吳咚咚,李巖,張智龍

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300193)

針刺配合益智飲對血管性癡呆大鼠海馬組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

吳咚咚1,李巖2*,張智龍3

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300193)

目的：通過觀察醒神開竅針刺法配合益智飲對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響，以期從調(diào)控海馬組織細(xì)胞凋亡角度揭示其作用機(jī)制。方法：將成年SD大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、中藥組、針?biāo)幗Y(jié)合組和西藥組，每組6只。采用線栓法制成大鼠大腦中動脈梗塞血管性癡呆模型。針刺組給予醒神開竅法針刺治療，每日1次，每次30min，共治療8周；中藥組給予中藥益智飲灌胃治療，每日1次，每次2mL；針?biāo)幗Y(jié)合組同時(shí)給予針刺和中藥治療，方法同前；西藥組給予鹽酸多奈哌齊口服，療程同前。采用避暗法和穿梭箱法進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測試；采用免疫組化方法觀察大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果：避暗法和穿梭箱法結(jié)果表明，模型組大鼠潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)和電擊時(shí)間增多，與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和西藥組VD大鼠潛伏期有所延長，錯(cuò)誤次數(shù)和電擊時(shí)間也有所減少，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠潛伏期顯著延長，錯(cuò)誤次數(shù)和電擊次數(shù)均明顯減少，與針刺組、中藥組和西藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，模型組Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)增加，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)降低，與假手術(shù)組比較具有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比，治療后針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組Bax的表達(dá)降低，Bcl-2的表達(dá)增加，差異顯著(P<0.05)。與針刺組、中藥組和藥物組比較，治療后針?biāo)幗MBax的表達(dá)降低，Bcl-2的表達(dá)增加，差異顯著(P<0.05)。結(jié)論：針刺配合益智飲治療能夠顯著改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。

血管性癡呆；醒神開竅針刺法；益智飲；細(xì)胞凋亡

血管性癡呆(VascularDementia，VD)是指由缺血性或出血性腦卒中所致腦區(qū)低灌注而引起的嚴(yán)重認(rèn)知及記憶行為等功能障礙癥候群[1]。目前，對于VD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究較多的主要包括膽堿能機(jī)制、氨基酸損傷機(jī)制、自由基損傷機(jī)制和神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制等[2-3]。細(xì)胞凋亡是生物界細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是區(qū)別于細(xì)胞壞死的一種特殊死亡形式，在外界生理或病理因素誘導(dǎo)下可啟動程序基因調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞會按照一定的程序控制而自我死亡[4]。細(xì)胞凋亡在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及生物體多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡是缺氧缺血過程中神經(jīng)元損傷的一種形式，細(xì)胞凋亡與臨床上很多疾病的發(fā)生有關(guān)[5]，細(xì)胞凋亡機(jī)制在血管性癡呆研究中越來越受到重視[6]。

面對血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚不明確，并且治療藥物療效尚不確切、不良反應(yīng)多的難題，運(yùn)用針灸和中藥治療血管性癡呆越來越受到人們的關(guān)注[7-11]，針灸和中藥治療血管性癡呆的優(yōu)勢和特色在于不僅可以顯著改善臨床癥狀，而且不良反應(yīng)少，然而其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過建立血管性癡呆大鼠模型，觀察不同治療方法對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，有望闡明針刺配合益智飲治療血管性癡呆的子生物學(xué)作用機(jī)制，同時(shí)也為中醫(yī)藥方法治療血管性癡呆提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(220±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(動物合格證號SCXK(黑)2008004)。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠分成6組，分別為假手術(shù)組、模型組、針刺組、中藥組、針?biāo)幗Y(jié)合組、西藥組，每組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

西門子電冰箱(KK26U79TI型，德國西門子)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH.B11-360型，上海躍進(jìn))，電熱恒溫干燥箱(GZX-DH400型，上海躍進(jìn))，全自動石蠟切片機(jī)(HM355S型，德國美康)，OLYMPUS顯微鏡(BX-60型，日本奧林巴斯)；避暗箱(YLS-17B，安徽省淮北市正華科技有限公司)；穿梭箱(ZH-CSC型，安徽省淮北市正華科技有限公司生產(chǎn))。

1.3 藥品及試劑

Bcl-2，Bax多克隆抗體試劑盒(武漢博士德)，生物素化山羊抗兔IgG(A0277，中國碧云天)，辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素(A0303，中國碧云天)，無水乙醇(10009218，中國國藥)，山羊血清(SL2-10，中國Solarbio)，過氧化氫(10011218，中國國藥)；益智飲由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，根據(jù)自擬方，將藥物用雙蒸水經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)制備成濃度為 2.5mg/L的混懸液，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?，用前搖勻。鹽酸多奈哌齊(安理申)，規(guī)格：5mg/片(衛(wèi)材)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 線栓及線栓頭端的處理

將直徑 0.24mm的尼龍線剪成5cm左右的小段，均勻地涂上一層聚胺酯在尖端3mm長度在60～70℃加熱使線段軟化，制作成切角約為20度左右的弧形(為了保證頭端圓潤)，頭端快速燒灼熔化成球形，然后一端用細(xì)砂紙顯微鏡下打磨，并用75%的酒精浸泡處理備用。在尖端3mm長度蘸上一層聚胺酯后倒垂，待頭端凝固成球形，保持頭端直徑均為 0.30mm，在距打磨端18、19、20mm處用黑色記號筆做上標(biāo)記。

1.4.2 模型制備

采用改良Longa線栓法[12]，麻醉以10%水合氯醛(3.5mg/kg)，常規(guī)術(shù)區(qū)消毒，在頸部右側(cè)旁正中做切口，逐層分離，充分暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，并于CCA掛手術(shù)線備用同時(shí)在頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)處掛線，分離暴露ECA主干，在其根部打結(jié)并采用小動脈夾夾閉CCA近心端，夾閉ICA在CCA近頭端距分叉部5mm處斜行剪一小口,導(dǎo)入線栓進(jìn)入ICA移開夾在ICA的小動脈夾，將線栓插入至設(shè)計(jì)深度，注意標(biāo)記的深度，遇阻力停止插入，結(jié)扎切口處CCA掛線，去除CCA的小動脈血管夾同時(shí)確認(rèn)無出血后縫合皮膚，皮膚外留線頭約0.5cm，術(shù)后2h抽出線栓。假手術(shù)對照組大鼠除不用栓線栓塞外其余處理同實(shí)驗(yàn)組。

1.4.3 動物分組

由于手術(shù)過程死亡1只，因手術(shù)導(dǎo)致大鼠無任何自發(fā)活動的1只。余大鼠通過體質(zhì)量隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組，模型組，針刺組，中藥組，針?biāo)幗Y(jié)合組，西藥組，每組各10只。

1.4.4 動物治療

假手術(shù)組:術(shù)后與其它各組同等條件下飼養(yǎng)，給予生理鹽水2mL每日灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其余未經(jīng)任何治療。

模型組:術(shù)后與其它各組同等條件下飼養(yǎng)，給予生理鹽水2mL每日灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其余未經(jīng)任何治療。

針刺組:醒神開竅針法選穴：神庭、百會。針具和皮膚常規(guī)消毒，選用安迪牌0.25mm×25mm的毫針，快速進(jìn)針，每日1次，每次留針40min，連續(xù)治療8周。

中藥組:口服益智飲(自擬方)：黃芪50g，山茱萸15g，制首烏50g，肉桂10g，熟地黃15g，遠(yuǎn)志15g，石菖蒲10g，川芎15g，竹茹10g，酸棗仁30g，甘草10g。用法及用量每只大鼠每次益智飲制劑灌胃2mL，每日2次。共治療8周。

針?biāo)幗M:給予針刺和中藥聯(lián)合治療，療程同上。

西藥組:按體質(zhì)量1mg/(kg·d)鹽酸多奈哌齊溶于2mL生理鹽水中每日兩次灌胃。共治療8周。

各組大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只，保證動物飼養(yǎng)室溫度為21～24℃，室內(nèi)濕度50%～70%，12h交替照明，自由進(jìn)食和飲水[13]。

1.4.5 動物取材

動物行為學(xué)觀察后，用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5mg/kg)，迅速開胸，暴露心臟，將注射器針頭快速插入左心室，固定針頭后緩慢注入生理鹽水，大約注入200mL后可出現(xiàn)清澈透亮的液體自右心耳流出，接著用注射器緩慢注入4%多聚甲醛溶液，約100～200mL后可見大鼠四肢抽搐，皮膚、肺臟、肝臟及眼瞼變白，迅速斷頭，自前囟處打開顱骨，取出完整大腦，在冰盒上迅速取出海馬組織，置于備好的裝有4%多聚甲醛溶液的瓶中固定，然后將海馬組織保存于4℃冰箱中備用。每組取材6只。

1.4.6 免疫組織化學(xué)染色法

用振蕩切片機(jī)將組織塊行連續(xù)冠狀切片，層厚5μm；將組織切片用0.01MPBS漂洗30min×2；組織用濾紙吸干后，用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液在室溫下封閉10min，再用0.01MPBS漂洗5min×3；將腦組織切片置于0.3%Triton-100中30min；用山羊血清封閉液封閉1h。封閉用正常羊血清工作液封閉1h；用0.01MPBS將一抗稀釋為1∶100比例，將組織切片置于一抗稀釋液中4℃過夜；用0.01MPBS漂洗5min×3，以去除殘留的一抗稀釋液；加入二抗工作液，室溫下置于水平搖床上2h；用0.01MPBS漂洗5min×3，以去除殘留的二抗工作液；加入辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈酶親和素，室溫下孵育1h；將組織切片按照DAB顯色液使用說明書依次加入顯色液，待其變?yōu)樽攸S色后，放入蒸餾水中終止反應(yīng)，然后將組織切片置于清潔的載玻片上，濾紙吸干；經(jīng)梯度酒精脫水，并二甲苯溶液透明后，用明膠封片；每組選擇6只大鼠取材，每只大鼠海馬組織選擇3張切片，在400倍鏡下隨機(jī)選擇連續(xù)5個(gè)視野，分別計(jì)算每個(gè)視野中的Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測

避暗法檢測結(jié)果表明，模型組大鼠潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增多，與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和西藥組VD大鼠潛伏期有所延長，錯(cuò)誤次數(shù)有所減少，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠潛伏期顯著延長，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，與針刺組、中藥組和西藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。

穿梭箱法檢測結(jié)果表明，模型組大鼠電擊次數(shù)增多，電擊時(shí)間延長，主動回避次數(shù)減少，與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和西藥組VD大鼠電擊次數(shù)減少，電擊時(shí)間縮短，主動回避次數(shù)增多，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠電擊次數(shù)顯著減少，電擊時(shí)間明顯縮短，主動回避次數(shù)顯著增多，與針刺組、中藥組和西藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，針?biāo)幗Y(jié)合能夠改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，療效優(yōu)于針刺組、中藥組、和西藥組。詳見表1，表2。

表1 避暗法觀察不同治療組對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針刺組、中藥組和西藥組比較，#P<0.05

表2 穿梭箱法觀察不同治療組對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針刺組、中藥組和西藥組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

2.2.1 各組大鼠海馬組織Bax的表達(dá)

結(jié)果顯示，Bax蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)。假手術(shù)組無明顯Bax陽性表達(dá)，模型組Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)增加，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。與模型組相比，治療后針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組Bax的表達(dá)降低，差異顯著(P<0.05)。與針刺組、中藥組和藥物組比較，治療后針?biāo)幗MBax的表達(dá)降低，差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組均能抑制腦組織海馬區(qū)Bax的表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，但針?biāo)幗M的治療優(yōu)勢更加明顯，療效顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織bax蛋白表達(dá)情況注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針刺組、中藥組和西藥組比較，#P<0.05

2.2.2 各組大鼠海馬組織Bcl-2的表達(dá)

結(jié)果顯示，Bcl-2 蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于核膜或胞漿內(nèi)。假手術(shù)組未見明顯Bcl-2表達(dá)，模型組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)降低，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。與模型組相比，治療后針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組Bcl-2的表達(dá)增加，差異顯著(P<0.05)。與針刺組、中藥組和藥物組比較，治療后針?biāo)幗MBcl-2的表達(dá)增加，差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組均能促進(jìn)腦組織海馬區(qū)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，尤以針?biāo)幗M療效更加顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織bcl-2蛋白表達(dá)情況注:與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針刺組、中藥組和西藥組比較，#P<0.05

3 討論

血管性癡呆屬中醫(yī)學(xué)“呆病”“健忘”范疇[14]。本病病位在腦，涉及五臟，尤與心、肝、脾、腎有關(guān)，病變多見虛實(shí)夾雜證。本病起因于中風(fēng)，而中風(fēng)多發(fā)于中、老年人，《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“年四十而陰氣自半也，起居衰矣?！蹦I精虧虛是中風(fēng)發(fā)病的根本，腎為先天之本，主骨生髓，而腦為髓海，元神之府。正如《醫(yī)林改錯(cuò)·腦髓說》曰：“年高無記憶者，腦髓漸空；年高腎虧髓海空虛，發(fā)為呆病”，由此可見，腎精不足，大腦失養(yǎng)，靈氣不通則出現(xiàn)意識模糊、神情呆滯、精神抑郁、語無倫次、遇事多忘、頭目不清、喃喃獨(dú)語、不思飲食等癥。百會是諸多經(jīng)脈的交會穴、諸陽之會，針刺百會有醒神益智、填髓充腦的功效[15]；神庭穴為督脈要穴，并與足太陽經(jīng)相交，可以治療一切神志病癥。血管性癡呆中醫(yī)防治以補(bǔ)腎益精為主，活血袪瘀為輔，并且重視疏肝解郁法在治療血管性癡呆中的重要地位。益智飲湯藥可以補(bǔ)腎活血，益精補(bǔ)腦，醒神益智：黃芪與黨參兩者能夠補(bǔ)氣健脾；熟地、山茱萸補(bǔ)腎滋陰、益髓填精；炙首烏和酸棗仁能夠補(bǔ)精益血，從而益智健腦；遠(yuǎn)志、石菖蒲、竹茹均能祛痰開竅，遠(yuǎn)志還有益智安神之效；肉桂一味能夠溫通經(jīng)脈，使氣血運(yùn)行；川芎活血化瘀兼具行氣之功效，配合甘草調(diào)和諸藥，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎填精健腦之功效。

避暗法的原理是利用小鼠或大鼠具有趨暗避明的習(xí)性設(shè)計(jì)的裝置，一半是暗室，一半是明室，中間有一小洞相連，暗室底部鋪有通電的銅柵，動物進(jìn)入暗室即受到電擊。計(jì)算機(jī)自動記錄動物進(jìn)入暗箱的潛伏期(s)和5min內(nèi)被電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。將小鼠放在暗箱，給予0.4mA電擊，持續(xù)5s，電流強(qiáng)度為能夠引起小鼠發(fā)聲和退縮的最小電流，將小鼠放回籠內(nèi)，清潔操作箱，進(jìn)行下一只的訓(xùn)練，1h后重復(fù)訓(xùn)練1次。避暗潛伏期不足60s的，1h后重復(fù)訓(xùn)練1次，仍不達(dá)標(biāo)的，淘汰。24h后進(jìn)行測試，記錄5min小鼠從明區(qū)到暗區(qū)的潛伏期和達(dá)到回避標(biāo)準(zhǔn)的動物數(shù)。穿梭箱法是利用計(jì)算機(jī)自動記錄動物電擊次數(shù)，電擊時(shí)間和主動回避次數(shù)。該裝置由實(shí)驗(yàn)箱和自動記錄裝置組成。箱底部由一擋板分成左右兩側(cè)，箱頂部有光源控制器。訓(xùn)練時(shí)將大鼠放在其中一側(cè)，20s之后打開光源，持續(xù)5s后打開電流刺激，共刺激10s，使大鼠逃離至另一側(cè)，通過多次訓(xùn)練使大鼠形成條件反射。在實(shí)驗(yàn)記錄前3天開始，給予大鼠每日1次的訓(xùn)練，共訓(xùn)練3次后開始記錄大鼠遭受電擊次數(shù)，遭受電擊的總時(shí)間和逃避潛伏時(shí)間，以此來反映大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。本研究避暗法檢測結(jié)果表明，模型組大鼠潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增多，與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和西藥組VD大鼠潛伏期有所延長，錯(cuò)誤次數(shù)有所減少，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠潛伏期顯著延長，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，與針刺組、中藥組和西藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。穿梭箱法檢測結(jié)果表明，模型組大鼠電擊次數(shù)增多，電擊時(shí)間延長，主動回避次數(shù)減少，與假手術(shù)組相比具有顯著差異(P<0.05)；針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和西藥組VD大鼠電擊次數(shù)減少，電擊時(shí)間縮短，主動回避次數(shù)增多，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針?biāo)幗M大鼠電擊次數(shù)顯著減少，電擊時(shí)間明顯縮短，主動回避次數(shù)顯著增多，與針刺組、中藥組和西藥組相比，療效更加顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，針?biāo)幗Y(jié)合能夠改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，療效優(yōu)于針刺組、中藥組、和西藥組。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的程序性細(xì)胞死亡[16]，Bcl-2蛋白家族是目前研究發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控神經(jīng)元凋亡的基因中發(fā)揮著至關(guān)重要作用的一類[17]。Bcl-2家族根據(jù)其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用不同，又可以分為兩類：一類是以Bcl-2基因?yàn)榇淼目辜?xì)胞凋亡基因；另一類是以Bax基因?yàn)榇淼拇偌?xì)胞凋亡基因。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2表達(dá)升高，則細(xì)胞凋亡被抑制，而Bax表達(dá)增高，則發(fā)揮促凋亡作用，因此推測Bcl-2和Bax兩者在體內(nèi)表達(dá)水平的高低與凋亡調(diào)控具有直接關(guān)系[18]。本研究結(jié)果顯示，Bax蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)。假手術(shù)組無明顯Bax陽性表達(dá)，模型組Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)增加，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。與模型組相比，治療后針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組Bax的表達(dá)降低，差異顯著(P<0.05)。與針刺組、中藥組和藥物組比較，治療后針?biāo)幗MBax的表達(dá)降低，差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組均能抑制腦組織海馬區(qū)Bax的表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，但針?biāo)幗M的治療優(yōu)勢更加明顯，療效顯著。Bcl-2蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于核膜或胞漿內(nèi)。假手術(shù)組未見明顯Bcl-2表達(dá)，模型組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)降低，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。與模型組相比，治療后針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組Bcl-2的表達(dá)增加，差異顯著(P<0.05)。與針刺組、中藥組和藥物組比較，治療后針?biāo)幗MBcl-2的表達(dá)增加，差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，針刺組、中藥組、針?biāo)幗M和藥物組均能促進(jìn)腦組織海馬區(qū)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，尤以針?biāo)幗M療效更加顯著。

綜上所述，針刺配合益智飲治療能夠顯著改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。

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Effect of Acupuncture Combined with Yizhi Decoction on the Expression of Bcl-2 and Bax Protein in Hippocampus of Vascular Dementia Rats

WU Dong-dong1，LI Yan2，ZHANG Zhi-long3

(1.TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;3.TianjinAcademyofTraditionalChineseMedicineAffiliatedHospital,Tianjin300193,China)

Objective: To observe the effect of Xingshen Kaiqiao acupuncture plus Yizhi decoction on the learning and memory ability and related factors of hippocampus tissue apoptosis in VD rats, in order to reveal the mechanism on the regulation of hippocampus cell apoptosis. Methods: Adult SD rats were randomly divided into a sham operation group,a model group,an acupuncture group,a Chinese medicine group,an acupuncture and drug combination group and a western medicine group,with 6 rats in each group. Rat models with vascular dementia were induced by middle cerebral artery occlusion. The acupuncture group was given acupuncture treatment of Xingshen Kaiqiao acupuncture, 1 time daily, 30 minutes each time, a total of 8 weeks for the treatment; traditional Chinese medicine group was given intragastric administration of Yizhi decoction, 1 time daily, 2 mL each time; at the same time acupuncture and Chinese medicine therapy was given in the acupuncture combined with medicine group;the western medicine group was given Donepezil. The learning and memory ability was tested by the method of dark avoidance and shuttle box method. The expressions of Bcl-2 and Bax protein in hippocampus of rats were observed by immunohistochemistry. Results: Dark avoidance test and shuttle box test showed that the latency of the rats in the model group was shortened and error times and shock time were increased.Compared with the sham operation group there was a significant difference (P<0.05);in the acupuncture group, Chinese medicine group, acupuncture group and western medicine group VD rats were prolonged,and the error number and electric shock time were also reduced. Compared with the model group, the difference was statistically significant (P<0.05). Rats in the acupuncture group were significantly prolonged,and the number of errors and the number of shocks were significantly reduced.Compared with the acupuncture group, Chinese medicine group and western medicine group, the effect was more significant (P<0.05). The results of immunohistochemistry showed that the number of Bax positive cells in model group was increased; the number of Bcl-2 positive cells was decreased, and there was a significant difference between the model group and the sham operation group (P<0.05). Compared with the model group, the expressions of Bax in the acupuncture group, the traditional Chinese medicine group, the acupuncture group and the medicine group after treatment were decreased, but the expressions of Bcl-2 were increased significantly (P<0.05). Compared with the acupuncture group, the traditional Chinese medicine group and the medicine group, the expression of Bax was decreased,but the expression of Bcl-2 was significantly increased in the acupuncture group (P<0.05). Conclusion: Acupuncture combined with Yizhi decoction can significantly improve the cognitive function of vascular dementia rats.Its mechanism may be through upregulation of Bcl-2 and downregulation of Bax protein expression to inhibit the apoptosis of nerve cells.

Vascular dementia; Xingshen Kaiqiao acupuncture; Yizhi decoction; Apoptosis

2016-11-29

2016-12-30

黑龍江中醫(yī)管理局項(xiàng)目(ZHY12-Z053)

吳咚咚(1983-)，男，博士研究生，研究方向：針灸防治腦血管疾病。

*通訊作者：李巖(1963-)，女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事針灸臨床工作。

R245.3;R

A

1002-2392(2017)01-0031-06