孫黎 周茜萍 齊梓云 王夢瑤 陳福龍

（石河子大學生命科學學院，石河子 832000）

油葵種子特異啟動子Ha ds10 G1的克隆及功能鑒定

孫黎 周茜萍 齊梓云 王夢瑤 陳福龍

（石河子大學生命科學學院，石河子 832000）

從油葵中克隆得到LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因的啟動子序列，并對其進行功能分析。利用PCR 技術從油葵品種“矮大頭“基因組DNA中分離Ha ds10 G1基因上游的調控序列，將其與GUS 基因融合，構建種子特異性表達載體pBI121-PHa ds10，通過根癌農(nóng)桿菌介導法轉化煙草（Nicotiana tabacum）NC89，對再生植株進行PCR、RT-PCR和GUS組織化學分析，以檢測GUS基因在轉基因煙草中的表達情況。結果表明，油葵Ha ds10 G1基因啟動子長度為 1 417 bp，與已報道的向日葵Ha ds10 G1基因啟動子序列同源性為89.42%。作用元件分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域除了具有啟動子核心調控序列外，還含有多個與組織特異性、激素、逆境等表達相關的順式作用元件，如RY重復元件、ABRE元件、TC-rich元件等。轉基因植株的PCR結果顯示，成功地獲得了轉基因陽性植株；GUS活性檢測表明，該啟動子序列僅能夠驅動GUS基因在煙草種子表達，而在根、莖 、葉等組織中均未檢測到GUS基因表達。因此，油葵LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因上游1 417 bp片段具有種子特異性啟動子功能。研究結果為油葵等油料作物的油脂遺傳改良提供組織特異性啟動子。

油葵；種子特異性啟動子；GUS染色；煙草

油葵是油用向日葵（Helianthus annuus L.）的簡稱，菊科向日葵屬植物，其適應性廣，耐干旱、抗鹽堿、耐貧瘠，是中國北方重要的油料作物。以油葵種子榨取的葵花油具有豐富的營養(yǎng)價值，富含不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸，其中亞油酸含量高達50%-70%，而且富含維生素E和蛋白質，是一種優(yōu)質的食用油，同時也是具有廣闊開發(fā)前景的生物柴油能源植物［1，2］?；谙蛉湛匾慕?jīng)濟價值以及遺傳轉化技術在向日葵中的應用［3-6］，各類型的啟動子迫切需要應用到油葵的基因工程研究中。

目前用于農(nóng)作物遺傳改良的啟動子多屬于組成型啟動子，如CaMV 35S啟動子［7］。由于其為組成型表達，在轉基因植物的所有組織和發(fā)育時期高表達外源基因，將會增加植物的代謝負擔和能量浪費，而且容易對農(nóng)作物的生長造成不良影響，導致轉基因作物的農(nóng)藝性狀較差。種子特異啟動子（Seedspecific promoter）可以使外源基因在種子里特異表達，按照人們的意愿調節(jié)植物代謝途徑，特異性提高種子中特定營養(yǎng)物質的含量，最大限度地減少對農(nóng)作物其他代謝途徑的影響。因此，種子特異啟動子的研究對于基因工程的發(fā)展和農(nóng)作物品質改良具有重要意義，也為轉基因植物的安全性推廣提供了新思路［8，9］。

晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（Late embryogenesis abundant protein，LEA）是植物胚胎發(fā)育后期大量積累的一大類蛋白質，一般伴隨著種子或胚胎的成熟而形成，在種子萌發(fā)時很快消失。除此之外，許多營養(yǎng)組織可以在ABA、水分和低溫脅迫等誘導下轉錄LEA基因［10］。根據(jù)氨基酸序列或親水性，可將LEA蛋白分為6個家族，其中第一組LEA蛋白具有多拷貝串連的20個親水氨基酸序列，富含高比例的帶電荷氨基酸和甘氨酸［11］。Almoguera［12］和Prieto-Dapena等［13］對向日葵（Helianthus annuus L.）種子LEA蛋白基因Ha ds10 G1進行了克隆和表達調控模式研究發(fā)現(xiàn)，該基因屬于第一組（Group 1）LEA蛋白家族，具有種子特異性表達的特點，尤其在成熟的干種子（dry seed）中大量積累。

煙草是研究植物啟動子功能常用的模式植物，具有遺傳轉化方法成熟，轉化效率高，生長周期短，研究背景清楚，易于后續(xù)分析等優(yōu)點。本研究從油葵品種“矮大頭”基因組中克隆該基因上游1 417 bp的調控序列，分析其順式作用元件，并將該片段與GUS報告基因重組，構建報告表達載體，轉入煙草中進行功能驗證，以期為油葵遺傳改良提供可利用的組織特異性啟動子奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為油葵（Helianthus annuus L.）品種“矮大頭”，種植于石河子大學試驗場。其籽實含油率高達50%，且抗病耐旱，適應性強；野生型煙草（Nicotiana tabacum）為NC89品種，為本實驗室保存。

pBI121質粒為本實驗室保存，大腸桿菌Top10，農(nóng)桿菌GV3101，pUC-T載體，各種限制性內切酶、反轉錄酶以及實驗所用試劑盒均購自TaKaRa生物有限公司，Taq DNA聚合酶購自康為世紀生物科技有限公司（北京），其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純，實驗所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 油葵基因組DNA的提取 以油葵的幼葉為材料提取DNA，采用改良的CTAB法［14］。

1.2.2 Hads10 G1啟動子的克隆和序列分析 根據(jù)Prieto等［13］報道的序列（AJ224116），應用Primer Premier 5.0設計引物擴增Hads10 G1基因的啟動子。引物序列為：上游引物（SL73）：5'-CCCAAGCTTA GGATACTCGTACACACC-3'（Hind Ⅲ）；下游引物（SL80）：5'-TGCTCTAGATTTGTTCACTCTTTTAAC-3'（Xba I）。其中劃線部分為加入的酶切位點。PCR擴增條件為：94℃預變性3 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒純化后連入pUC-T載體，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，通過菌落PCR篩選、酶切和測序鑒定獲得重組質粒，命名為pUCT-Ha ds10。測序由生工生物工程有限公司完成，并用DNAMAN 軟件對其進行序列分析。使用在線工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析啟動子的特征元件。

1.2.3 pBI121- PHa ds10 種子特異性表達載體的構建 以植物表達載體pBI121為基礎，用油葵Ha ds10 G1啟動子替換原有的CaMV 35S 啟動子，與GUS 報告基因融合構建獲得種子特異性表達載體pBI-PHa ds10。利用Hind Ⅲ、Xba I分別雙酶切pUC-T-Ha ds10和pBI121質粒，并分別回收pUC-THa ds10小片段和pBI121大片段，用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，然后提取質粒DNA，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定正確后，獲得重組種子特異性表達載體pBI-PHa ds10。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導煙草的遺傳轉化 利用凍融法將重組種子特異性表達載體pBI-PHa ds10 轉化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，采用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉化煙草NC89品系［15］。用100 mg/L卡那霉素對轉化植株進行篩選，轉化煙草的篩選培養(yǎng)基為MS附加2.0 mg/L 6-BA、0. 3 mg/L IAA、100 mg/L卡那霉素、400 mg/L利福平、200 mg/L羧芐青霉素；誘導生根培養(yǎng)基為1/2 MS附加100 mg/L卡那霉素、400 mg/L利福平、100 mg/L羧芐青霉素。

1.2.5 轉基因煙草的分子鑒定 采用天根生化有限公司的植物總DNA提取試劑盒提取煙草葉片基因組DNA。以種子特異性表達載體pBI-PHa ds10為陽性對照，以非轉基因煙草為陰性對照，以Ha ds10 G1基因啟動子的特異性引物SL73和SL80進行PCR 擴增，擴增條件同1.2.2。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用天根生化有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取煙草種子總RNA。然后將1 μg RNA 反轉錄成cDNA。以cDNA 為模板，使用GUS基因特異性引物GUS-F：5'-GCAACTGGACAAGGCACT-3'和GUS-R：5'-GCGTCGCAGAACATTACA-3'進行PCR 反應；同時，以煙草β-actin基因為內參，引物序列為：Actin-F：5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'，Actin-R：5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'。擴增條件同上。1.2.6 GUS活性的組織染色 采用組織化學染色法［16］檢測GUS基因在轉基因煙草各組織中的表達。將待測材料的根、莖、葉和種子分別放入1.5 mL的Eppendorf中，加入GUS染色液（1 mmol/L X-gluc，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，0.1% Triton X-100），37℃保溫過夜，然后用75%乙醇脫色數(shù)小時，種子放在10倍顯微鏡下觀察，并照相記錄結果。由于煙草外面有較堅硬的種皮，會影響染色效果，因此我們在染色前先將煙草種子用刀片從中部割開，再置于GUS染液中進行染色。

2 結果

2.1 油葵Ha ds10 G1基因啟動子的克隆

以油葵“矮大頭”幼葉的基因組DNA為模板進行PCR擴增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標準進行分析（圖1），表明SL73和SL74引物擴增出1條約1.4 kb的條帶，與預期大小一致。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結果

2.2 重組克隆載體的構建

將PCR產(chǎn)物回收后與克隆載體pUC-T連接，獲得重組質粒pUC-T-Ha ds10，經(jīng)菌落PCR鑒定（圖2-A）表明，7、8單菌落能擴增出一條大小約1.4 kb的條帶，與目的片段的大小一致，而未轉化的菌株沒有擴增出該條帶。提取7、8號的質粒進行Hind Ⅲ / Xba I雙酶切鑒定，結果二者均能切出大小約1.4 kb的目的條帶（圖2-B），進一步通過測序證實了序列的正確性，說明pUC-T-Ha ds10載體構建成功。

2.3 油葵Ha ds10 G1啟動子的序列分析

對pUC-T-Ha ds10進行測序，序列分析結果（圖3）表明，該片段長度為1 417 bp，與已報道的Ha ds10 G1啟動子序列（AJ 224116）相似性為89.42%。通過PlantCARE在線軟件對Ha ds10 G1啟動子序列進行元件預測分析，發(fā)現(xiàn)Ha ds10 G1啟動子除了含有TATA box和CAAT box等保守的啟動子元件外，還存在許多與光反應、非生物脅迫相關的順式作用元件，以及胚乳和種子特異性表達所必須的調控元件Skn-1motif、參與多種植物基因種子特異性調節(jié)的RY重復元件（CATGCATG）。（1）光響應元件：I-Box（ACCCTTATCT）、G-Box（CACGTG）、ACE（AAAACGTTTA）、MRE（TTAGGTT）。（2）脅迫應答元件：低溫響應元件LTR（TTTCGG），干旱誘導相關元件MBS（TAACTG），脅迫防御元件TC-rich repeats（ATTTTCTTCA）。（3）激素應答元件：脫落酸響應元件ABRE（TTTTTTCC），赤霉素響應元件P-box，生長素響應元件TGA-element、AuxRR-core（GGTCCAT）等。（4）種子特異表達元件：胚乳表達必需的元件Skn-1 motif（GTCAT）、種子特異表達的調控元件RY-repeat element（CATGCATG）。

圖2 pUC-T-Ha ds10重組子檢測結果

2.4 pBI-PHa ds10種子特異性表達載體的構建

植物表達載體pBI121是含有CaMV 35S啟動子和GUS基因的雙元載體。為了研究Ha ds10 G1基因啟動子的功能，本研究將Ha ds10 G1啟動子替換pBI121載體上的CaMV 35S組成型啟動子，構建種子特異表達載體pBI-PHa ds10，構建策略見圖4。

利用限制性內切酶Hind Ⅲ和Xba I分別雙酶切pUC-T-Ha ds10和pBI121載體，然后將pUC-THads10小片段和pBI121大片段用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，得到1條約1.4 kb的特異性條帶（圖5），與預期片段大小一致。進一步通過測序驗證了其正確性，表明pBI-PHa ds10載體構建成功。

2.5 轉基因煙草的獲得及PCR鑒定

將種子特異性表達載體pBI-PHa ds10 通過凍融法轉化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，然后采用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草NC89，通過卡那霉素篩選獲得陽性轉化植株。然后從陽性植株幼葉中提取基因組DNA，用克隆油葵Ha ds10 G1基因啟動子的引物SL73和SL80進行PCR 檢測。結果（圖6）表明，轉基因煙草株系4號和6號（泳道4和6）擴增出大小約為1.4 kb的片段，與預計大小相符，而野生型煙草（泳道1）沒有擴增出該片段，表明油葵Ha ds10 G1基因啟動子已整合入煙草的基因組DNA中。

2.6 轉基因煙草的GUS活性檢測

為了確證所克隆啟動子的功能，取轉基因植株不同部位的組織進行GUS 檢測，以野生型煙草為對照。結果（圖7）表明，野生型煙草的種子、根、莖和葉片不能被GUS染色，轉pBI-PHads10質粒的煙草只有種子能被染成藍色，而根、莖和葉片不能被GUS染色。為了進一步驗證GUS基因在煙草中的表達，分別提取轉基因和野生型煙草種子的總RNA，進行半定量RT-PCR。結果（圖8）表明，從轉基因煙草中擴增獲得預期的目的基因片段，而野生型煙草中未擴增出該片段；同時，在轉基因和野生型煙草中均擴增出內標β-actin基因片段。由此可以確認，所克隆獲得的啟動子為種子特異性表達啟動子。

3 討論

植物的種子，尤其是油料作物和糧食作物的種子與人類的生產(chǎn)生活密切相關，因此，以種子作為生物反應器一直是人們研究的熱點和重點。種子特異性表達啟動子是基因工程研究中必不可少的有利工具。近20年來，隨著人們對種子特異啟動子的結構、功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一系列種子特異啟動子，并且已在芝麻、大豆等農(nóng)作物的品質改良中得到應用。如在芝麻種子特異性2S清蛋白（2Salb）啟動子驅動下，將大豆脂肪酸去飽和酶基因在芝麻種子中特異表達，提高了芝麻種子α-亞麻酸的含量［17］。栽培大豆球蛋白（vicillin）種子特異性啟動子驅動紫蘇γ-生育酚甲基轉移酶基因在印度大豆中表達，促進轉基因大豆種子中γ-生育酚轉化為α-生育酚，提高了種子中α-生育酚的含量［18］。

圖3 Ha ds10 G1啟動子序列分析

圖4 植物表達載體pBI121與pBI-PHa ds10的T-DNA區(qū)域示意圖

圖5 pBI-PHa ds10質粒雙酶切鑒定

圖6 轉基因煙草的PCR檢測

圖7 陽性轉基因植株營養(yǎng)器官和種子的GUS組織化學染色

圖8 轉基因煙草種子GUS基因的RT-PCR檢測

油葵是世界上重要的油料作物，同時也是具有廣闊開發(fā)前景的可再生能源植物，通過基因工程方法調控油葵的代謝路徑可以提高其產(chǎn)量、品質和抗病性［3，5，6］，而種子特異性啟動子的開發(fā)和應用將有助于實現(xiàn)這些目標。雖然人們已從油菜、大豆等植物中克隆了一些種子特異啟動子，并成功應用到油料作物品質改良工作中，但在油葵基因工程研究中使用來源于向日葵自身的種子特異啟動子，不僅可以降低同源轉基因沉默的風險，而且在某種程度上避免生物安全性帶來的問題。因此研究油葵本身的種子特異啟動子應用于油葵中具有重要意義。本研究以油葵品種“矮大頭”的基因組DNA為模板，應用PCR技術擴增了油葵LEA蛋白家族中的Ha ds10 G1基因起始密碼前1 417 bp序列，與已報道的向日葵Ha ds10 G1基因啟動子（AJ 224116）序列同源性為89.42%。進一步對Ha ds10 G1基因啟動子序列進行分析，結果表明，該序列除含有CAAT box和TATA box等真核生物啟動子基本元件外，還存在大量光反應元件，如I-Box、G-Box、ACE、MRE，說明Ha ds10 G1 基因的表達受到光的調控。同時該啟動子上也存在多個脅迫應答元件，如低溫響應元件LTR、干旱誘導相關元件MBS（也是MBY轉錄因子結合位點），脅迫防御元件TC-rich repeats 和激素應答元件（脫落酸響應元件ABRE，赤霉素響應元件P-box，生長素響應元件TGA-element、AuxRR-core等），暗示該基因的表達可能受到多種逆境脅迫和激素的調控。另外，該啟動子還含有2個胚乳特異表達必需的順式調節(jié)元件Skn-1 motif和2個RY重復序列（RY repeat）。RY重復序列廣泛存在于單子葉和雙子葉植物的種子特異性基因啟動子中，如1.7S油菜貯藏蛋白（napin）基因啟動子［19］和7S大豆貯藏蛋白（β-conglycinin）基因啟動子［20］等。RY重復序列常以多拷貝的形式存在，是核蛋白的結合位點，對種子特異性基因的高水平表達十分重要，具有種子特異性時序調控功能［21，22］。Ha ds10 G1基因啟動子中RY重復序列的存在進一步證實了該啟動子為種子特異性啟動子。

通過對啟動子功能進行驗證，用Ha ds10 G1啟動子替換pBI121中GUS上游的CAMV35S啟動子，構建重組表達載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉化煙草獲得轉基因植株，對其種子和營養(yǎng)器官進行GUS染色。結果表明，Ha ds10 G1啟動子序列能驅動GUS基因在煙草種子中特異表達。研究結果不僅為油葵基因調控的理論研究提供新資料，同時也為油葵基因工程提供更有效的啟動子和調控元件，對于將向日葵作為生物反應器并在其中表達和儲存有價值的營養(yǎng)物質具有較大的應用前景。

4 結論

油葵Ha ds10 G1啟動子上游1 417 bp片段具有種子特異性表達的特點，可用于植物種子特異表達載體的構建和進一步的遺傳轉化。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Identification of Seed-specific Promoter Ha ds10 G1 from Oil Sunflower（Helianthus annuus）

SUN Li ZHOU Xi-ping QI Zi-yun WANG Meng-yao CHEN Fu-long
（College of Life Sciences，Shihezi University，Xinjiang 832000）

The objective of this work is to clone and identify the seed-specific promoter of Ha ds10 G1 in a LEA（late embryogenesis abundant）protein gene family from oil sunflower. The upstream regulatory region of Ha ds10 G1 gene was isolated from the genomic DNA of sunflower “Aidatou” by PCR method. The cloned region was fused to the GUS reporter gene，and plant expression vector pBI121-PHa ds10 was constructed，which was introduced into Nictiana tabacum NC89 by medicating Agrobacterium tumefaciens. The expression of GUS gene in the transgenic tobacco plants was detected by PCR，RT-PCR and GUS. As results，the gene promoter of Ha ds10 G1 was 1 417 bp，and it had homology with the reported sequence at 89.42%. Cis-acting elements search in the segment revealed that in addition to kernel regulatory sequences of promoter，there was the presence of a number of motifs related to tissue specificity，hormone，and adverse environment，such as RY-repeat elements，ABRE motif and TC-rich element，etc. PCR results showed that the transgenic plants were obtained successfully. GUS activity assays indicated that this promoter drove the expression of GUS gene only in tobacco seed embryo，and not in the other tissues such as roots，stems and leaves. Conclusively，the cloned 1 417 bp upstream regulatory region of Ha ds10 G1 gene from the LEA protein gene family of oil sunflower is seed-specific promoter. The results may provide the tissue-specific promoter for genetic improvement of oilseed crops such as oil sunflower.

oil sunflower；seed-specific promoter；GUS staining；tobacco

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.011

2016-06-29

國家自然科學基金項目（31360052），兵團博士基金項目（2012BB005）

孫黎，女，博士，研究方向：植物分子生物學；E-mail：sunlishz@126.com