張影影， 覃春霞， 張永學

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學科，湖北省分子影像重點實驗室， 教育部生物靶向治療重點實驗室，武漢 4300302河南省腫瘤醫(yī)院鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，鄭州 450008

金納米棒在腫瘤分子影像診斷和靶向治療中的應用*

張影影1，2， 覃春霞1△， 張永學1

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學科，湖北省分子影像重點實驗室， 教育部生物靶向治療重點實驗室，武漢 4300302河南省腫瘤醫(yī)院鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，鄭州 450008

金納米棒； 表面偶聯； 腫瘤顯像； 光熱治療

近年來，納米材料及其表面修飾技術的發(fā)展，使以納米特性為基礎設計生物相容性的納米探針并用于疾病的顯像、局部治療和藥物運輸成為可能。其中金納米顆?？梢耘cDNA[1]、多肽[2]、抗體[3]、放射性核素[4]等相偶聯，實現對腫瘤的靶向檢測、顯像及治療。此外，納米顆粒在腫瘤區(qū)域具有滲透滯留效應(enhanced permeability and retention，EPR)，可促進大分子物質的選擇性分布，增加藥效并減少系統(tǒng)副作用[5]。在近紅外區(qū)域(near infrared，NIR)，生物組織中的血紅蛋白和水對光的吸收最少[6]。金納米棒(gold nanorods，GNRs)作為金納米顆粒的典型代表，通過控制合成過程中的反應條件，可調控GNRs的長徑比使其縱向等離子共振吸收峰位于此區(qū)域[7]，使其具備較高的光熱轉換效率[8]，可用于光學顯像、光熱治療和光控藥物釋放等。而球形金納米顆粒由于高度對稱的結構，表現為單一的可見光區(qū)的等離子共振吸收峰，限制了其在生物體內的一些應用[9]。在此我們主要討論GNRs在腫瘤的診斷和治療方面的研究進展，包括GNRs的合成方法、表面偶聯化合物、腫瘤的顯像和治療等。

1 GNRs的制備

GNRs的合成方法包括模板法[10]、電化學法[11]、光化學法[12]、晶種生長法[13]等。其中晶種生長法是制備GNRs最成功的方法，主要有3種合成方式：①種子介導的三步合成法。準備3份含有氯金酸鹽(HAuCl4)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)和抗壞血酸的生長液A、B、C，將被覆檸檬酸鹽的3.5 nm的金納米顆粒加入到A生長液中，反應4～5 h后加入到B生長液中；再過4～5 h，從B生長液中取出一部分加入到C生長液中反應一定時間，然后離心純化。這種方法是合成長徑比大于8的GNRs的較好方法[14]。此方法合成的GNRs尺寸較大，有較強的光散射作用，在暗場顯像方面占有一定的優(yōu)勢。②銀介導的晶種合成法。利用被覆CTAB的1.5 nm的金納米顆粒為晶種，生長液中較之前的合成方法新加入了硝酸銀，通過調節(jié)生長液中Ag+濃度，可合成長徑比為2～5的表面被覆Ag+的單晶體結構的GNRs[15]。③無種子合成法。成核和生長在同一個反應體系中完成，用少量的強還原劑氫硼化鈉在原位產生晶種，抗壞血酸引發(fā)生長。通過控制合成過程中氫硼化鈉、Ag+及CTAB的濃度、調節(jié)反應體系的pH值，可合成長徑比為2～5的GNRs。這種小尺寸的GNRs吸光能力強、散射能力弱，在光熱治療方面具有獨特的優(yōu)勢[16]。

2 GNRs的表面修飾

上述晶種生長法合成的GNRs表面均覆蓋CTAB，CTAB作為合成過程中的支持電解質和穩(wěn)定劑，具有生物毒性，會激活細胞內的活性氧系統(tǒng)，引發(fā)線粒體腫脹，最終導致細胞自噬和凋亡[17]。因此需對其進行表面修飾，常用的修飾方法有配體交換、高分子電解質吸附、無機物二氧化硅(SiO2)修飾等。2006年Niidome等[18]首次報道了用聚乙二醇(PEG)取代GNRs表面的CTAB，經PEG取代后的金納米棒(PEG-GNRs)Zata電位變?yōu)橹行裕山档途奘杉毎脱獫{蛋白的非特異性結合。并經體內研究發(fā)現，尾靜脈注射后30 min約30%的CTAB-GNRs聚集在肝臟，而PEG-GNRs主要分布于血液中，72 h后除肝臟外其他器官幾乎沒有PEG-GNRs的聚集，說明PEG修飾的GNRs具有良好的生物相容性及較長的血液循環(huán)時間。該修飾方法反應條件溫和，修飾后GNRs的穩(wěn)定性好，是目前最常見的GNRs的修飾方法。此外，聚苯乙烯磺酸鈉(polystyrene sulfonate，PSS)、聚烯丙基胺鹽酸鹽(poly allylamine hydrochloride，PAH)及無機SiO2等也可以用于修飾金納米棒改善其生物相容性。Wan等[19]研究發(fā)現經高分子電解質PSS、PAH等修飾的GNRs生物毒性明顯降低，并通過體內實驗證實PAH-GNRs具有良好的生物相容性及較長的血液半衰期，該修飾方法主要通過靜電作用使其沉積在金納米棒表面，雖然過程快捷、簡單，但其穩(wěn)定性和修飾后金納米復合物的均一性有待提高。與上述2種修飾方法相比，無機SiO2修飾的GNRs有較高的細胞攝取率和光熱消融效應。但該過程需要高溫煅燒，而GNRs不耐高溫，因此限制其進一步的修飾及應用[20]。

3 以GNRs為平臺相關物質的偶聯

GNRs特殊的晶體結構賦予其較高的反應活性[21]，可以作為很好的載體制備GNRs靶向復合物材料、生物醫(yī)用造影劑和納米探針等，并可以通過透射性電子顯微鏡、Zeta電位、紅外光譜、紫外-可見光譜、動態(tài)光散射等進行修飾成功后的檢測。主要的偶聯物質有以下幾類。

3.1 靶向分子

將靶向肽、葉酸、抗體等物質與GNRs相連后可同時具備主動和被動雙重靶向效應，增強金納米復合物在腫瘤部位的富集[22]。例如靶向配體RGD可與高表達αVβ3的腫瘤特異性結合[23]；將葉酸連接到GNRs表面可使該探針靶向達到高表達葉酸受體的腫瘤部位[24]；上述均通過受體-配體結合實現主動靶向作用，同時探針的納米特性可在實體瘤部位通過EPR效應實現被動聚集。Joshi等[25]利用抗原抗體結合原理將內皮生長因子受體(EGFR)的特異性抗體225和非特異性抗體RG-16分別定向連接在GNRs表面，使上述納米探針具備良好的靶向性，且抗體的定向連接使其發(fā)揮較高的效價，同時由于巨噬細胞不能與抗體的Fc段結合，可降低機體免疫系統(tǒng)的反應，延長體內循環(huán)時間。

3.2 放射性核素

連接有放射性核素的金納米探針可用于PET/SPECT顯像，具有較高的靈敏度。放射性核素與金納米的偶聯包括直接法和間接法。①鹵族元素可化學吸附在金的表面，其中碘離子和金原子之間的親和力最強，可直接結合在GNRs的表面[26]，該反應過程簡單、快速、條件溫和。Shao等[27]用125I標記GNRs，標記過程簡單、快速，具有較高的放化產率，且不會破壞GNRs的光學性質，并通過γ顯像監(jiān)測125I標記的GNRs在動物體內的生物學行為，再次證實PEG修飾的GNRs具有良好的穩(wěn)定性和較長的血液循環(huán)時間。②放射性核素64Cu、99mTc等不能直接與金反應，需要通過螯合劑間接標記到GNRs表面。Xiao等[28]將放射性核素64Cu通過螯合劑NOTA與GNR-DOX-cRGD相偶聯，可同時用于腫瘤的靶向藥物釋放和PET顯像，并通過感興趣區(qū)半定量分析放射性探針在動物體內的分布與生物分布結果相一致。Morales-Avila等[29]通過螯合劑HYNIC將核素99mTc連接于金納米顆粒表面制備出放射性核素探針用于腫瘤的SPECT/CT顯像并取得良好的顯像結果。

3.3 熒光物質

熒光成像靈敏度高、重復性好、標記靶點多樣，有利于人們從細胞、分子水平研究相關生物學過程，但易受細胞、組織背景的干擾。Gao等[23]合成集熒光顯像和靶向治療于一體的多功能探針RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3，γ-Fe2O3可介導自由基羥基(·OH)的產生，從而導致細胞的氧化損傷和凋亡；異硫氰酸熒光素(FITC)與Capsase-3的識別序列(DEVA)相連接，FITC的熒光共振能量可傳遞到Au而發(fā)生熒光淬滅，在凋亡過程中DEVA被Caspase-3識別并剪切，從而使淬滅的熒光恢復，因此上述探針可用來檢測癌細胞的凋亡過程。

3.4 治療藥物

以GNRs為載體可將化療藥物靶向輸送到腫瘤部位，增加藥物療效，減少系統(tǒng)副作用。Xiao等[30]通過DNA的自組裝作用將化療藥物阿霉素(DOX)靶向輸送到腫瘤部位。在NIR激光照射下，GNRs將光能轉化為熱能，促使DNA雙鏈解螺旋引起化療藥物的釋放，可用于光熱治療和化療。

4 在顯像及治療領域的應用

4.1 顯像領域

既可利用GNRs優(yōu)良的光學性質進行光聲顯像、暗場顯微鏡成像、雙光子熒光顯像和光學相干層析顯像，又可以利用GNRs與放射性核素的偶聯用于放射性核素顯像。

4.1.1 光學顯像 ①光聲顯像(PAT)：GNRs在NIR區(qū)較大的吸收截面和較高的光熱轉化能力，使周圍組織熱膨脹產生超聲波，比單純的超聲顯像具有更高的分辨率和成像深度。隨著納米探針濃度的增加，光聲信號的強度也隨之增加。此外，研究發(fā)現GNRs可以增強多壁碳納米管的光聲信號強度[31]。連接葉酸(FA)的金納米探針特異性地與高表達葉酸受體的癌細胞結合，向HeLa荷瘤鼠靜脈注射FA-GNRs后，PAT顯像示6 h后腫瘤部位由于FA-GNRs的聚集顯示較高的亮度，24 h后腫瘤部位可探測到明顯的光聲信號且腫瘤輪廓顯示清晰[32]。②暗場顯像：粒徑較大的GNRs對光有較強的散射作用，可作為暗場成像的造影劑，用于功能化金納米棒在體外細胞實驗中的靶向定位研究。Wang等[31]將RGD連接到雜交金納米sGNR/MWNT(multiwalled carbon nanotubes)表面制備出RGD-GNR-MWNT納米探針，細胞實驗發(fā)現由于納米探針可以與高表達RGD受體的MGC803細胞系特異性結合，通過暗場顯微鏡觀察到呈現明亮的金色。③雙光子熒光顯像：GNRs的縱向等離子共振特性可應用于雙光子熒光成像，具有背景熒光低、信噪比高的優(yōu)點，可實時監(jiān)測腫瘤細胞壞死情況，且發(fā)現當紅外激光功率增加到一定程度時雙光子熒光信號明顯減弱，說明大部分GNRs此條件下已經發(fā)生熱溶化，在NIR區(qū)域不再產生等離子共振現象[33]。此外，雙光子熒光成像還可以監(jiān)測功能化的GNRs攝取、藥物釋放及胞內定位等[34]。④光熱-光學相干成像(photothermal-optical coherence tomography，PT-OCT)：GNRs在生物組織的特定部位聚集時，可顯著增強信號的對比度用于PT-OCT成像。Tuckerschwartz等[35]以GNRs為顯像劑用于動物體內的PT-OCT成像，由于GNRs表面較強的光吸收和散射作用，可顯著增加光學信號的強度。與傳統(tǒng)的OCT相比，具備高空間分辨率及較佳的成像深度。

4.1.2 放射性核素顯像 GNRs與放射性核素偶聯后可用于SPECT和PET顯像。如用125I標記GNRs，可利用125I發(fā)出的γ射線行SPECT顯像[27]。將64Cu連接到GNRs表面可得到穩(wěn)定的核素示蹤劑，通過PET顯像可以精確監(jiān)測和定量分析納米復合物在生物體內的分布情況并進一步指導進行有效的光熱治療[36]。

上述以GNRs為基礎進行的分子顯像的研究為實現放射性核素的SPECT、PET顯像和GNRs光學性質顯像的結合提供了一個新的思路。

4.2 治療領域

GNRs在NIR區(qū)域具備較高的光熱轉換效率，可用于光熱、光聲治療及熱控藥物釋放等。

4.2.1 光熱治療 熱誘導細胞產生一系列的損傷，如細胞膜出泡、細胞膜蛋白和線粒體的熱失活、熱休克蛋白的產生等。Tong等[33]研究了光熱效應導致細胞損傷的機制，FA-GNRs探針與過表達葉酸受體的惡性KB細胞特異性結合，在NIR激光照射下，GNRs產生的光熱作用引起胞內肌動蛋白的降解，大量Ca+內流導致胞膜出泡，腫瘤細胞壞死。Heidari等[2]將蛙皮素(Bombesin，BBN)類似物偶聯于GNRs表面，制備出GNR-BBN-PEG探針，在NIR激光的照射下，由于GNRs的光熱效應，體外細胞實驗顯示T47D細胞發(fā)生明顯的損傷，而對照組卻無明顯變化。體內實驗顯示實驗組荷瘤鼠腫瘤完全消失，而對照組腫瘤持續(xù)生長。

4.2.2 光聲治療 在NIR區(qū)GNRs較強的光熱轉換作用可使腫瘤部位熱膨脹產生強的休克波，導致大多數癌細胞20 s內死亡，從而有效地抑制腫瘤生長[32]。

4.2.3 熱控藥物釋放 GNRs為載體，將藥物分子通過物理吸附和化學鍵兩種方式連接在GNRs表面，利用GNRs光熱轉換產生的熱量，可控制藥物的釋放。例如Zhong等[37]合成cRGD-HN-DOX納米探針，用于荷人膠質瘤(U87MG)鼠的靶向化療。研究顯示，生理條件下cRGD-HN-DOX幾乎不釋放DOX，而在NIR照射下，由于GNRs的光熱轉換作用可引起DOX的大量釋放。與單純DOX相比，cRGD-HN-DOX具有較長的體內循環(huán)時間，且化療副作用小，可有效抑制腫瘤的生長，延長荷瘤鼠的生存時間。

5 小結及展望

由于GNRs具有獨特可調的光學性質使其在生物醫(yī)學領域有著廣泛而重要的應用前景，可作為生物分子和某些藥物的載體，又可作為生物顯像、治療的活性試劑，還可作為檢測生物分子的超敏生物傳感器。目前，由于診療一體化、多模態(tài)顯像及治療藥物的研究，GNRs獨特的光學性質成為關注的焦點。通過對GNRs的表面修飾及功能化，可同時集多模態(tài)靶向診斷、治療及療效監(jiān)測于一體，成為未來生物醫(yī)學研究的一個方向。但由于目前GNRs的合成原理還有待于進一步研究，仍存在產率和純度不高的問題，無法大規(guī)模生產。GNRs的生物無毒化修飾及共軛靶向分子的連接存在一些困難，且其生物毒性、穩(wěn)定性、體內分布代謝等問題還有待于進一步深入研究。

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(2016-08-16 收稿)

*國家自然科學基金資助項目(No.81401444)；華中科技大學自主創(chuàng)新研究基金資助項目(No.2014QN038)

R454.2,R445

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.024

張影影，女，1990年生，碩士研究生，E-mail：zhangy15090@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：t0317008@163.com