涂江江　董翠梅　陶利英　劉秀麗　康馬飛

【摘要】 目的：研究PI3K/Akt信號通路在胃癌干細胞中的表達及意義。方法：收集筆者所在醫(yī)院普外科胃癌切除術患者胃癌組織標本，應用腫瘤球懸浮分選法從組織標本中分選出胃癌干細胞和普通腫瘤細胞。比較兩組細胞中PI3K、Akt的蛋白及mRNA的表達情況。結果：RT-PCR檢測結果顯示，胃癌干細胞組的PI3K及Akt的mRNA相對表達量分別為0.680±0.122和0.513±0.121，明顯高于普通胃癌細胞組的0.235±0.086和0.205±0.069，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Western blot檢測結果顯示，胃癌干細胞組的PI3K及Akt的蛋白相對表達量為0.771±0.206和0.601±0.182，明顯高于普通胃癌細胞組的0.215±0.012和0.218±0.028，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：PI3K/Akt信號通路在胃癌干細胞中存在高表達的現(xiàn)象，表明該通路極有可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

【關鍵詞】 胃癌； 干細胞； PI3K； Akt

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.2.084 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）02-0154-02

胃癌屬于普外科常見的惡性腫瘤，源于胃黏膜上皮細胞[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤是一種信號通路疾病。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要細胞信號通路，因此抑制該信號通路成為胃癌靶點治療和預防轉移和復發(fā)的關鍵[2-3]。但目前PI3K/Akt信號通路在胃癌干細胞中的表達研究罕見報道。本研究通過收集胃癌切除術患者胃癌組織標本，應用腫瘤球懸浮分選法從組織標本中分選出胃癌干細胞和普通腫瘤細胞，比較兩組細胞PI3K、Akt的蛋白及mRNA表達量，以期能夠為胃癌的預防和治療提供新的依據和策略，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫(yī)院普外科胃癌切除術患者胃癌組織標本40例?；颊吣挲g為28～53歲，平均（39.5±6.1）歲，所有患者均為首次確診，均未接受過放療或化療，無其他腫瘤病史，無內分泌疾病。CD44、PI3K、Akt抗體均購自美國Abcam公司。小鼠抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

胃癌干細胞的原代培養(yǎng)、分化及鑒定：應用腫瘤球懸浮分選法分選組織標本中胃癌干細胞。具體方法為，先用常規(guī)方法對組織標本進行脫蠟水化，使用微波爐對組織進行抗原修復，將組織中的壞死組織和血管剔除干凈，清洗標本（D-Hanks液）。將組織標本剪碎，再將其消化（胰酶），終止消化后，在離心機中離心，棄上清，將細胞收集、重懸，在其中加入超微磁珠（CD44陽性包被），充分混勻后，將分離株安裝于磁場之上，將分選獲得的細胞置于含有堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、白血病抑制因子及b27的干細胞培養(yǎng)基中。培養(yǎng)箱的參數設置為：37 ℃，5% CO2，飽和濕度。使用CD44+對胃癌干細胞進行標記，使用免疫熒光染色對胃癌干細胞進行鑒定，陽性表達即可以認為其為胃癌干細胞，染色結果為陰性表達則為普通胃癌細胞。

1.3 實時熒光定量PCR檢測兩組細胞PI3K、Akt基因的mRNA表達水平

兩組細胞的總RNA使用Trizol法提取，內參對照為GAPDH，（PI3K、Akt及GAPDH引物均由蘇州金唯智生物科技公司合成）。對總RNA進行逆轉錄和RT-PCR擴增，熒光定量PCR儀為美國ABI公司，7500型。選用20 μl為擴增體系，試驗反應條件：95 ℃、5 min循環(huán)1次；95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，循環(huán)40次；以0.5 ℃從65 ℃逐漸遞增至95 ℃。按照2-△△CT計算Notch1 mRNA的相對表達量，每組均設3個復孔，均進行3次重復試驗。

1.4 Western blot檢測兩組PI3K、Akt的蛋白表達

收集兩組細胞，使用常規(guī)方法提取總蛋白，儲存在-80 ℃冰箱中。取總蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴下以80 V電壓轉至PVDF膜，時間為1.5 h。PBST緩沖液洗膜3次后，封閉1.5 h。剪膜后加入一抗，4 ℃孵育過夜，兔抗人PI3K抗體、兔抗人Akt抗體的稀釋比例均為1∶1000。第2天進行復溫，使用PBST搖擺清洗3次后，加入二抗，室內溫度條件下孵育60 min。條帶結果用凝膠成像分析系統(tǒng)對其進行收集，量化分析用Image J軟件進行處理。

1.5 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0對數據進行分析處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR檢測兩組細胞PI3K、Akt基因的mRNA表達水平

RT-PCR檢測結果顯示，胃癌干細胞組的PI3K及Akt的mRNA相對表達量分別為0.680±0.122和0.513±0.121，明顯高于普通胃癌細胞組的0.235±0.086和0.205±0.069，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 Western blot檢測兩組PI3K、Akt的蛋白表達

Western blot檢測結果顯示，胃癌干細胞組的PI3K及Akt的蛋白相對表達量為0.771±0.206和0.601±0.182，明顯高于普通胃癌細胞組的0.215±0.012和0.218±0.028，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

圖1 Western blot檢測兩組PI3K、Akt的蛋白表達

3 討論

胃干細胞是具有自我更新、無限增殖、定向分化能力的細胞。一旦胃干細胞的基因發(fā)生突變或者微環(huán)境發(fā)生改變時，就會出現(xiàn)增殖不受調控的干細胞，向腫瘤干細胞發(fā)生轉變，引起胃癌的發(fā)生[4]。PI3K信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展上起著重要的調節(jié)作用，具有抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用[5]。在乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、成神經管細胞瘤等多種人類腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)有PI3K信號通路的異?；罨痆6-8]。

對PI3K信號通路進行深入研究，對胃癌的診斷及治療有著深遠的意義[9-11]。早期胃癌、中晚期胃癌中PI3K蛋白和Akt蛋白的陽性表達率均較正常胃黏膜組織高，表明PI3K、Akt與胃癌的形成和惡性進展有關，可能主要通過促進腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞凋亡起作用。程玉等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K活性可誘導凋亡的發(fā)生。PI3K/Akt通路在胃癌細胞的生長、增殖及轉移、侵襲表達方面都具有重要的作用[14]。本課題組推測PI3K/Akt信號通路在胃癌干細胞中可能存在異常表達。本次研究中，通過腫瘤球懸浮分選法分選組織標本中的胃癌干細胞，并進行鑒定均呈陽性表達CD44。通過與普通胃癌細胞比較，發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測結果顯示，胃癌干細胞組的PI3K及Akt的mRNA相對表達量為分別為0.680±0.122和0.513±0.121，明顯高于普通胃癌細胞組的0.235±0.086和0.205±0.069，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Western blot檢測結果顯示，胃癌干細胞組的PI3K及Akt的蛋白相對表達量為0.771±0.206和0.601±0.182，明顯高于普通胃癌細胞組的0.215±0.012和0.218±0.028，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明PI3K/Akt信號通路在胃癌干細胞中異常激活，可能參與胃癌的發(fā)生與發(fā)展，但在PI3K/Akt信號通路如何調控胃癌干細胞的增殖、凋亡及侵襲轉移上還尚不清楚，需下一步著重探討研究。

綜上所述，PI3k/Akt信號通路在胃癌干細胞中高表達，表明它可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

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（收稿日期：2016-09-04）