朱 勇，應(yīng) 杰，孫亞米，周麗絨

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（寧波），浙江寧波 315040；2.寧波市鄞江中學(xué)，浙江寧波 315040）

紫外分光光度法檢測香椿中硝酸鹽方法研究

朱 勇1，應(yīng) 杰2，孫亞米1，周麗絨1

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（寧波），浙江寧波 315040；2.寧波市鄞江中學(xué)，浙江寧波 315040）

食品、農(nóng)產(chǎn)品中檢測硝酸鹽含量采用的標準方法各有特點，基于香椿本身較高的亞硝酸鹽含量會給采用NY/T 1279-2007檢測硝酸鹽帶來影響，且硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm處具有等吸收波長特性的原因，通過亞硝酸根對硝酸根標液干擾程度的研究，提出采用標準加入法或在硝酸根標液中加入一定量的亞硝酸根溶液模擬樣品狀態(tài)的方法來消除這一干擾，既達到簡單便捷的目的，又確保了香椿數(shù)據(jù)的準確性。

香椿；硝酸鹽；亞硝酸鹽；紫外分光光度法

香椿（Toona sinensis）原產(chǎn)于中國，分布于長江南北的廣泛地區(qū)，具有較高的營養(yǎng)價值。但隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，香椿中亞硝酸鹽含量較高，從1.433～1 048 mg·kg-1［1-3］不等，遠超GB 2762-2012《食品安全國家標準食品中污染物限量》對亞硝酸鹽在蔬菜及其制品腌制蔬菜的限量規(guī)定（20 mg·kg-1以NaNO2計），香椿這一特性在新鮮蔬菜樣品中屬于較為特殊的情況，使得檢測香椿中硝酸鹽的含量需關(guān)注這一特殊現(xiàn)象。目前檢測食品、蔬菜、水果中硝酸鹽的標準方法主要有GB 5009.33-2010《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》和NY/T 1279-2007《蔬菜、水果中硝酸鹽的測定紫外分光光度法》。GB 5009.33-2010采用離子色譜法能很好地分離硝酸鹽與亞硝酸鹽，使二者不受干擾，但儀器較為昂貴，不是所有實驗室都有；第二種檢測方法常用分光光度法，適合大部分實驗室，缺點是硝酸鹽的測定采用鎘柱還原法，還原成亞硝酸鹽后，測定亞硝酸鹽值來計算硝酸鹽的含量，試驗過程煩瑣，周期長，需要具備一定的經(jīng)驗；而NY/T 1279-2007利用紫外分光光度法測定新鮮蔬菜及水果中硝酸鹽含量過程簡單，操作方便。水果、蔬菜樣品在去除色素、蛋白質(zhì)及其他干擾物質(zhì)的基礎(chǔ)上，利用硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm處具有等吸收波長的特性，測定其吸光度，其測得結(jié)果為硝酸鹽和亞硝酸鹽吸光度的總和。鑒于新鮮蔬菜、水果中亞硝酸鹽含量甚微，可忽略不計，測定結(jié)果為硝酸鹽的吸光度［4］。此法適用于大部分蔬菜水果，但香椿樣品由于自身的亞硝酸鹽含量的特殊性，采用NY/T 1279-2007方法，亞硝酸的含量對硝酸鹽測定結(jié)果的影響程度還需進一步探討。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

BlueStar B紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；ICS-2100離子色譜（美國賽默飛世爾科技公司）；723N分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；M illi-QADVA10超純水儀（美國M illipore公司）。

水中亞硝酸鹽氮成分分析標準物質(zhì)為GBW（E）080223，以亞硝酸根計329 mg·L-1；水中硝酸根成分分析標準物質(zhì)為GBW（E）080264，以硝酸根計1 000 mg·L-1，國家標準物質(zhì)研究中心。

1.2 前處理方法

1.2.1 離子色譜法

5 g勻漿香椿樣品，以80 m L水洗入100 m L容量瓶中，超聲提取30 min，75℃水浴中放置5 m in，取出放置室溫，加水稀釋至刻度，搖勻后濾紙過濾，取部分溶液于10 000 r·min-1離心15 min，上清液過OnGuardⅡRP柱凈化后待進樣。

1.2.2 分光光度法

5 g勻漿香椿樣品，置于50 m L燒杯中，加12.5 m L飽和硼砂溶液，以70℃左右的水約300 m L洗入500 m L容量瓶中，于沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中放置至室溫，在振蕩上述提取液時加入5 m L亞鐵氰化鉀溶液（106 g· L-1），搖勻，再加入5 mL乙酸鋅溶液（220 g· L-1），加水定容，搖勻，放置30 min后，用濾紙過濾。吸取40.0 m L濾液，置于50 m L帶塞比色管中，加入2 m L對氨基苯磺酸（4 g·L-1），靜置5 m in，加入1 m L鹽酸萘乙二胺（2 g·L-1），加水至刻度，混勻，靜置15 min，上機比色。

硝酸鹽測定采用鎘柱還原。先以25 mL稀氨緩沖液沖洗鎘柱，流速控制在3～5 m L·min-1，吸取20 m L濾液于50 m L燒杯中，加5 m L氨緩沖溶液混合，注入鎘柱還原，以原燒杯收集流出液，當貯液漏斗中的樣液流盡后，再加5 m L水置換柱內(nèi)留存的樣液，將全部收集液如前再經(jīng)鎘柱還原1次，第2次流出液收集于100 m L容量瓶中，繼以水流經(jīng)鎘柱洗滌3次，每次20 mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混勻取10 mL還原后的樣液于50 m L比色管中，按亞硝酸鹽比色法進行操作比色。

1.2.3 紫外分光光度法

取10 g勻漿香椿樣品于100 m L燒杯中，用100 m L水分次將樣品轉(zhuǎn)移到250 m L容量瓶中，加入5 m L氨緩沖溶液，2 g粉末狀活性炭，在可調(diào)式往返振蕩器上（200次·min-1）振蕩30 min，加入亞鐵氰化鉀溶液（150 g·L-1）和硫酸鋅溶液（300 g·L-1）各2 m L，混合后加水定容至250 m L，搖勻放置5 min，過濾，取2 m L濾液于50 m L容量瓶內(nèi)加水定容，比色。

1.3 儀器條件

離子色譜條件為Dionex IonPac AS11-HC離子色譜柱（4 mm×250 mm），流動相A為氫氧化鉀溶液，梯度洗脫條件為6 mmol·L-130 min，70 mmol·L-15 min，6 mmol·L-15 m in，流速1.0 m L·m in-1，進樣量25μL，柱溫30℃，電導(dǎo)檢測器檢測池溫度為35℃。分光光度計條件為1 cm比色杯，波長538 nm。紫外分光光度計條件為1 cm石英比色皿，波長219 nm。

1.4 標準曲線

1.4.1 離子色譜法

移取亞硝酸鹽和硝酸鹽標準溶液，加水稀釋，制成系列標準溶液，含亞硝酸根離子濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1；含硝酸根離子濃度為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1。用離子色譜儀分析，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，制作標準曲線。

1.4.2 分光光度法

移取亞硝酸鹽標準溶液，加水稀釋，制成系列標準溶液，含亞硝酸根離子濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·L-1。用分光光度計分析，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標進行線性回歸，制作標準曲線。

1.4.3 紫外分光光度法

移取硝酸鹽標準溶液，加水稀釋，制成系列標準溶液，含硝酸根離子濃度為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1。用紫外分光光度計分析，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標進行線性回歸，制作標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸根對硝酸根標準溶液的影響

考慮到個別香椿中亞硝酸根的含量能高至1 048 mg·kg-1，參照NY/T 1279-2007的處理方式，無法消除亞硝酸根，在用紫外分光光度計檢測硝酸根的同時，也有不同濃度的亞硝酸根干擾。模擬樣品中各濃度亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）經(jīng)過前處理后殘留在比色溶液中的濃度，模擬試劑采用標準溶液精準配制。隨著亞硝酸根濃度的提高，吸光度均有不同的增加。

從表1可知，雖然亞硝酸根對硝酸根的吸光度有正向干擾，但從各自標線的相關(guān)系數(shù)線性關(guān)系來考量，相關(guān)系數(shù)符合試驗要求。曲線整體抬升，硝酸根的吸光度收到干擾，斜率改變。雖然硝酸根、亞硝酸根是等吸收波長，但不完全是等濃度吸收。這同李祥的研究相符［6］。

表1 不同濃度亞硝酸根對硝酸根標準曲線的干擾

將沒有亞硝酸鹽影響的標準曲線吸光度值分別代入受影響的標準曲線，計算出樣品含亞硝酸鹽4、10 mg·kg-1影響時的待進樣溶液中硝酸根濃度，同沒有影響時的值比較相對相差。

表2表明，當樣品中含亞硝酸鹽含量在4 mg· kg-1時，相對相差均小于5%，符合NY/T 1279-2007的精密度要求；而當樣品中亞硝酸鹽含量在10 mg· kg-1時，相對相差均大于5%，不符合標準要求。樣品中亞硝酸鹽含量越高，硝酸鹽偏離正確值就越遠。鑒于新鮮蔬菜、水果中亞硝酸鹽含量甚微［4］，目前新鮮蔬菜中的亞硝酸鹽限量已取消，GB 2762-2005《食品中污染物限量》（已作廢）將蔬菜中亞硝酸鹽限量設(shè)定在4 mg·kg-1。所以除香椿以外的絕大部分新鮮蔬菜、水果樣品中亞硝酸鹽含量均會小于4 mg· kg-1，對硝酸鹽測定帶來的影響可以忽略，同時也驗證了NY/T 1279-2007的原理部分。

表2 不同濃度亞硝酸根對硝酸根干擾后含量的準確度

2.2 方法的前處理比較

GB 5009.33-2010的2個方法及NY/T 1279-2007均對樣品的前處理做出各自規(guī)定，詳見1.2部分。3個方法采用不同方式加入不同試劑，花費不同時間對樣品進行硝酸根、亞硝酸根提取。以此為依據(jù)，將香椿樣品采用這3個方法進行前處理，再分別用離子色譜、分光光度計、紫外分光光度計進行樣液檢測。由于紫外分光光度計法只是測試硝酸根的含量，故沒有亞硝酸根的數(shù)據(jù)。

由表3可知，不同前處理方法所測得的亞硝酸根數(shù)據(jù)、硝酸根數(shù)據(jù)相對相差均小于5%，達到GB 5009.33-2010、NY/T 1279-2007所規(guī)定的精密度要求。由此完全可以選擇適合本實驗室的3個方法的前處理方式中任一個，以最便捷的方式、最適合本實驗室人員操作習(xí)慣來完成試驗，香椿樣品的結(jié)果不受前處理方法的影響。

表3 采用不同標準試驗結(jié)果mg·kg-1

2.3 香椿樣品中亞硝酸根對硝酸根的影響

依據(jù)標準對香椿樣品進行前處理及上機檢測，離子色譜法、分光光度法分別測得亞硝酸根、硝酸根濃度。由表4可知，采用紫外分光光度計法考慮到亞硝酸鹽對硝酸鹽的干擾，將處理液分為3種方式進行上機檢測。1）直接上機測定。2）采用標準加入法測定。將1 000 mg·L-1硝酸根標準溶液吸取一定量，用樣液定容至50 m L，配成含標準溶液硝酸根離子濃度為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1系列，求得標準曲線后計算硝酸根含量。3）根據(jù)離子色譜法、分光光度法測得的香椿亞硝酸根均值含量156 mg·kg-1，經(jīng)前處理，硝酸鹽待測液中含亞硝酸根0.248 mg·L-1，配制硝酸根標準溶液時，所有標液中用移液槍均加入亞硝酸根標液0.037 7 m L，模擬樣液的基體，配成的硝酸根系列標液均含0.248 mg·L-1的亞硝酸根。直接上機測定的結(jié)果受到亞硝酸根的干擾，明顯偏高；采用標準加入法和標液中加亞硝酸根的方式可避免干擾，得到正確的檢測結(jié)果。

表4 采用不同標準試驗結(jié)果mg·kg-1

3 小結(jié)與討論

食品、蔬菜、水果中硝酸根離子的測定一般采用3種方法。第一法涉及離子色譜儀，適合大批量樣品，可以同時測定硝酸根和亞硝酸根；第二法為實驗室常用方法，但硝酸根需要通過鎘柱還原成亞硝酸根來測試，前處理煩瑣，需要較強的動手能力，不適合大批量樣品；第三法為紫外分光光度法，較為簡便，試驗過程中所用試劑較少，缺點是不能同時得到亞硝酸鹽結(jié)果［6］。

硝酸根離子和亞硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm處具有等吸收波長的特性，給采用紫外分光光度法測定香椿中硝酸根含量帶來難度。通過標準加入法或在硝酸根標液中加入一定量的亞硝酸根溶液模擬樣品狀態(tài)這兩種方法來消除這一基質(zhì)干擾，既簡單便捷，又確保了數(shù)據(jù)的準確性。

［1］ 陳欣.香椿芽亞硝酸鹽含量變化規(guī)律及亞硝酸鹽降解技術(shù)研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2010.

［2］ 楊玉珍，彭方仁，曹一達.不同種源香椿芽硝酸鹽、亞硝酸鹽及Vc含量變化的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（6）：48-51.

［3］ 喬海濤，時桂英，徐建余，等.不同采收期紅香椿硝酸還原酶活性及亞硝酸鹽含量的變化［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（1）：51-53.

［4］ 蔬菜、水果中硝酸鹽的測定紫外分光光度法：NY/T 1279-2007［S］.

［5］ 食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定：GB 5009.33-2010［S］.

［6］ 李祥，陳宗姮，袁硯，等.亞硝酸鹽對紫外分光光度法測定硝酸鹽的影響［J］.實驗室研究與探索，2014，33（11）：10-14.

［7］ 吳大付，任秀娟，李東方.蔬菜硝酸鹽含量測定方法研究［J］.河南科技學(xué)院學(xué)報，2010，38（3）：36-38.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S-3

A

0528-9017（2017）01-0128-04

文獻著錄格式：朱勇，應(yīng)杰，孫亞米，等.紫外分光光度法檢測香椿中硝酸鹽方法研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（1）：128-131.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170141

2016-07-15

寧波市科技新苗培養(yǎng)計劃（甬教基〔2015〕112號）

朱 勇（1978-），男，浙江普陀人，高級農(nóng)藝師，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究工作，E-mail：zjzszy@163.com。