王文凱，張賀，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

生、炒酸棗仁相伍對慢性應激抑郁癥小鼠DA系統作用機制研究

王文凱，張賀，李廷利*

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:探討生、炒酸棗仁相伍對慢性應激抑郁模型小鼠的抗抑郁作用及對多巴胺(DA)系統作用的影響。方法：將80只ICR小鼠隨機分為4組：相伍組、模型組、空白組和百憂解組。每組20只。抑郁癥模型的復制采取單籠結合慢性應激刺激的方法。第11天起，相伍組和百憂解組灌胃給藥(生、炒酸棗仁合煎液10 g/(kg·d)，百憂解10 mg/(kg·d)，空白組和模型組給予同體積蒸餾水。連續(xù)11天。ELISA法測定小鼠海馬和額葉DA含量，熒光定量PCR法測定小鼠海馬DA轉運體編碼基因Slc6a3的基因表達量。結果：與模型組相比，相伍組小鼠海馬DA含量顯著升高(P<0.05)，相伍組小鼠海馬DA轉運體編碼基因Slc6a3基因表達量顯著下調。結論：生、炒酸棗仁相伍抗抑郁作用機制可能與抑制小鼠部分腦區(qū)DA再攝取，增加突觸內DA含量有關。

生、炒酸棗仁相伍；慢性應激抑郁模型；DA

酸棗仁具有補肝、養(yǎng)心、安神的功效。酸棗仁生品、炒品均可入藥，實驗研究表明有抗抑郁作用[1-3]。酸棗仁常以生、炒各半藥對的形式在臨床應用。前期我們通過實驗發(fā)現生、炒酸棗仁相伍(10 g/kg·d)對小鼠游泳應激和小鼠懸尾應激兩種抑郁癥模型有顯著的抗抑郁作用[4-5]。本文觀察生、炒酸棗仁相伍對小鼠慢性應激抑郁模型中樞DA能神經系統的作用，進一步闡明生、炒酸棗仁相伍對抗抑郁癥的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性ICR小鼠，體質量20～24 g，來源于黑龍江中醫(yī)藥大學GLP中心，許可證號: 黑動字第P00700619。

1.2 實驗藥物

受試藥物：生、炒酸棗仁合煎液，稱取生棗仁和炒棗仁粗粉(1∶1)，8倍蒸餾水浸泡1 h，煎煮2次，每次30 min，將兩濾液合并后，濃縮，制成生藥量2 g/mL的原液，臨用前稀釋，制成濃度為0.4 g/mL的溶液。

陽性對照藥：百憂解(禮來公司，J20080016，20 mg/片)，使用時配制成濃度為0.4 mg/mL的混懸液。

1.3 實驗儀器及試劑

儀器：TST-100小鼠懸尾儀(成都泰盟)；DHG-9013A鼓風干燥箱(上海滬粵明科學儀器有限公司)；酶標儀(Anthos 2010，Anthos Labtec Instruments)；9700PCR反應擴增儀(ABI公司)；StepOne熒光定量PCR儀(ABI公司)；凝膠成像系統(上海復日科技有限公司)。

試劑：小鼠DA(20131002A)酶聯免疫試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)；第一鏈cDNA合成試劑盒(批號：SK2445)；UNIQ-10柱式Trizol 總RNA抽提試劑盒(批號：SK1321)。

1.4 方法

1.4.1 抑郁癥模型的復制

采取單籠飼養(yǎng)結合慢性輕度應激刺激的方式，復制小鼠慢性應激抑郁模型[6]。實驗動物均單籠飼養(yǎng)，連續(xù)施予21天的應激刺激，刺激因子包括：斷食、斷水、冷水游泳、懸尾、夾尾尖、45℃熱刺激、持續(xù)光照。刺激因子在21天內隨機分配，每日1種。

1.4.2 分組及給藥

動物隨機分為相伍組、百憂解組、空白組、模型組共4組，每組20只。空白組除外，另外3組進行造模。

造模第11天開始，在每次刺激前1 h，灌服相應液體：相伍組：生、炒酸棗仁合煎劑(10 g/kg)，百憂解組：百憂解(10 mg/kg)，模型組、空白組：同體積蒸餾水，1次/日，給藥至造模結束。

1.4.3 檢測小鼠額葉、海馬DA含量

造模結束當天，于給藥后1 h，隨機選取10只小鼠剪頭，冰浴迅速剝離腦部，分出海馬、額葉皮質部分，ELISA法測定兩個腦區(qū)的DA濃度。

1.4.4 檢測小鼠海馬Slc6a3基因表達

造模結束當天，于給藥后1 h，隨機選取5只小鼠，小鼠剪頭，冰浴迅速剝離腦部，分出海馬部分，保存于液氮中，熒光定量PCR法檢測Slc6a3基因表達量。

總RNA提?。喊碪NIQ-10柱式Trizol 總RNA抽提試劑盒操作說明提取海馬總RNA，用紫外分光光度計檢測其純度、濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

逆轉錄:按照第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄反應試劑盒說明書操作，將總RNA樣品進行逆轉錄得到cDNA樣品。并用滅菌去離子水代替模板作為陰性對照。

熒光定量PCR反應采用ABI SybrGreen PCR Master Mix試劑，在StepOne型熒光定量PCR儀(ABI)上進行PCR反應，總體積20 μL。 95 ℃ 10 s和60 ℃ 40 s擴增40個循環(huán), 應用18SRNA作為內參照基因,其引物委托上海英拜生物有限公司合成。序列如下：Gapdh：上游，5′GTTGTCTCCTGCGACTTCA 3′，下游，5′TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 3′，長度，183bp；Slc6a4：，上游，5'CCTTCCCTTACATTGTCCTTTCT 3′，下游，5′GTTTCTGCCAGTTGGGTTTC 3′，長度，102bp；Htr1a：上游，5'GGACCCTTCCTGTTCACTCAATA 3′，下游，5′GCCAAAGACCGAGCCAATA 3′，長度，198bp。

對擴增的Slc6a3進行SYBR熔解曲線分析，每樣本作3個復孔,得各組Ct平均值。

ΔCt處理組= Ct處理組目的基因-Ct處理組內參, ΔCt對照組=Ct對照組目的基因-Ct對照組內參, ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組,對照組ΔΔCt為0，2-△△Ct值為1，各目的基因的2-△△Ct值與1比較，得出相對數即為基因的相對表達量。

1.5 統計分析

所有數據采用SPSS17.0軟件進行分析。兩組間比較采用q檢驗，以P<0.05，P<0.01分別表示差異顯著和差異極顯著。

2 結果

2.1 生、炒酸棗仁相伍對小鼠海馬、額葉皮質DA及代謝的影響

海馬DA含量：模型組與空白組相比，DA含量顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與模型組相比，相伍組和百憂解組DA含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

額葉皮質DA含量：模型組與空白組相比，DA含量顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，相伍組DA含量比值無顯著變化，百憂解組DA含量有所增加(P<0.05)。見表1。

表1 生、炒酸棗仁相伍對小鼠海馬、額葉皮質DA含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

2.2 小鼠海馬Slc6a3基因含量變化

Slc6a3基因的擴增曲線和融解曲線見圖1。

圖1 Slc6a3基因擴增曲線和融解曲線

2-ΔΔCT代表各基因的相對表達量，比較發(fā)現，模型組Slc6a3基因表達量較空白組顯著升高，兩個用藥組和模型組對比發(fā)現，相伍組、百憂解組Slc6a3基因表達量與模型組相比顯著下調。見表2。

表2 Slc6a3基因相對表達量(以空白組為參照)

3 討論

海馬和額葉作為執(zhí)行情緒和認知的腦區(qū)，與抑郁癥的發(fā)生密切相關[7]，海馬在情緒的控制和反應中擔當重要角色，并且很容易收到應激損傷。影像學資料顯示，抑郁癥患者的海馬不同程度萎縮變小[8]。另有研究顯示，抑郁癥患者額區(qū)較小，患者表現出的認知功能下降，自我評價低，精神運動遲滯等行為與此有密切關聯[9]。本實驗采用單獨飼養(yǎng)結合慢性應激刺激的方式建立抑郁癥小鼠模型，該模型是抗抑郁藥物研究的常用模型。我們在前期的實驗中，已經發(fā)現造模21天后小鼠的糖水消耗百分比、體重與空白組比較明顯降低，曠場行為學參數也發(fā)生顯著變化，表現為自發(fā)活動減少，說明該模型很好的模擬了抑郁癥的典型表現如快感缺乏，動機缺失，精神運動能力下降等癥狀。而這些表現很可能是腦內DA系統功能下降的結果[10]。動物實驗表明，抑郁癥動物模型海馬和額葉皮質DA水平低于正常對照組[11-12]，臨床研究也證實抑郁癥患者腦脊液中DA水平顯著低于正常人群[13]。很多抗抑郁藥物能夠增加腦內DA含量而起到抗抑郁作用，如氟西汀能夠顯著提高前額葉皮質內DA濃度[14]。本實驗通過檢測小鼠海馬和額葉皮質DA含量來觀察生、炒酸棗仁相伍抗抑郁的作用是否與改善腦內DA能系統有關。實驗結果表明，模型組海馬和額葉皮質內DA含量均低于空白組，提示小鼠腦內DA生成不足，系統功能減退[15]。也證實了小鼠抑郁行為與腦內DA的改變存在一定聯系。相伍組海馬DA含量顯著高于模型組，提示生、炒酸棗仁相伍能夠提高腦內DA含量，增強DA遞質系統功能，從而緩解小鼠抑郁狀態(tài)。額葉皮質的DA含量沒有顯著增加，說明藥物只作用于部分腦區(qū)的DA系統。百憂解組海馬和額葉皮質DA含量均顯著高于模型組，這與以往的報道類似[14]。

在多巴胺神經突觸前膜上有一種能夠調控DA濃度的跨膜轉運蛋白，即多巴胺轉運體。多巴胺轉運體在DA發(fā)揮作用后，能夠再攝取突觸間隙內的DA而終止DA的作用[16]，多巴胺基因表達上調能導致突觸間隙內DA濃度下降，可能引發(fā)抑郁癥。藥物成癮、帕金森病患者DA轉運體表達上調，而這些病常常有抑郁癥表現[17-18]。為證實海馬DA含量增加是否與多巴胺轉運體基因表達變化有關，經過熒光定量PCR檢測，結果發(fā)現模型組海馬Slc6a3基因表達上調，相伍組和百憂解組Slc6a3表達下調，提示慢性應激可能引起DA轉運體基因表達增加，突觸內被重攝取的DA增加，突觸間隙內的多巴胺濃度下降，而生、炒酸棗仁相伍和百憂解均能夠提高中樞的DA含量，其作用可能與藥物降低突觸前膜DA轉運體的基因表達，減少DA再攝取，增加突觸內DA含量有關。

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Mechanism of Compatibility of SZS and Its Processing on Dopaminergic System of Chronic Stress Depression Mice

WANG Wen-kai,ZHANG He,LI Ting-li

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To explore the antidepressant effect and the influence of compatibility of SZS and its processing on dopamine system of chronic stress depression mice. Methods:The ICR mice were randomly divided into four groups,with 20 mice in each group, respectively, compatibility group, model group, blank group and fluoxetine group. The chronic stress depression models were duplicated by the combination of solitary feeding and chronic unpredictable stimulation for 21 days. From the 11th day after the models were established, the mice in compatibility group and model group were respectively treated with 10 g/(kg·d) of combined fried decoction and 10 mg/(kg·d) of fluoxetine solution for 11 days. The blank and model groups were treated with the same volume of distilled water for 11 days. Detect 5-HT content by ELISA of cortex in frontal lobe and hippocampus of mice.Detect Slc6a3 gene expression quantity in hippocampus of mice. Results:Compared with that of model group, the DA content in mice hippocampus of compatibility group was significantly higher (P<0.05), and the Slc6a3 gene expression quantity in mice hippocampus of compatibility group was significantly down-regulated.Conclusion: The mechanism of antidepressant effect of compatibility of SZS and its processing may be related to the inhibition of DA reuptake leading to the incease of synaptic DA content in some brain regions of mice.

Compatibility of SZS and its processing; Chronic stress depression models;DA

2016-09-18

2016-10-15

國家自然科學基金項目(81274114)；黑龍江省自然科學基金項目(H201471)

王文凱(1980-)，女，博士研究生，副研究館員，主要研究方向:安神藥物抗抑郁作用機理研究。

*通訊作者：李廷利(1957-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向:中藥改善睡眠作用及機制研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)01-0021-04