21天呈現(xiàn)降低趨勢(shì)并略高于正常值。各用藥組小鼠血清MDA值相對(duì)較低，見(jiàn)表4。

表3 實(shí)驗(yàn)各組小鼠血清SOD活性、MDA測(cè)定值

注：與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

表4 實(shí)驗(yàn)各組小鼠心肌組織SOD活性、MDA測(cè)定值

注：與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

3 討論

病毒性心肌炎是一種以心肌炎癥為主的病癥，其主要誘發(fā)因素是病毒，病毒因素多種多樣，其中多為腸道病毒，腸道病毒當(dāng)中的柯薩奇B組病毒(CVB)較為普遍。病毒性心肌炎具有極高的死亡率，發(fā)病過(guò)程較快，主要分為兩個(gè)階段：第1周主要是機(jī)體受到病毒侵蝕后造成心肌細(xì)胞損傷，第2周出現(xiàn)針對(duì)病毒的細(xì)胞免疫以及體液免疫狀況，后造成心肌細(xì)胞損害，此時(shí)為更大范圍的損害。氧自由基(oxygen free radical,OFR)損傷生物大分子發(fā)揮基礎(chǔ)作用造成機(jī)體的衰老以及造成各種疾病并促使其惡性發(fā)展。生物機(jī)體中氧自由基時(shí)常發(fā)生失衡的情況，而SOD可維持其動(dòng)態(tài)平衡。MDA是反映機(jī)體之中脂質(zhì)過(guò)氧化的程度以及氧自由基水平的重要指標(biāo)，可以作為中間產(chǎn)物參與到脂質(zhì)過(guò)氧化的反應(yīng)之中。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，氧自由基作為重要因素參與病毒性心肌炎的發(fā)病[10],由此臨床上醫(yī)師對(duì)于氧自由基的作用做出肯定。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得知，各組小鼠體內(nèi)SOD出現(xiàn)下降的趨勢(shì),相對(duì)的LPO則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[11]。病毒感染嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體正常機(jī)能，導(dǎo)致心肌離子泵功能下降，腺苷酸酶的活性降低，從而使心肌細(xì)胞難以承載鈣離子,心肌正常的能量代謝受到干擾，提高磷脂酶的活性從而產(chǎn)生氧自由基,心肌炎嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致缺血缺氧甚至產(chǎn)生威脅極大的炎癥，造成炎癥的巨噬細(xì)胞使得細(xì)胞嚴(yán)重耗氧，從而促進(jìn)了葡萄糖的代謝，耗氧過(guò)程中發(fā)生還原作用產(chǎn)生大量的氧氣從而合成大量的OFR,最終使細(xì)胞中的細(xì)胞膜以及線粒體發(fā)生變化，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，最終導(dǎo)致機(jī)體受損[12]。OFR可消耗大量的SOD,從而導(dǎo)致SOD的活性呈現(xiàn)一定程度的降低。在此研究中,對(duì)照組的小鼠血清中SOD和MDA含量的變化都可以證明氧自由基數(shù)量增多,從而驗(yàn)證了氧自由基是病毒性心肌炎的誘發(fā)因素之一[13]。由此可得，清除機(jī)體中的氧自由基對(duì)治療病毒性心肌炎具有重要意義。

中醫(yī)學(xué)無(wú)病毒性心肌炎的病名，但是根據(jù)此病的臨床癥狀可將其歸屬于“怔忡”“心悸”“溫病”等范疇，歷代名醫(yī)對(duì)于此病無(wú)明確定論，因此大多將其歸因于感受外邪[14]。金銀花早在秦漢時(shí)期的中藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中，就載有忍冬,稱其“凌冬不凋”。金銀花具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱功效?！侗静菥V目》載:“金銀花,善于化毒,故治癰疽、腫毒、瘡癬……”。自古以來(lái),金銀花常用于清熱解毒,治療溫病發(fā)熱,熱毒血痢,癰瘍等癥,亦用于風(fēng)熱感冒,支氣管炎等病癥[15]?，F(xiàn)代藥理研究表明,金銀花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱、調(diào)節(jié)等臨床作用。大量的臨床實(shí)踐和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明其有增強(qiáng)非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫的作用。因此,可為臨床應(yīng)用抗病毒感染治療提供理論依據(jù)，對(duì)病毒性心肌炎有明顯的治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)金銀花治療的各組小鼠的心肌病理減輕，促進(jìn)SOD活性的提高，與此同時(shí)MDA含量減少,有效地抑制了氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，利于病毒性心肌炎治療也為進(jìn)一步的探究奠定基礎(chǔ)。

大量研究顯示,SOD水平的下降以及MDA含量的上升是患有病毒性心肌炎的小鼠及患者機(jī)體之中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要表現(xiàn)。病毒侵入機(jī)體后使心肌細(xì)胞受損，從而產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基對(duì)細(xì)胞膜有重要的作用，其作用于高價(jià)不飽和酸會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，在此過(guò)程中機(jī)體發(fā)生氧化反應(yīng)使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生異變，最終也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生再次損傷。本文實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表明，金銀花對(duì)于病毒性心肌炎的治療效果取決于治療手段對(duì)氧自由基的抑制程度[14-15]。線粒體膜受到ROS的影響，ROS在機(jī)體中一方面受到氧化反應(yīng)較為直接，另一方面可通過(guò)Fas或者線粒體進(jìn)行調(diào)節(jié)較為間接。數(shù)據(jù)得出，金銀花可抑制氧自由基的活性從而防止氧化，避免病毒感染帶來(lái)的機(jī)體損傷。此外,數(shù)據(jù)比較顯示，應(yīng)用藥物組小鼠體內(nèi)的SOD水平明顯提高，MDA含量降低，說(shuō)明金銀花可抑制氧自由基從而抗氧化。金銀花可抵抗柯薩奇B組病毒感染，可調(diào)節(jié)患者機(jī)體中心肌細(xì)胞的SOD活性從而達(dá)到抑制氧自由基損傷的目的，是臨床治療病毒性心肌炎的重要生物藥劑。中醫(yī)方面也有越來(lái)越多的研究以及報(bào)道，其中單味藥大多是人參、黃芪，雜合其他中藥又可形成自制方藥，有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，防止心肌細(xì)胞受損的重要功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，金銀花具有明顯的體內(nèi)抑制CVB3作用。進(jìn)一步印證了金銀花對(duì)小鼠病毒性心肌炎抑制作用，為臨床應(yīng)用金銀花治療病毒性心肌炎提供理論依據(jù)，本研究使用的是金銀花單方制劑觀察的結(jié)果，但對(duì)于金銀花與其他藥物組成的復(fù)方制劑對(duì)于病毒性心肌炎的效果如何，有待近一步的深入研究。該研究順應(yīng)當(dāng)前臨床實(shí)踐的迫切需要，對(duì)于臨床應(yīng)用金銀花治療病毒性心肌炎，具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

[1] 楊英珍.病毒性心肌炎[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社.2000:229-332.

[2] 成建定,孫慧蘭,陳玉川,等.中醫(yī)藥抗病毒心骯炎的臨床與實(shí)踐研究進(jìn)展[J].黑龍江中醫(yī)藥,2002,15(2):250-252.

[3] 郭春風(fēng)，周亞濱，陳會(huì)君.病毒性心肌炎的中醫(yī)辨證施治[J].中醫(yī)藥信息，2014,31(6):109-111.

[4] 王艷華，樊蓉，陳會(huì)君，等.中醫(yī)藥治療慢性病毒性心肌炎的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2011,28(3):152-154.

[5] 李彥龍，趙嘉麗.二脈養(yǎng)心湯治療小兒病毒性心肌炎療效觀察[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43(4)：107-109.

[6] 王祥，田兆方.熱毒寧注射液治療小兒病毒性心肌炎臨床療效的隨機(jī)對(duì)照研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016，44(5)：98-102.

[7] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:202-203.

[8] Hiraoka Y,Kishimoto C,Kurokawa M,et al.Effects ofpolyethylene glycol conjugated superoxide dismutase oncoxsackievirus B3 myocarditis in mice[J].Cardiovasc Res,1992,26(10):956-961.

[9] Hiroshi Suzuki,Akira Matsumori,Yoshiki Matoba,et al.Enhanced expression of superoxide dismutase messenger RNA in viral myocarditis.An SH-dependent reduction ofits expression and myocardial injury[J].J Clin Invest,1993,91(5):2 727-2 733.

[10] Chen Peng,Zhou Junfu.Abnormal metabolism of nitricoxide,oxidative stress and lipoperoxidative stress in patientswith acute myocarditis[J].Chin Med J,2001,114(11):1 132-1 135.

[11] MILL ER AL.Botanical influences on cardiovascular disease[J].Altern Med Rev,1998,3(6):422-431.

[12] Melinda A Beck.Antioxidants and viral infections;host immune response and viral pathogenicity[J].J Am Coll Nutr,2001,20(5):384-388.

[13] Chen SZ,Fu YP,et al.Effects of schisanhenol on respiratory burst of rat peritonea,lneutrophils[J].Acta Pharm sin,2000,35(8):571-575.

[14] 王玉林,彭京洪,馬沛然,等.中藥芪芍五味合劑對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡和壞死的影響[J].山東醫(yī)藥,2002,42(22):16-19.

[15] 沈映君.中藥藥理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:283-288.

[16] Ye SF,Wu YH,Hou ZQ,et al.ROS and NF-kappaB are involved in upregulation of IL-8 in A549 cells exposed to multi-walled carbon nanotubes[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(2):643-648.

[17] Haddad JJ.Redox regulation of pro-inflammatory cytokines and IkappaB-alpha/ NF-kappaB nuclear translocation and activation[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,296(4):847-856.

Protective Effect of Honeysuckle on Viral Myocarditis in Mice and Its Mechanism

LOU Xu-sheng1,HU Jing-hong2,GE Dong-yu2,LU Wei-xing1

(1.DepartmentofCardiology,TheThirdHospitalAffiliatedBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.ResearchLaboratoryCenterofTraditionalChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To study the protective effect of honeysuckle on Coxsackie B3 (CVB3) in mice with viral myocarditis. Methods: BALB/c mice were randomly divided into a normal control group,a model group,a low dose group of honeysuckle,a high dose of honeysuckle, with oral administration for three weeks. In each group after CVB3 infection on the 7th,14th and 21st days take histopathological examination of heart,and at the same time respectively by xanthine oxidase method and thiobarbituric acid method measure the serum and myocardial superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content. Compare the measured value in the detection of mice according to muscle activity of SOD and MDA on the 7th 14th and 21st days.Results: In low dose and high dose groups mice activity was significantly higher than that of virus control group,and the content of MDA was significantly lower than that of the virus control group on the 14th and 21st days (P<0.05);in high dose group, low dose group on the twenty-first day the serum SOD activity and MDA content returned to normal; the mice were changed differently on the 7th, 14th and 21st days according to muscle tissue SOD activity and MDA. Inflammatory pathological changes of mice in each experimental group were reduced significantly. Conclusion: Honeysuckle can reduce the damage of oxygen free radicals of CVB3 infection mice,which has a protective effect on the myocardium of VM mice.

Honeysuckle;Viral myocarditis;Coxsackie virus infection;Oxygen free radical；Protective effect;Mechanism

2016-10-15

2016-12-28

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目(2011JYBZZJS-030)

婁序笙(1976-),女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向:心血管疾病的中西醫(yī)治療的研究。

*通訊作者：魯衛(wèi)星(1959-)，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向:中醫(yī)氣血痰瘀理論在心血管疾病中的應(yīng)用及中醫(yī)藥防治心血管疾病的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)01-0037-04