劉蜀 王蘭 吳培新

hnRNP A2/B1及Mcl-1在乳腺癌中的表達

劉蜀 王蘭 吳培新

目的 檢測乳腺癌組織中hnRNP A2/B1及Mcl-1的表達水平；分析乳腺癌組織中hnRNP A2/B1與抗凋亡基因Mcl-1表達水平及其相關性。方法 選取貴陽市婦幼保健院2005年1月—2009年1月收治的乳腺癌患者40例，同時選取20例乳腺纖維瘤患者作為對照；采用免疫組化方法檢測組織中hnRNP A2/B1及Mcl-1的表達水平。結果（1）40例乳腺癌組織標本中36例有hnRNP A2/B1陽性表達，乳腺纖維瘤組織標本中有3例hnRNP A2/B1陽性表達；40例乳腺癌組織標本中37例有Mcl-1陽性表達，乳腺纖維瘤組織中無表達。乳腺纖維瘤組與乳腺癌組在hnRNP A2/B1及Mcl-1表達水平上差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。hnRNP A2/B1及Mcl-1的表達水平與乳腺癌的TNM分期、是否發(fā)生轉移、腫瘤直徑、Her-2表達水平顯著相關（P＜0．01），而與年齡、激素受體、分化程度沒有相關性 （P＞0．05）。（2）乳腺癌組織標本中hnRNP A2/B1的表達與Mcl-1的表達呈顯著性正相關，Pearson相關系數(shù)為0．795（P＜0．01）。結論 hnRNP A2/B1 及Mcl-1在乳腺癌組織中呈高表達且有明顯的相關性，其高表達水平可能與乳腺癌的發(fā)生及轉移有關。

乳腺癌細胞；hnRNP A2/B1；Mcl-1；細胞凋亡

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，國家原衛(wèi)生部的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明2009年以來乳腺癌已經(jīng)成為中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。乳腺癌的發(fā)生、轉移和預后與多種癌基因的突變及異常表達有密切關系。目前認為，信號分子的異常激活在腫瘤發(fā)生、轉移中起非常重要的作用，其中，以核內(nèi)不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPs）及相關信號分子的激活尤為矚目[1]。作為hnRNPs家族成員之一的核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1是一個RNA結合蛋白，為hnRNP家族的核心成員，可以通過與下游前體mRNA結合，通過選擇性剪切、進行轉錄后調(diào)控[2]。有研究發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1在自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中出現(xiàn)表達上調(diào)的現(xiàn)象[3-4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，hnRNP A2/B1在肺癌及其癌前病變中表達升高，并且與肺癌的上皮間葉轉化有關，提示其在腫瘤生成過程中的重要作用[5]。然而，hnRNP A2/B1在乳腺癌中的作用及調(diào)控轉移的機制目前尚不清楚。

本實驗通過檢測乳腺癌組織中hnRNPA2/B1及Mcl-1的表達，并對hnRNP A2/B1及Mcl-1表達水平進行相關性分析，探討二者對乳腺癌發(fā)生及轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗分組 實驗組：女性，40例，選自貴陽市婦幼保健院2005年1月- 2009年1月乳腺癌患者，其中25例發(fā)生轉移（包括淋巴轉移及遠處轉移），15例未發(fā)生轉移；對照組：女性，20例，選自貴陽市婦幼保健院2005年1月- 2009年1月乳腺纖維瘤患者。全部病例診斷在術中或術后均經(jīng)病理學證實，所有乳腺癌病例術前均未接受任何放射治療或化學療法。腫瘤組織取出后10分鐘內(nèi)放入福爾馬林固定后，做成石蠟切片。

1.1.2 資料 所有患者均記錄年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、乳腺癌TNM分期、是否發(fā)生轉移、Her-2表達水平，激素受體情況。腫瘤分期根據(jù)AJCC（2002，第6版）的乳腺癌TNM分期方法。具體資料見表1。

1.2 主要試劑

hnRNPA2/B1 siRNA（武漢市晶賽生物工程技術有限公司），鼠抗人hnRNP A2/B1單克隆抗體（美國Sigma公司），兔抗人Mcl-1多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），SP-9002小鼠免疫組化試劑盒（北京中杉金橋），SP-9005兔免疫組化試劑盒（北京中杉金橋），0.01M PBS （北京中杉金橋），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋）。

1.3 免疫組化檢測

1.3.1 免疫組化染色 參照免疫組織化學常規(guī)方法：脫蠟和水化-去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性-抗原熱修復-封閉-Envision多聚體孵育-顯色-脫水及透明-中性樹膠封片，進行免疫組織化學檢測。

表1 乳腺癌患者一般資料

1.3.2 結果判斷 每例組織切片隨機觀察5個高倍（HPFs× 400）視野，并計數(shù)500個乳腺癌細胞。按陽性細胞比例將切片分為：（－：無表達＜5%；＋：5%～25%；＋＋：25%～50%；＋＋＋：＞50%）。

1.4 統(tǒng)計學處理方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組均數(shù)間的比較采用相關分析和多因素分析的方法，兩總體均值的比較采用獨立樣本秩和檢驗分析，P＜0.05 判定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測hnRNP A2/B1在乳腺癌細胞中的表達

2.1.1 hnRNP A2/B1表達 在乳腺癌細胞中的表達主要位于胞核內(nèi)，棕黃色顆粒的為陽性表達，40例乳腺癌組織標本中36例有hnRNP A2/B1陽性表達，而作為對照的20例乳腺纖維瘤組織中只有3例hnRNP A2/B1陽性表達（見表2，圖1）。對乳腺癌組與乳腺纖維瘤對照組做兩獨立樣本秩和檢驗，分析結果顯示P＜0.01，說明與乳腺纖維瘤相比，hnRNP A2/B1表達水平在乳腺癌組織中顯著升高（表格2）。

2.1.2 與臨床病理參數(shù)的關系 hnRNP A2/B1的表達水平與乳腺癌患者的年齡、分化程度、激素受體水平?jīng)]有相關性（P＞0.1）；而與乳腺癌患者的TNM分期、是否發(fā)生轉移、腫瘤直徑及Her-2表達顯著相關（P＜0.01）（見表3，圖1）。

表2 兩組組織標本中hnRNP A2/B1陽性表達

圖1 兩組組織標本中hnRNP A2/B1的表達

2.2 免疫組化檢測乳腺癌細胞中Mcl-1的表達

2.2.1 Mcl-1表達 Mcl-1在乳腺癌細胞中的表達主要位于胞漿內(nèi)，棕黃色的為陽性表達，40例乳腺癌組織標本中37例有Mcl-1陽性表達，而作為對照的20例乳腺纖維瘤組織中無表達（見表4，圖2）。對乳腺癌組與乳腺纖維瘤對照組做兩獨立樣本秩和檢驗，分析結果顯示，P＜0.01，說明乳腺纖維瘤組與乳腺癌組在Mcl-1表達水平上存在顯著性差異（見表4）。

2.2.2 與臨床病理參數(shù)的關系 Mcl-1的表達水平與乳腺癌患者的年齡、分化程度、激素受體水平?jīng)]有相關性（P＞0.05）；而與乳腺癌患者的TNM分期、是否發(fā)生轉移、腫瘤直徑及Her-2表達顯著相關（P＜0.01）（見表5，圖2）。

2.3 hnRNP A2/B1 與Mcl-1相關性分析

對hnRNP A2/B1表達水平與Mcl-1表達水平做相關分析。兩者的Pearson相關系數(shù)為0.795（P＜0.01），呈明顯的正相關性，提示hnRNP A2/B1表達與Mcl-1表達在乳腺癌組織中有顯著的相關關系。

3 討論

核內(nèi)不均一性核糖核蛋白（hnRNPs）及相關信號分子的激活在腫瘤發(fā)生、轉移有重要的作用。hnRNP是一種核內(nèi)的RNA結合蛋白[6]，它是由 30多個蛋白質(zhì)構成的復合體，包括A1-U等 30多個小分子，特別是A、B組為基本核心成分。hnRNP A2/B1是一種重要的RNA連接蛋白，是細胞核中異質(zhì)性細胞核糖蛋白核心復合體的主要成分，參與許多重要的細胞生理作用，包括RNA 的拼接，Pre-mRNA的成熟和降解，端粒、端粒酶DNA 序列的調(diào)節(jié)，mRNA 由胞核到胞質(zhì)的轉運、轉錄后調(diào)節(jié)，細胞有絲分裂、成熟、分化及凋亡的調(diào)節(jié)等[7]。目前越來越多的證據(jù)支持hnRNP A2/B1與生長調(diào)節(jié)和癌變存在密切關系[8]。

在本實驗中發(fā)現(xiàn)40例實驗組乳腺癌組織標本中36例hnRNP A2/B1陽性表達，而作為對照組的乳腺纖維瘤組織中只有3例hnRNP A2/B1陽性表達。實驗組與對照組在hnRNP A2/B1表達水平上存在顯著性差異（P＜0.01）。hnRNP A2/B1的表達水平與乳腺癌的TNM分期、是否發(fā)生轉移、腫瘤直徑、Her-2表達水平顯著相關（P＜0.01），而與年齡、激素受體、分化程度沒有相關性（P＞0.05）。研究結果表明，hnRNPA2 /B1在正常與良性組織的不表達或低表達，而惡性組織高表達，良性與惡性組織中表達存在明顯差異。此外，盧兆桐等[9]在肺癌的研究也發(fā)現(xiàn)病變越晚 ，hnRNP A2/B1表達陽性率越高，hnRNP A2/B1的表達水平與乳腺癌TNM分期、腫瘤直徑及侵襲轉移明顯相關。

表3 乳腺癌組織標本中hnRNP A2/B1表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關系

表4 兩組組織標本中Mcl-1陽性表達

圖2 兩組組織標本中Mcl-1的表達

表5 乳腺癌組織標本中Mcl-1表達水平與臨床病理參數(shù)之間的相關性

Bcl-2家族成員在細胞凋亡的基因調(diào)控過程中起著至關重要的作用，Mcl-1是Bcl-2家族成員的抗細胞凋亡基因，Mcl- 1基因位于人類染色體 1q21，該區(qū)域在腫瘤性疾病及其癌前病變中是一個易變區(qū)域，Mcl- 1可與其他蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞的凋亡。在實驗組的40例乳腺癌組織標本中37例Mcl-1陽性表達，而作為對照組的乳腺纖維瘤組織中無表達，實驗組與對照組在Mcl-1表達水平上差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而且MCL-1的表達水平與乳腺癌的TNM分期、是否發(fā)生轉移、腫瘤直徑相關（P＜0.01），而與年齡、分化程度無關（P＞0.05）。表明Mcl-1的表達水平可能與乳腺癌發(fā)生及轉移有密切關系。本實驗還發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1和Mcl-1有明顯的相關性，且均與Her-2表達水平呈正相關，而Her-2是乳腺癌的重要預后指標，提示hnRNP A2/ B1和Mcl-1與乳腺癌的預后有關，也提示Mcl-1 的表達水平可以為乳腺癌治療藥物干預提供新的靶點，為乳腺癌的治療開辟新 途徑。

[1] Zech VF，Dlaska M，Tzankov A，et a1． Prognostic and diagnostic relevance of hnRNP A2／ B1，hnRNP B1 and S100 A2 in nonsmall cell lung cancer[J]． Cancer Detect Prev，2006，30（5）： 395-402．

[2] Sofola OA，Jin P，Qin Y，et al． RNA-binding proteins hnRNP A2/B1 and CUGBP1 suppress fragile X CGG premutation repeatinduced neurodegeneration in a Drosophila model of FXTAS[J]． Neuron，2007，55（4）：565-571．

[3] Pino I ，Pio R，Toledo G，et a l． Altered patterns of expression of members of the heterogeneous nuclear ribonucleo protein（hnRNP） family in lung cancer[J]． Lung Cancer，2009，41（2）： 131-143．

[4] E Sueoka，Y Goto，N Sueoka，et al ． Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein B1 as a new marker of early detection for human lung cancers[J]． Cancer Res，1999，59（7）：1404-1407．

[5] Tauler J，Zudaire E，Liu H，et al． hnRNP A2/B1 Modulates Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Cancer Cell Lines[J]． Cancer research，2010，70（18）：7137-7147．

[6] 邵志敏． 乳腺癌轉移機制的研究及其臨床應用[J]． 中華乳腺病雜志（電子版），2009，3（5）：475-479．

[7] Zhou J，Mulshine JL，Unsworth EJ，et al． Purification and characterization of a protein that permits early detect ion of lung cancer[J]． J Biol C hem，1996，271（18）：10760-10766．

[8] Kamma H，F(xiàn)ujimoto M，F(xiàn)ujiwara M，et al． Interaction of hnRNP A2/B1 Isoforms with Telomeric ssDNA and the in Vitro Function[J]． Biochem Biophys Res Commun，2001，280（3）：625-630．

[9] Lu ZT ，F(xiàn)u Q ，Geng M ，et al． Expression and it s research of het2 erogeneous nuclear ribo nucleoprotein A2/B1 in non2small cell lung cancer[J]． Prac J Med Pharm，2008，20（3）：1612-1613．

hnRNP A2/B1 and Mcl-1 Expression in Breast Cancer

LIU Shu WANG Lan WU Peixin Galactophore Department, Guiyang Maternal and Child Health Care Hospital, Guiyang Guizhou 550003, China

Objective To explore the expression of hnRNP A2/B1 and Mcl-1 in breast cancer tissue samples and analyze the correlation between these two genes. Methods 40 breast cancer patients from Guiyang Women and Children’s Hospital since January, 2005 to January, 2009 were included into this study. 20 breast fibroadenoma patients were also included as control. Results (1) 36 of 40 breast cancer tissue samples and 3 of 20 breast fbroadenoma tissue samples were hnRNP A2/B1 positive. 37 of 40 breast cancer tissue samples were Mcl-1 positive, no breast fbroadenoma showed Mcl-1 positive. There was a significant difference of hnRNP A2/B1 and Mcl-1 expression between breast cancer and breast fbroadenoma (P ＜0.01). The expression of hnRNP A2/B1 and MCL-1 were correlated with breast cancer TNM staging, metastasis, tumor size and Her-2 expression (P ＜ 0.01), while not related with age, hormone receptor and differentiation (P > 0.05). (2) hnRNP A2/B1 and Mcl-1 expression in breast cancer tissue samples showed a positive correlation. The Pearson correlation coeffcient is 0.795 (P ＜ 0.01). Conclulsion hnRNP A2/B1 and Mcl-1 are highly expressed in breast cancer patients and their expressions showed a signifcant positive correlation. The high expression of hnRNP A2/B1 and Mcl-1 may be related with breast cancer carinogenesis and metastasis.

breast cancer cell; hnRNP A2/B1, Mcl-1; apoptosis

R365

A

1674-9316（2017）02-0137-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．02．087

貴陽市婦幼保健院乳腺科，貴州 貴陽 550003