張歡張全偉王琪馬友記張勇趙興緒，

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，蘭州 730070）

牦牛TMEM-18基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián)分析

張歡1張全偉2王琪1馬友記3張勇1趙興緒1，2

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，蘭州 730070）

跨膜蛋白18基因（TMEM-18）是一個末端為低聚嘧啶的基因，與動物生長發(fā)育密切相關(guān)。為了研究牦牛TMEM-18 基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)系。以192頭天祝雌性牦牛血樣NDA構(gòu)建混合池，擴增TMEM-18基因內(nèi)含子1和外顯子5的序列。運用BLAST和Chromas軟件分析突變位點，運用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（HRM）統(tǒng)計基因型分型，采用SHEsis 軟件進行基因型頻率和等位基因頻率計算，同時對多態(tài)位點進行配對連鎖不平衡和單倍型分析，運用SPSS21.0分析基因多態(tài)位點與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，牦牛TMEM-18基因內(nèi)含子1處存在2個多態(tài)位點，分別是861（A/G）和1267（C/T），外顯子5處存在1個多態(tài)位點為4 447（C/T）。關(guān)聯(lián)分析表明，牦牛TMEM-18基因861（A/G）位點的不同基因型與牦牛的體高、體重、胴體重和屠宰率差異性顯著（P＜0.05）；1267（C/T）位點的不同基因型與牦牛的體高、體重和屠宰率差異性顯著（P＜0.05），而牦牛TMEM-18基因4447（C/T）位點的不同基因型與牦牛的體斜長、管圍、胸圍、體重、胴體重、凈肉重、凈肉率和屠宰率均存在顯著性差異（P＜0.05）。通過單倍型分析發(fā)現(xiàn)群體中存在3種單倍型組合，即ACC單倍型、GTC單倍型和GTT單倍型，其中ACC單倍型組合個體數(shù)目明顯多于其他單倍型組合，為優(yōu)勢單倍型。本實驗揭示TMEM-18基因可作為牦牛生產(chǎn)性能開發(fā)的候選分子標記，為牦牛遺傳資源的利用、開發(fā)與新品種的選育提供依據(jù)。

牦牛；TMEM-18基因；SNP；HRM；生產(chǎn)性狀

牦牛（Bos grunniens）是長期放牧于海拔高達3 000 m以上的高寒地區(qū)特殊牛種，屬于地方類半野生型的種群，是經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育而形成的高原特有畜種資源。牦牛既是我國特有的畜種資源，也是我國稀有而珍貴的遺傳資源［1］。牦牛生長發(fā)育緩慢、群體規(guī)模小、生產(chǎn)性能低下，從而影響牦牛的經(jīng)濟價值和使用價值［2］。

近年來，人們已對與牦牛生長發(fā)育等相關(guān)基因進行了分子結(jié)構(gòu)特征、多態(tài)性和表達分析，且有部分侯選基因的研究相對比較深入。如肌肉生長抑制素（MSTN）基因和胰島素樣生長因子家族（IGF-IR）基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）對不同年齡階段的牦牛生產(chǎn)性能有顯著影響［3］；胰島素樣生長因子2（IGF-2）基因的SNPs對牦牛的生長發(fā)育具有顯著差異［4］；生長分化因子10（GDF-10）、印度刺猬因子（IHH）、黑素皮質(zhì)素受體-4（MC4R）等基因的SNPs對不同牦牛種群的生產(chǎn)性狀有顯著影響［5］等。上述基因均可作為牦牛選育的候選基因。

研 究 發(fā) 現(xiàn)，跨膜 蛋 白18（Transmembrane Proteins-18，TMEM-18）是一個末端為低聚嘧啶的基因，該基因能夠在體內(nèi)和體外參與神經(jīng)干細胞遷移的調(diào)節(jié)［6］。Hindorff等［7］通過全基因組關(guān)聯(lián)分 析（Genome-wide association study，GWAS） 發(fā)現(xiàn)TMEM-18基因與肥胖密切相關(guān)。此后研究表明TMEM-18基因主要通過大腦中的神經(jīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)脂肪細胞分化從而調(diào)控肥胖［8］；而TMEM-18基因除神經(jīng)系統(tǒng)中表達外，在不同組織中均見表達［9］。近年來，人類全基因組的研究發(fā)現(xiàn)，TMEM-18基因存在與人肥胖連鎖的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），該基因的多個SNPs位點（rs6548238 、rs2867125、rs4854344和rs756131）均可增加人體質(zhì)指數(shù)（Body Mass Index，BMI）和體重［10-15］。早期研究發(fā)現(xiàn)TMEM-18基因可調(diào)節(jié)小鼠的生長發(fā)育，不僅在小鼠大腦中強烈表達，而且在小鼠其他組織中也有表達［16］。在TMEM-18基因的家畜動物研究中，大白豬、南陽牛、郟縣紅牛、草原紅牛、魯西牛和秦川牛中均檢測發(fā)現(xiàn)TMEM-18基因的多個SNPs位點均對家畜動物的生長性能有顯著影響［17，18］。因此，我們推測TMEM-18可能與牦牛生長發(fā)育及其生產(chǎn)性能有密切關(guān)系。然而，牦牛TMEM-18基因的結(jié)構(gòu)、功能及SNPs與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián)分析的研究迄今尚未見報道。本實驗擬對牦牛TMEM-18基因的SNPs進行檢測，初步篩選與牦牛生產(chǎn)性狀相關(guān)的多態(tài)位點，分析其遺傳變異與生長性能的關(guān)系，從而為今后牦牛遺傳改良和選育以及TMEM-18基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣本采自于甘肅省天?？h某屠宰場，選取2-3歲的牦牛群體采集192頭天祝雌性牦牛血樣。頸靜脈采血3 mL，輕微振蕩混勻后于-80℃保存?zhèn)溆?。實地測量并記錄其生長性狀（體斜長、體高、胸圍、管圍、體重）及屠宰性能（胴體、凈肉、屠宰率、凈肉率）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 利用血液基因組DNA提取試劑盒（Omega Bio-Tek，D6919-01B）提取基因組DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后使用紫外分光光度計檢測DNA的濃度。從上述檢測合格的DNA樣本中隨機抽取20 μL稀釋至18-20 ng/μL，用作PCR擴增的模板，其余的母液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA池構(gòu)建 選取稀釋后的200份DNA樣本，每個樣本各取1 μL，混合均勻，構(gòu)建牦?；蚪MDNA混合池。

1.2.3 引物設(shè)計和PCR擴增 參考NCBI數(shù)據(jù)庫中牦牛的TMEM-18基因（登錄號：NW_005393077.1），采用交叉重疊原理［15］運用Primer 5.0軟件設(shè)計3對引物對部分內(nèi)含子1和外顯子5區(qū)域進行擴增（表1），引物由上海生工生物科技有限公司合成。

PCR擴增體系（25 μL）：20 ng/μL的基因組DNA 1 μL，10 pmol 的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix（ 內(nèi) 含Taq DNA 聚 合 酶、Mg2+、dNTPs 等）（北京，百泰克）12.5 μL，滅菌超純水9.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，復性30 s（退火溫度見表1），72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

表1 鑒定牦牛TMEM-18基因突變位點所用引物信息表

1.2.4 DNA測序分析 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京，全式金）回收純化后送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果通過DNAMAN軟件和Chromas軟件比對分析。

1.2.5 HRM小片段法基因分型 針對所發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點，利用Light Scanner Primer Design Software（Idaho公司，美國）設(shè)計出用于高分辨率熔解曲線（High Resolution melting，HRM）分析多態(tài)位點的引物（表2），對試驗群體樣本進行基因型分析［19，20］。合成2對高低溫內(nèi)標［21］（表 3）對溶解曲線進行校正，提高分型的精確度。

表2 HRM 分析多態(tài)位點的引物信息表

表3 高低溫內(nèi)標序列

HRM-PCR擴增體系（11 μL）：20 ng/μL的基因組DNA 1 μL，10 pmol 的上下游引物各0.2 μL，2×Taq PCR Master Mix（ 內(nèi) 含Taq DNA 聚 合 酶、Mg2+、dNTPs 等）（北京，百泰克）5 μL，滅菌超純水3.6 μL，10×LC Green 飽和染料（美國，Idaho）1 μL。

HRM-PCR反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；94℃變性20 s，Tm（℃）（表2）復性20 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

高低溫內(nèi)標稀釋方法：1 OD內(nèi)標單鏈加 400 μL水，退火體系：飽和氯化鈉1 μL，內(nèi)標互補雙鏈各1 μL，補水至10 μL，95℃水浴3 min，緩慢降至室溫。

HRM熒光信號采集：將稀釋好的高低溫內(nèi)標各1 μL加入HRM-PCR產(chǎn)物單孔中，95℃水浴30 s；25℃水浴30 s；放入LightScanner 96（美國，Idaho）中收集熒光信號。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)群體遺傳學理論［22］計算基因型和等位基因頻率，統(tǒng)計牦牛群體TMEM-18基因多態(tài)位點的純和度Ho、雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne、多態(tài)信息含量PIC［23-25］，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用SHEsis軟件進行配對連鎖不平衡分析。采用SPSS 21.0軟件對TMEM-18基因多態(tài)性位點在牦牛群體中的基因型分布進行卡方檢測，并對不同基因型與生產(chǎn)性狀間的關(guān)聯(lián)性進行分析?？紤]到性別、環(huán)境和年齡因素的影響，采用固定模型分析基因型效應(yīng)對體尺性狀的影響。

式中，Yijk：個體表型記錄；u：群體均值；Gi：標記基因型效應(yīng)；Sj：性別因素；Ak：年齡效應(yīng)；Eijk：隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物

以牦牛血液基因組DNA為模板，根據(jù)設(shè)計的引物進行PCR特異性擴增，結(jié)果見圖1。由圖1可知PCR擴增產(chǎn)物均為單一特異性條帶。產(chǎn)物經(jīng)過測序后長度分別為1 001、953和722 bp，與引物設(shè)計時預期長度一致。

圖1 TMEM-18基因PCR擴增電泳圖

2.2 牦牛TMEM-18基因HRM方法的分型

對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果（圖 2）顯示，牦牛TMEM-18基因內(nèi)含子1存在2個多態(tài)位點，分別是861（A/G）和1267（C/T），外顯子5存在1個多態(tài)位點 4447（C/T）。通過DNA混合池對牦牛TMEM-18基因測序后，應(yīng)用高分辨率熔解曲線法對3個多態(tài)位點進行基因型分析（圖 3）。HRM 結(jié)果（圖 3-A）顯示，牦牛TMEM-18基因861（A/G）位點處存在3種基因型，分別是AA、AG和GG。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，AA基因型屬于優(yōu)勢基因型（n=130），個體數(shù)明顯多于AG（n=56）和GG（n=6）型；牦牛TMEM-18基因1267（C/T）和 4447（C/T）位點處均存在3種基因型，分別為CC、CT和TT 型（圖3-B和圖 3-C）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CC基因型均屬于優(yōu)勢基因型。

圖2 TMEM-18基因3個多態(tài)位點的測序峰圖

2.3 牦牛TMEM-18基因多態(tài)位點遺傳多態(tài)性的分析

對牦牛TMEM-18基因多態(tài)位點進行基因型頻率和基因頻率以及相關(guān)遺傳特性指標計算，結(jié)果（表4）顯示，牦牛TMEM-18基因 861（A/G）的優(yōu)勢等位基因為A，其基因頻率為0.823；牦牛TMEM-18基因 1267（C/T）和 4447（C/T）的優(yōu)勢等位基因均為C，其基因頻率均大于0.8 以上。3個位點均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗發(fā)現(xiàn)，3個位點均未達到Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05）（表 5）。配對連鎖不平衡分析結(jié)果（表 6）表明，牦牛TMEM-18基因中上述位點間存在強連鎖不平衡（D'＞0.75，r2＞0.33）。多態(tài)位點的單倍型組合的分布及頻率結(jié)果（表 7）顯示，192頭牦牛群體中存在3種單倍型，其中ACC在研究群體中個體數(shù)最多（＞80%），而GTC和GTT單倍型在群體中只存在少量的個體。

圖3 TMEM-18基因3個多態(tài)性位點HRM分型曲線

表4 TMEM-18基因突變位點的基因型頻率及基因頻率

表5 TMEM-18基因不同突變位點的遺傳多態(tài)性

表6 TMEM-18基因多態(tài)位點配對連鎖不平衡分析

表7 TMEM-18基因多態(tài)位點的單倍型組合的分布及頻率

2.4 TMEM-18基因基因型及單倍型與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

牦牛TMEM-18基因861（A/G）和1267（C/T）位點的不同基因型與不同個體的體高均存在顯著差異（P＜0.05），而牦牛體斜長、管圍和胸圍差異均不顯著（P＞0.05），其中861（A/G）位點的GG 基因型的個體的生產(chǎn)性能均高于AA和AG基因型的個體；和1267（C/T）位點的TT 基因型的個體的生產(chǎn)性能均高于CC、CT基因型個體；牦牛TMEM-18基因4447（C/T）位點的不同基因型個體在體斜長、管圍和胸圍均存在差異顯著（P＜0.05），而體高差異不顯著（P＞0.05），其中CT基因型的個體的生產(chǎn)性能均高于CC、TT基因型個體（表8）。

牦牛TMEM-18基因861（A/G）位點的不同基因型個體的體重、胴體重和屠宰率均存在顯著差異（P＜0.05），而凈肉重和凈肉率差異均不顯著（P＞0.05），其中GG基因型的個體的屠宰性能均高于AA和AG基因型的個體；1 267（C/T）位點的不同基因型個體的體重、屠宰率存在顯著差異（P＜0.05），而胴體重和凈肉重和凈肉率差異均不顯著（P＞0.05），其中TT基因型的個體的屠宰性能均高于CC和CT基因型的個體；4 447（C/T）位點的不同基因型個體的體重、胴體重、凈肉重、凈肉率和屠宰率均存在顯著差異（P＜0.05），其中CT基因型的個體的屠宰性能均高于CC和TT基因型的個體（表9）。

表8 牦牛TMEM-18基因多態(tài)位點不同基因型與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析

表9 牦牛TMEM-18基因多態(tài)位點不同基因型與屠宰性能關(guān)聯(lián)分析

3 討論

本實驗通過DNA混合池測序得到牦牛TMEM-18基 因3個SNPs（861（A/G）、1 267（C/T） 和4 447（C/T）），其中1 267（C/T）和4 447（C/T）兩個位點為TMEM-18基因上新發(fā)現(xiàn)的SNPs，其他物種均未見報道。牦牛TMEM-18基因861（A/G）位點存在3種基因型，分別是AA、GG和AG 型，且等位基因A是優(yōu)勢等位基因；1 267（C/T）和4 447（C/T）位點均存在3種基因型，分別是CC、TT和 CT 型，且等位基因C是優(yōu)勢等位基因。這3個多態(tài)位點的優(yōu)勢等位基因頻率均達到了0.8以上，這可能與樣本的種群和自然環(huán)境有關(guān)。此外，這3個多態(tài)位點均為低度多態(tài)，遺傳變異低，選擇余地較小，這可能因牦牛長期生長在高海拔環(huán)境下，長年的高寒、缺氧等惡劣的自然環(huán)境下使有效等位基因和多態(tài)信息含量降低。而連鎖不平衡是單倍型基因非隨機分布的現(xiàn)象。若兩個連鎖基因座的兩個等位基因頻率分別為p1和p2，這兩個等位基因組成的單體型的頻率h如果為預期值（plxp2），則稱這兩個基因座是連鎖平衡，如果h高于plxp2就存在連鎖不平衡［26］。本實驗中，Hardy-Weinberg平衡檢驗發(fā)現(xiàn)，3個位點均未達到Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），這可能與本次實驗的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)有關(guān)，還需要進一步擴大樣品進行研究，同時也表明牦牛品種的選育、遷移和遺傳漂變等因素對TMEM-18基因的突變造成影響，可能導致未達到平衡。近年來在中國牛上也開始了對TMEM-18 基因的序列測序和多態(tài)性研究，馬偉［17］在不同品種的牛TMEM-18基因中共發(fā)現(xiàn)4個不同SNPs（1085（T/G）、2303（A/G）、3835（G/A）和3865（G/A）），均未達到Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），與本結(jié)果相似。

牦牛TMEM-18基因內(nèi)含子1處存在2個多態(tài)位點，分別是861（A/G）和1267（C/T）。內(nèi)含子雖為基因中無編碼功能的序列，但其對基因表達調(diào)控有著決定作用［27］。一些基因中的內(nèi)含子對基因表達具有正調(diào)控作用，Chang等［28］發(fā)現(xiàn)豬MyHC基因內(nèi)含子中存在重要調(diào)控元件，可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始來增強基因表達。而張冉［29］檢測魯西黃牛TMEM-18基因在起始密碼子上游541 bp和861 bp處存在SNPs位點，且證實861 bp處的SNPs位點影響啟動子活性，表現(xiàn)為負調(diào)控作用。由此推測，牦牛TMEM-18基因內(nèi)含子861（A/G）突變也可能參與介導了該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此，本研究對了解與分析該基因遺傳特征及其對重要經(jīng)濟性狀的影響仍然有重要的意義。

關(guān)聯(lián)分析表明，牦牛TMEM-18基因861（A/G）位點的不同基因型與牦牛的體高、體重、胴體重和屠宰率差異性顯著（P＜0.05）；1267（C/T）位點的不同基因型與牦牛的體高、體重和屠宰率差異性顯著（P＜0.05），而牦牛TMEM-18基因4447（C/T）位點的不同基因型與牦牛的體斜長、管圍、胸圍、體重、胴體重、凈肉重、凈肉率和屠宰率均存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，本實驗在牦牛后代群體中找到了3種單倍型組合，其中ACC單倍型組合個體數(shù)目高達80%以上，表明ACC單倍型為主要單倍型。這與目前相關(guān)文獻對動物TMEM-18基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性能關(guān)聯(lián)分析研究報道的相關(guān)結(jié)論一致。例如，林平［16］在大白豬TMEM-18基因中共發(fā)現(xiàn)了1個SNPs（91（T/G）），且與豬生長性狀和腰薦結(jié)合處背膘厚性狀顯著關(guān)聯(lián)（P＜0. 01），說明TMEM-18基因具有在選種中運用的價值。馬偉［17］在不同品種的牛TMEM-18基因中共發(fā)現(xiàn)4個不同SNPs，對中國牛的體尺性狀有顯著影響，并說明在其4個新SNPs中，有3個可作為中國牛品種體尺和體重等生長性狀選擇分子育種的候選標記。因此本研究推測TMEM-18基因上的3個多態(tài)位點可影響牦牛的生長性狀。綜上所述，牦牛TMEM-18基因可作為牦牛生產(chǎn)性狀有關(guān)的候選分子標記，對提高分子標記輔助選擇的準確性，為今后牦牛分子育種提供主要的理論依據(jù)，為牦牛遺傳育種提供參考。

4 結(jié)論

牦牛TMEM-18基因3個多態(tài)位點與牦牛的體尺指標和屠宰性能顯著相關(guān)，可以嘗試作為牦牛生長性狀的候選分子標記，應(yīng)用于牦牛分子標記輔助育種中。

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（責任編輯 李楠）

Polymorphism of TMEM-18 Gene and Its Correlation with Production Traits in Yak

ZHANG Huan1ZHANG Quan-wei2WANG Qi1MA You-ji3ZHANG Yong1ZHAO Xing-xu1，2
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070；3. College of Animal Science＆Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070）

The TMEM-18（transmembrane protein 18）gene is the one with oligomer in its terminal，and closely related to the growth and development of animal. This study aims to study the correlation between polymorphism of TMEM-18 gene and production traits in yak. Firstly，constructing DNA mixing pool with blood samples from 192 female Tianzhu yaks，and the intron1 and exon5 of TMEM-18 gene were amplified. Then，BLAST and Chromas were used to analyze the mutation sites in TMEM-18 gene，high-resolution melting curve（HRM）to determine the genotype，software SHEsis to calculate and the frequencies of genotypes and alleles and to analyze the linkage disequilibrium and haplotypes in the SNPs of TMEM-18 gene，and software SPSS21.0 to understand the correlation between gene polymorphic loci and product traits. The experimental results showed that the intron1 of yak TMEM-18 gene contained 2 polymorphic loci of 861（A/G）and 1 267（C/T），and the exon5 contained 1 polymorphic locus of 4 447（C/T）. Correlation analysis indicated that the different genotypes at locus 861（A/G）resulted in the significant differences on body height，body weight，carcass weight，and slaughter rate（P＜0.05）；while the varied genotypes at locus 1 267（C/T）caused significant differences on body height，body weight and slaughter rate（P＜0.05）；and the various genotypes at locus 4 447（C/T）let to significant differences on body length，tube girth，chest girth，body weight，carcass weight，meat weight，netmeat rate，and slaughter rate（P＜0.05）. There were 3 haplotype combinations in the yak populations，namely ACC，GTC and GTT. Among them，the number of ACC was significantly more than that of others，i.e.，it was dominant haplotype. The results suggested that the TMEM-18 gene could be used as molecular-marker candidate for developing the production traits of yak，providing a scientific basis for the utilization and development of yak genetic resources and breeding of new varieties.

yak；TMEM-18 gene；SNP；HRM；production traits

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.013

2016-06-04

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2013AA102503-3）

張歡，女，碩士研究生，研究方向：動物醫(yī)學工程；E-mail：1373707490@qq.com

趙興緒，博士，教授，博士生導師；E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn