伍佰鑫 張翠永 李 晟 羅 陽(yáng) 浣 成 樊志堅(jiān)

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410131)

一般來(lái)說(shuō)，反芻動(dòng)物可將20%～30%日糧中的氮轉(zhuǎn)化為機(jī)體蛋白，大約70%～80%的氮以尿和糞的形態(tài)排泄掉。蛋白質(zhì)是一種昂貴的養(yǎng)分，受經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的影響。此外，過(guò)量的氮排泄到大氣、土壤和地下水中，對(duì)環(huán)境有害。肉牛生產(chǎn)者為了讓肉?？扉L(zhǎng)和增膘，經(jīng)常飼喂較多的精飼料，特別是在日糧中添加大量的豆餅、花生餅、大豆等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料，不僅造成飼料浪費(fèi)、增加飼料成本，而且給肉牛胃腸增加負(fù)擔(dān)，甚至引起疾病。但如果添加少了，就不能滿足肉牛生長(zhǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的需要，影響育肥效果和經(jīng)濟(jì)效益。肉牛飼料中蛋白質(zhì)含量多少為適宜，已成為肉牛生產(chǎn)面臨的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。最近，美國(guó)內(nèi)華達(dá)州大學(xué)的Paloma de Melo Amaral和巴西維科沙大學(xué)的Lays Débora Silva Mariz等學(xué)者運(yùn)用先進(jìn)的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)、用發(fā)酵罐模擬瘤胃，對(duì)肉牛10%～14%蛋白質(zhì)含量的日糧進(jìn)行了研究，其研究方法和結(jié)果值得肉牛生產(chǎn)者和研究者參考。

1 材料和方法

在連續(xù)4個(gè)階段、每個(gè)階段持續(xù)12 d(其中8 d為日糧適應(yīng)期、4 d為樣本采集期)，使用8個(gè)雙流量連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵罐(1223±21 mL)。采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)、4個(gè)處理和4個(gè)階段，每個(gè)處理總共8個(gè)重復(fù)。日糧處理包括：①靜態(tài)的10%粗蛋白日糧(簡(jiǎn)稱10%CP)、②靜態(tài)的12%CP日糧(簡(jiǎn)稱12%CP)、③靜態(tài)的14%CP日糧(簡(jiǎn)稱14%CP)、④每48小時(shí)在10%CP和14%CP之間振蕩的日糧(簡(jiǎn)稱10%～14%振蕩)。日糧(干物質(zhì))由50%的果園干草和50%的精飼料組成，日糧的配方和營(yíng)養(yǎng)組成(根據(jù)NRC標(biāo)準(zhǔn))詳見(jiàn)表1。

2頭接有瘤胃瘺管的安格斯肉牛(平均體重785 kg)，早晨飼喂前2 h，從瘤胃的腹部、中部和背部區(qū)域收集瘤胃液，立即通過(guò)四層紗布過(guò)濾，將過(guò)濾后大約10 L的瘤胃液轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室事先預(yù)熱的保溫瓶(39 ±0.5℃)中。瘤胃液均質(zhì)化后，注入氮?dú)?N2)以維持厭氧環(huán)境，將事先水浴預(yù)熱的5 000 mL錐形燒瓶淹沒(méi)其中，并將溫度調(diào)整到39。每個(gè)發(fā)酵罐倒入大約1 250 mL的瘤胃液，直至溢出物被清除干凈(圖1)。維持溫度為39°C并將氮?dú)?40 mL/min)注入發(fā)酵罐以維持厭氧環(huán)境。添加尿素到人工唾液中以模擬氮回收。每個(gè)發(fā)酵罐用單個(gè)的pH計(jì)(Cole-Parmer pH controllers，Model 5997-20)監(jiān)控pH值。中間由磁鐵驅(qū)動(dòng)的螺旋槳以150 rpm的速率不斷攪拌發(fā)酵罐的內(nèi)容物。通過(guò)調(diào)整人工唾液灌注和過(guò)濾液流，將固體和液體的稀釋率分別調(diào)整為5.5和11%/h。以2.1 mL/min的速率不斷灌注人工唾液，每天2次測(cè)定其連貫性。

表1 試驗(yàn)日糧的原料和化學(xué)組成

備注：CP-粗蛋白質(zhì)、DM-干物質(zhì)、OM-有機(jī)物、NDF中性洗滌纖維、EE-乙醚提取物(粗脂肪)、ME-代謝能；礦物質(zhì)鹽(1 kg DM)包含：氯化鈉100 g、鋅12.5 g、鐵12.5 g、錳12.5 g、銅1 750 ppm、碘450 ppm、鈷240 ppm。

圖1 雙流量連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)

每個(gè)發(fā)酵罐每天投入72 g(DM)的日糧，分2次(上午9點(diǎn)和晚上9點(diǎn))等量投入，即每次36 g。食糜固體和液體分開(kāi)收集在4 L的塑料桶中。在日糧適應(yīng)期的每天上午8:30，給塑料桶稱重并移除內(nèi)容物。在試驗(yàn)的8～12 d，每個(gè)塑料桶注入20mL濃度為50%的硫酸，并將塑料桶(大約三分之二的深度)浸入4℃水浴中，以防止微生物和酶的活動(dòng)。在每個(gè)試驗(yàn)期的第9、10、11、12 d，將每個(gè)發(fā)酵罐的液體和固體溢出物用攪拌器混合并均質(zhì)化，通過(guò)真空系統(tǒng)收集500 mL樣本并-20°C保存。每個(gè)試驗(yàn)期發(fā)酵罐的溢出物有2 000 mL，另外收集300 mL凍干并用研缽弄碎作為子樣本，放入另外的塑料容器作進(jìn)一步的化學(xué)分析。剩余的發(fā)酵罐溢出物用兩層紗布過(guò)濾，取2個(gè)10 mL，分別添加0.2 mL濃度為50%的硫酸溶液、保存，留待以后分析氨態(tài)氮(NH3-N)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)。

在試驗(yàn)的第7 d，發(fā)酵罐開(kāi)始灌注15氮[硫酸銨15(NH4)2SO4]之前，收集每個(gè)發(fā)酵罐的污水樣本(固體和液體)，用于測(cè)定背景15氮的豐裕度。然后，將富含10% 15氮原子的0.077 g硫酸銨灌注到每個(gè)發(fā)酵罐，用于瞬時(shí)標(biāo)記氨氮(NH3-N)池。添加0.077 g/L的15(NH4)2SO4，替代等氮量的尿素，以便發(fā)酵罐中15氮的濃度維持穩(wěn)定狀態(tài)。

在試驗(yàn)的第10 d和第12 d，在發(fā)酵罐投入日糧之后的0、1、2、4、6、8、10 h，用手提式pH計(jì)測(cè)定每個(gè)發(fā)酵罐(模擬瘤胃)的pH值。在每個(gè)試驗(yàn)期的最后一天，整個(gè)發(fā)酵罐的內(nèi)容物用兩層紗布過(guò)濾，液體在4℃時(shí)離心(1 000 g)10 min、移除飼料顆粒。然后，將懸浮液離心(10 000 g)20 min，去掉懸浮液，將細(xì)菌顆粒凍干和保存以便進(jìn)一步分析。

日糧和食糜樣本根據(jù)AOAC分析DM(干物質(zhì))、粗蛋白(CP)和乙醚浸出物(EE粗脂肪)。有機(jī)物(OM)根據(jù)DM和灰分的差值計(jì)算。NDF(中性洗滌纖維)和ADF(酸性洗滌纖維)根據(jù)Van Soest方法，用不含亞硫酸鈉的α熱穩(wěn)定淀粉酶處理，依次用纖維分析儀(Ankom200)分析。微生物顆粒和食糜污水按日糧分析法測(cè)定DM、CP和灰分。食糜污水中揮發(fā)性脂肪酸的濃度用氣相色譜分析。氨氮濃度用色度比色分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

與第2組(靜態(tài)的12%粗蛋白日糧)相比，瘤胃(發(fā)酵罐)對(duì)DM(干物質(zhì))、OM(有機(jī)物)、NDF(中性洗滌纖維)和ADF(酸性洗滌纖維)的表觀消化率，既不受日糧粗蛋白增加也不受日糧粗蛋白振蕩的影響(P>0.05)。瘤胃(發(fā)酵罐)對(duì)DM和OM的真實(shí)消化率在各處理組之間同樣也無(wú)差異(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 雙流量連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中瘤胃的消化率

表3 雙流量連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中瘤胃的pH和VFA

表4 雙流量連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中瘤胃的氮參數(shù)

備注：微生物效率 = 微生物氮(g)÷ 真實(shí)消化的干物質(zhì)(kg)；RDP供應(yīng)(瘤胃降解蛋白供應(yīng))= 總氮流動(dòng) - 微生物氮RUP流動(dòng)(瘤胃非降解蛋白流動(dòng))= 攝入的總氮 - 瘤胃降解蛋白流動(dòng)

隨著日糧粗蛋白(CP)水平的增加，瘤胃(發(fā)酵罐)內(nèi)的pH值呈現(xiàn)極顯著的(P<0.01)線性正效應(yīng)(表3)。但是，第4組(每48 h在10%CP和14%CP之間振蕩的日糧)與第2組(靜態(tài)的12%CP日糧)瘤胃(發(fā)酵罐)內(nèi)的pH值差異不顯著(P>0.05)。日糧與時(shí)間的交互作用不顯著(P>0.05)?？偟腣FA(揮發(fā)性脂肪酸)濃度和單個(gè)VFA摩爾比例(醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸)，不受日糧粗蛋白水平或日糧CP振蕩的影響(P>0.05)。

隨著日糧CP水平的增加，瘤胃(發(fā)酵罐)內(nèi)的氨氮(NH3-N)濃度(表4)呈現(xiàn)顯著的二次效應(yīng)(P<0.05)。14%組瘤胃(發(fā)酵罐)內(nèi)食糜污水的氨氮(NH3-N)濃度大約比10%組和12%組大3倍。各處理組之間的總氮(N)、非氨氮(NAN)和瘤胃非降解蛋白(RUP)的流動(dòng)以及CP可消化性都無(wú)差異。10%～14%振蕩組與12%組比較時(shí)，微生物氮和氨氮的流動(dòng)、微生物效率差異都不顯著(P>0.05)，但當(dāng)日糧CP水平增加時(shí)，這些變數(shù)呈現(xiàn)顯著的(P<0.05)二次效應(yīng)。

2 結(jié)論

與靜態(tài)的12%CP肉牛日糧相比，每間隔48 h、10% CP和14% CP之間振蕩的日糧對(duì)瘤胃氮代謝和微生物效率無(wú)影響，表明每間隔48 h、10%CP和14%CP之間振蕩的日糧不會(huì)改善肉牛瘤胃養(yǎng)分的消化性、瘤胃發(fā)酵、瘤胃氮代謝和微生物效率。暗示瘤胃微生物對(duì)振蕩的CP水平不響應(yīng)，或者能夠積極應(yīng)對(duì)48 h期間的營(yíng)養(yǎng)不良。12% CP的日糧對(duì)瘤胃微生物氮的流動(dòng)和微生物效率產(chǎn)生正面影響，因此，這是改善瘤胃氮利用的最佳方案，超過(guò)這一水平(12% CP)，日糧中增加再多的CP含量也沒(méi)有進(jìn)一步的好處。

[1] Paloma de Melo Amaral, Lays Débora Silva Mariz. Effects of Static or Oscillating Dietary Crude Protein Levels on Fermentation Dynamics of Beef Cattle Diets Using a Dual-Flow Continuous Culture System[J].PLoS One. 2016,11(12): e0169170.

中國(guó)牛業(yè)科學(xué)2017,43(5):25-27ChinaCattleScience科學(xué)實(shí)驗(yàn)