彭術(shù)軍,王 玲,陳 宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院 ,重慶 402460 )

熱應(yīng)激(Heat stress)是機體對外界或內(nèi)部的熱刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和。研究表明，熱應(yīng)激能引起外周血液淋巴細胞凋亡，機體免疫下降，內(nèi)環(huán)境失衡，從而嚴重影響肉牛生產(chǎn)性能，對肉牛的經(jīng)濟價值帶來巨大損失。因此，從分子遺傳角度來看，研究熱應(yīng)激對相關(guān)基因的表達及作用機制具有重要意義。SNORA66是一類位于非編碼區(qū)的基因間區(qū)的核仁小RNA分子，屬于核轉(zhuǎn)錄因子，是snoRNA家族之一，廣泛分布于真核生物和原核生物中，最初起源于HeLa Cell[1]，具有類似核仁提取物的性質(zhì)(抗鹽性)，其主要指導(dǎo)其它RNA，特別是指導(dǎo)snRNA，tRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄后的修飾，進而調(diào)控mRNA翻譯成蛋白質(zhì)[2,3]，因而SNORA66基因?qū)O有希望成為研究肉牛應(yīng)對熱應(yīng)激的候選基因。研究表明，強熱應(yīng)激下，轉(zhuǎn)基因植物通過機體內(nèi)SNORA66基因的調(diào)控作用產(chǎn)生熱休克蛋白Hsp70抵御外界刺激[4]。姜同泉等[5]發(fā)現(xiàn),哺乳動物細胞受熱應(yīng)激后會終止大部分蛋白質(zhì)的合成。另外，研究顯示，人體血液中也檢測出SNORA66基因，并且發(fā)現(xiàn)與外周血淋巴細胞凋亡、蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)、阻止癌細胞增殖、免疫調(diào)節(jié)高度相關(guān)[6]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)振蕩刺激與靜置兩種狀態(tài)下，人體血清樣品中SNORA66基因的Cq值，前者明顯高于后者[7]。有關(guān)SNORA66基因作為抗應(yīng)激候選基因的研究在植物、人類等有所報道，而SNORA66基因作為肉?？箲?yīng)激基因的相關(guān)研究報道不多，熱應(yīng)激對肉牛SNORA66基因表達的差異性的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究運用Real-time PCR方法檢測 SNORA66基因的組織表達譜，同時分析SNORA66基因在不同應(yīng)激下、不同品種的差異表達情況，探討SNORA66基因的表達量與熱應(yīng)激、非熱應(yīng)激、品種的關(guān)系，為進一步研究SNORA66基因的功能和肉?？篃釕?yīng)激選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

在重慶良種肉牛場選擇26月齡左右的紅安格斯和抗旱王空懷母牛各5頭，在熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激條件下利用真空采血管從頸靜脈采集血液，并迅速將樣品置于液氮內(nèi)冷凍保存，然后在實驗室分離白細胞。

1.2 溫濕度的測定

試驗期內(nèi)，在牛舍中部及四個角距地面1.5 m高處各懸掛干濕球溫度計，于每天上午8:00和14:00測定牛舍的干球溫度(Td)和濕球溫度(Tw)，利用公式計算溫濕指數(shù)(THI)，THI=0.72(Td+Tw)+40.6。以THI作為熱應(yīng)激程度的評定標準，當THI≤72為無熱應(yīng)激；7288為重度熱應(yīng)激狀態(tài)。

1.3 主要儀器與試劑

熒光定量PCR儀、電泳儀、CFX connectTM Real-Time System、臺式高速冷凍離心機、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等；2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer、6×DNA loading buffer；GoldViewⅠ型核酸染色劑、RNA抽提試劑Trizol、DEPC、瓊脂糖(AGAROSE G-10)、Tris base、EDTA、硼酸。

1.4 總RNA提取與處理

本試驗采用Trizol全血RNA提取法，其操作流程如下：

用2 mL EP管中收集1.5 mL新鮮的血液，加入紅細胞裂解液按1：3的比例分離白細胞，在3500 r/min離心6 min，若效果不好，再重新裂解一次。分離得到的白細胞，立刻用質(zhì)量好的TRIZOL裂解白細胞，或置于-20℃或-80℃保存，過后抽提。

1.5 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索肉牛SNORA66基因的DNA或者mRNA為模板來設(shè)計引物，利用Primer Premier 5.0[1](在www.bio-soft.net下載)進行引物設(shè)計。綜合考慮引物設(shè)計的各項原則，設(shè)計SNORA66基因的上、下游引物，以β-actin作為內(nèi)參基因。引物由上海英俊公司合成，序列及信息見表1：

表1 引物詳細信息

1.6 cDNA的合成

根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系組成如：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL，Total RNA(1 μg/μL) 2 μL，滅菌雙蒸水補足20 μL。按37℃反應(yīng)15 min，再85℃反應(yīng)5s，獲取cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 熒光定量引物普通PCR電泳檢測

根據(jù)SsoAdvancedTM Universal SYBRR Green SuPermix配置熒光PCR反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)體系如下：SsoAdvancedTM Universal SYBRR Green SuPermix 5 μL，上下引物各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，補滅菌雙蒸水至10 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10s，52.9℃退火30 s，39個循環(huán)，4℃保存，最后，用1%瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.8 熒光定量引物擴增效率檢測

以RT-PCR擴增產(chǎn)物為模板，進行倍比稀釋，將PCR產(chǎn)物用EASY Dilution依次梯度稀釋成(1×100～1×106)7個梯度，按上述1.6的方法對樣品進行處理：紅安格斯正常情況(HC)、紅安格斯熱應(yīng)激情況(HH)和抗旱王正常情況(KC)、抗旱王熱應(yīng)激情況(KH)進行測定，每一品種選擇3個樣本，每個樣本(重復(fù)3次)，選取表達量最低的樣品作為計算相對表達量的標準品，設(shè)置一個陰性對照(NTC)。取各梯度的標準品1 μL加入反應(yīng)體系中，在同樣的反應(yīng)條件下，進行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測擴增效率。根據(jù)Q-PCR儀繪制的PCR動力學(xué)曲線，分別繪制SNORA66、β-actin的標準曲線。

1.9 統(tǒng)計分析

本實驗根據(jù)熒光曲線的Ct值，采用比較閾值法(2-ΔΔCT法)進行相對定量分析結(jié)果。針對基因的相對表達量，采用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件對其進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標準差來表示，并進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液總RNA質(zhì)量檢驗

采用Trizol法對肉牛外周血進行總RNA抽提，瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜見圖1。由圖1可見3條明顯的條帶，按遷移率由小到大依次是28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。28S條帶較明亮，28S條帶與18S條帶之比約為2，沒有雜帶和拖尾現(xiàn)象的樣品為合格樣品。

圖1 RNA電泳結(jié)果

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖2顯示，SNORA66產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中只出現(xiàn)唯一符合預(yù)期長度的明亮條帶，表明不存在明顯的引物二聚體或非特異PCR產(chǎn)物，可供后續(xù)實驗。

2.3 標準曲線

圖2 β-actin、SNORA66基因擴增結(jié)果

圖3 肉牛SNORA66基因Real-time PCR標準曲線

圖4 β-actin基因Real-time PCR標準曲線

基因擴增效率(%)回歸公式回歸系數(shù)(R2)β-actin94.9Y=-3.451X+30.6920.999SNORA6698.7Y=-3.353X+32.2780.995

圖3、圖4得到的標準曲線公式和回歸系數(shù)分別如表2所示，這說明在標準質(zhì)粒稀釋質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。曲線的擴增效率為E=94.9%、98.7%符合要求；熔解曲線表現(xiàn)為單一的峰值，產(chǎn)物的Tm值均一。

2.4 SNORA66基因的相對表達量

經(jīng)Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件進行分析預(yù)處理后得到每一樣品的SNORA66基因相對表達量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3、表4。從表3可知，紅安格斯牛及抗旱王牛熱應(yīng)激條件下SNORA66基因表達量均顯著高于非熱應(yīng)激條件(P<0.05)。

從表4可知，熱應(yīng)激及非熱應(yīng)激狀態(tài)下紅安格斯牛SNORA66基因表達量均顯著低于抗旱王牛SNORA66基因表達量 (P<0.05)。

表3 不同狀態(tài)下紅安格斯及抗旱王SNORA66基因的表達量

注:數(shù)據(jù)中肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，附不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

表4 非熱應(yīng)激及熱應(yīng)激狀態(tài)下紅安格斯和抗旱王SNORA66基因表達量

3 討論

3.1 不同狀態(tài)下同一肉牛品種SNORA66基因的相對表達

熱應(yīng)激下，組織器官處于異常狀態(tài)，體內(nèi)SNORA66基因的表達水平發(fā)生改變。目前，在動物上研究熱應(yīng)激對SNORA66的影響的報道較少，而主要集中在植物和人類的研究中。在植物上，已有許多研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激較大程度影響植物中的基因表達。Jonathan等[4]研究轉(zhuǎn)基因植物在熱應(yīng)激下的表達水平發(fā)現(xiàn)，SNORA66在熱應(yīng)激下表達發(fā)生改變，且大部分表達呈現(xiàn)上升趨勢。另外，Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)振蕩刺激與靜置兩種狀態(tài)下，人體血清樣品中SNORA66基因的Cq值，前者明顯高于后者。另外，醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中15號染色體上缺少SNORA66基因會導(dǎo)致Prader-willi綜合征，說明該基因與疾病的調(diào)控高度相關(guān)[8]。本研究表明，兩種狀態(tài)下安格斯及抗旱王牛外周血液中的SNORA66基因均有表達，且熱應(yīng)激下顯著高于非熱應(yīng)激，與前人研究基本一致。通過以上研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激下動植物體內(nèi)部分SNORA66基因存在上調(diào)表達，調(diào)節(jié)著不同的生理過程來防御熱應(yīng)激。因此，本研究推測，短時間熱應(yīng)激將導(dǎo)致肉牛的免疫功能受到抑制，機體通過提升SNORA66基因表達量,調(diào)控產(chǎn)生熱休克蛋白防御熱應(yīng)激破壞機體的內(nèi)環(huán)境，而非熱應(yīng)激下則不會出現(xiàn)。同時，我們擬通過鑒定熱應(yīng)激下差異表達的SNORA66，初步探究動植物對熱應(yīng)激與非熱應(yīng)激的應(yīng)答機制。

3.2 熱應(yīng)激條件下不同肉牛品種SNORA66基因的相對表達

熱應(yīng)激下，不同品種肉牛體溫均迅速上升，機體內(nèi)環(huán)境遭到破壞，嚴重影響牛血清生化指標(SOD抗氧化指標、免疫指標、酶活性指標)。近幾年，F(xiàn)uquay[9]等研究發(fā)現(xiàn)，肉牛熱應(yīng)激是當肉牛受到超過本身體溫調(diào)節(jié)能力的過高溫度刺激時，作用于垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)引起機體的非特異性防御反應(yīng)和特異性障礙的全身性適應(yīng)癥。研究表明，肉牛的耐熱性狀是一數(shù)量性狀，不同的品種和個體的肉牛對熱應(yīng)激的反應(yīng)存在一定的差異，抗旱王牛群耐熱性狀的遺傳力為0.15～0.30[10]。本研究表明，熱應(yīng)激期的安格斯牛和抗旱王牛的SNORA66基因表達量差異較大?？赡芘c種屬特異性和品種的形成過程有關(guān)，由于品種的形成與自然環(huán)境密切相關(guān)，不同的自然環(huán)境使不同牛的品種在外貌特征，生理和基因組成上產(chǎn)生較大的差別，因而兩品種肉牛對熱應(yīng)激的抵抗力也有顯著的差異。黃薇等[11]曾報道，在不同的人群中，基因組的連鎖不平衡的程度是不同的，即使在同一個群體中，基因組的不同區(qū)域的連鎖不平衡程度也是不同的。同樣，SNORA66基因在這2個肉牛品種中的連鎖不平衡(Linkgae Disqeuiilbrium, LD)程度也不是完全一樣的。李芳等[2,12]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子是最早被發(fā)現(xiàn)的熱休克轉(zhuǎn)錄因子，它轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)嵝菘说鞍谆虻谋磉_，直接或間接參與動物熱休克反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)SNORA66基因是一種分布于真核生物細胞核仁的小分子非編碼RNA，與熱應(yīng)激蛋白質(zhì)合成有關(guān)，該基因高度保守遺傳[2,13]，不同物種間同源性高，研究證實所有SNORA66基因都包含三個及其相似結(jié)構(gòu)：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、三聚化結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活化域。一旦機體受到熱應(yīng)激時，SNORA66基因接受刺激后，啟動三聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成有活性的三聚體，然后由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)結(jié)合到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因上，最后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的功能激活相應(yīng)基因表達，因此，不同品種肉牛細胞可能通過提高SNORA66表達量的方式來應(yīng)對熱應(yīng)激所帶來的不良反應(yīng)。另外，通過尹小平[14,15]等的研究分析，品種差異造成，抗旱王耐熱性能較好，對熱的敏感度較低，機體內(nèi)含有瘤牛血液，體質(zhì)強壯[16]，合成熱應(yīng)激蛋白能力較強，熱應(yīng)激下抗旱王牛SNORA66基因表達量的上調(diào)明顯。

本研究通過對SNORA66基因表達量的研究，統(tǒng)計分析不同品種與熱應(yīng)激的相關(guān)性，從分子水平上揭示SNORA66基因與肉牛耐熱性狀之間關(guān)系，探索不同品種肉牛發(fā)生熱應(yīng)激的遺傳機理。結(jié)果表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下紅安格斯牛外周血中SNORA66基因表達顯著低于抗旱王牛，與前人研究有類似結(jié)論。因此，筆者推測，熱應(yīng)激是通過破壞內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致血液生化信號通路受阻、細胞凋亡、免疫功能下降，從而激活SNORA66基因調(diào)控功能，上調(diào)血液中基因表達量，以堿基配對的方式分別指導(dǎo)著核糖體RNA的甲基化和假尿嘧啶化修飾，與特定的熱休克蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖核蛋白體(snoRNP)，并以此形式存在和行使功能，防御熱應(yīng)激；從分子遺傳角度看，不同品種的肉牛在熱應(yīng)激存在差異性的基因表達機制，具體表達機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下，紅安格斯牛及抗旱王牛外周血中的SNORA66基因表達量均顯著高于非熱應(yīng)激狀態(tài)(P<0.05)；熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激狀態(tài)下，SNORA66基因的表達量具有品種差異，紅安格斯牛外周血中SNORA66基因表達量均顯著低于抗旱王牛(P<0.05)。

[1] Ganot, Philippe,Caizergues-Ferrer, et al. The family of box ACA small nucleolar RNAs is defined by an evolutionarily conserved secondary structure and ubiquitous sequence elements essential for RNA accumulation[J]. Genes & Development，1997，11(7): 941-956.

[2] 張筱晨.snoRNA的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 生命科學(xué)，2008, 2(4)：172-177.

[3] Kishore S, StammS.The snoRNA HBII-52 regulates alternative splicing of the serotonin receptor 2C[J]. Science，2006，311(5758): 230.

[4] Jonathan R, Allison K. Off-target Effects of Plant Transgenic RNAi:Three MechanismsLeadto Distinct Toxicologicaland Environmental Hazards[J]. GMO-Free Region，2015，(5):11-12.

[5] 姜同泉,任登良,姜忠玲等.熱應(yīng)激處理鼠囊胚Hsp70基因表達的RT- PCR檢測[J]. 繁殖與生理，2007，(11): 8-9.

[6] Zaravinos A, Lambrou GI, Mourmouras N, et al. New miRNA Profiles Accurately Distinguish Renal Cell Carcinomas and Upper Tract Urothelial Carcinomas from the Normal Kidney[J]. PLoS ONE，2014，(9): e91646.

[7] Chen X, Liang H, Guan D, et al. A Combination of Let-7d, Let-7g and Let-7i Serves as a Stable Reference for Normalization of Serum microRNAs[J]. PLoS ONE，2013，8(11): e79652.

[8] Skryabin BV, Gubar LV, Seeger Betal. Deletion of the MBII-85 snoRNA gene cluster in mice results in postnatal growth retardation[J]. PLoS Genet.，2007，3(12):e235.

[9] Fuquay J W. Heat stress as it affects animal production[J].J Anim Sci，1981(52):164-174.

[10] Kinnula VL, Crapo JD, Raivio KO. Generation and disposal of reactive oxygen metabolites in lung[J]. Lab Invest, 1995, 73(1): 3-19

[11] Huang W, He Y, Wang H, et al. Linkage disequilibrium sharing and haPlotyPe-ragged SNP Portability between Populations[J]. Proc Natl Acad Sei USA，2006, 103(5): 1418-1421.

[12] LI Fang. Association of HSF1 Polymorphisms and its relationship with thermal tolerance in Holstein cows[J]. J Anim Sci，2009(6): 30-35.

[13] 翟麗麗,鄒小婷，等.兩個保守的snoRNA基因SNORA50和SNORA71在靈長類和嚙齒類的轉(zhuǎn)錄活性及組織表達譜[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2014(8): 1-2.

[14] 尹小平,袁慧,張明.奶牛熱應(yīng)激及對免疫影響的研究進展[C]. 2003年全國家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文專輯, 2003(10): 144-145.

[15] 胡艷欣,佘銳萍,張洪玉，等. 熱應(yīng)激后豬血清中 IL-2,IFN-γ及TNF-α水平的動態(tài)變化[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006, 37(5): 496-499.

[16] 孫曉燕,黃德均，等.抗旱王牛的血液理化指標測定[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2014，(9): 26-28.

中國牛業(yè)科學(xué)2017,43(5):38-43ChinaCattleScience文獻綜述