王夢嬌 方海田 劉慧燕 賀曉光 吳慶 趙貝貝

（寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021）

轉(zhuǎn)運蛋白NupC與NupG微生物胞內(nèi)核苷分泌的作用研究進展

王夢嬌 方海田 劉慧燕 賀曉光 吳慶 趙貝貝

（寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021）

核苷用途廣泛，微生物發(fā)酵法是其主要的生產(chǎn)方法之一。微生物細胞內(nèi)核苷的分泌對于高產(chǎn)核苷有重要的作用，其細胞膜上存在多種起運輸作用的轉(zhuǎn)運蛋白參與代謝產(chǎn)物的分泌。主要闡述核苷轉(zhuǎn)運蛋白NupC和NupG在微生物細胞內(nèi)核苷分泌過程中的作用。此外，介紹了轉(zhuǎn)運蛋白的修飾改造對于核苷生物合成的影響，旨在為構(gòu)建高產(chǎn)菌株的育種策略提供依據(jù)。

微生物；核苷轉(zhuǎn)運蛋白；NupC；NupG

核苷（Nucleosid）是一類糖苷胺（Glycosylamine）分子，組成物是核酸堿基加上核糖（Ribose）或脫氧核糖（Deoxyribose），堿基包括嘌呤（Purine）和嘧啶（Pyrimidine）兩類，根據(jù)堿基的不同又可將核苷分為嘧啶類核苷和嘌呤類核苷兩類。嘧啶類核苷主要有胸苷、尿苷和胞苷，嘌呤類核苷主要有腺苷和鳥苷。近幾十年來，核苷生物合成代謝調(diào)控機制的研究逐漸受到關注，國外學者在核苷產(chǎn)生菌遺傳改造方面開展了一些研究。核苷的分泌是一個非常復雜的代謝過程，是高產(chǎn)菌株特有的遺傳與生化機制和培養(yǎng)條件共同起作用的結(jié)果，受到多個因素的調(diào)控，包括細胞分泌系統(tǒng)的調(diào)控、細胞膜的通透性、代謝網(wǎng)絡的自身調(diào)節(jié)、代謝分流的限制、膜蛋白的調(diào)節(jié)及環(huán)境因子的動態(tài)調(diào)節(jié)等［1，2］。近年來，微生物通過跨膜轉(zhuǎn)運分泌代謝物質(zhì)受到愈來愈多的關注，成為一個重要的研究領域。微生物細胞膜是一類超分子體系，由蛋白質(zhì)、糖類及脂類等組成，與細胞的能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運送、信號的感受與傳導等基本生命活動都密切相關，能夠控制物質(zhì)出入細胞進行物質(zhì)和信息交換［1］。細胞對溶質(zhì)的選擇性吸收和排放主要是通過細胞膜上以膜轉(zhuǎn)運蛋白為基礎的運輸系統(tǒng)實現(xiàn)的［2］。由于核苷是親水性的分子，不能直接通過擴散跨越生物膜，主要是通過一些跨膜轉(zhuǎn)運載體來實現(xiàn)細胞膜的跨越，其中，核苷轉(zhuǎn)運蛋白通過介導核苷的轉(zhuǎn)運，具有分泌代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)生命以及分泌其他生物大分子等的功能［3，4］。

本文主要闡述核苷轉(zhuǎn)運蛋白NupC和NupG在微生物細胞內(nèi)核苷分泌過程中的作用。旨在為提出構(gòu)建胞苷高產(chǎn)菌株的育種策略，大規(guī)模、單一地發(fā)酵生產(chǎn)核苷，降低其生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵生產(chǎn)效率提供參考。

1 核苷轉(zhuǎn)運蛋白的分類和結(jié)構(gòu)

由于核苷是親水性的分子，它們被動擴散跨越生物膜的能力是有限的，不能自由通過細胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，需要專門的核苷轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)助核苷來完成細胞膜的跨越［5，6］。細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白能夠控制細胞內(nèi)、外物質(zhì)交流，對細胞的基本生命活動起到關鍵作用。轉(zhuǎn)運蛋白一般具有多次跨膜的拓撲結(jié)構(gòu)，能夠特異性識別轉(zhuǎn)運底物，利用能量驅(qū)動逆濃度梯度主動轉(zhuǎn)運。根據(jù)跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機制在轉(zhuǎn)運過程對底物特異性識別及轉(zhuǎn)運蛋白間的同源性，Paulsen等［7］對細胞跨膜轉(zhuǎn)運蛋白進行了系統(tǒng)分類，歸結(jié)為兩類核苷轉(zhuǎn)運蛋白：一種為擴散型核苷轉(zhuǎn)運蛋白（Equilibrative nucleoside transporter，ENT），另一種是富集型核苷轉(zhuǎn)運蛋白（Concentrative nucleoside transporter，CNT）。擴散型核苷轉(zhuǎn)運蛋白又稱為依賴于濃度梯度的核苷轉(zhuǎn)運蛋白，它只能利用濃度梯度將核苷從高濃度一側(cè)轉(zhuǎn)運到低濃度一側(cè)。富集型核苷轉(zhuǎn)運蛋白又稱為不依賴于濃度梯度的核苷轉(zhuǎn)運蛋白，它既能將核苷從高濃度的一側(cè)轉(zhuǎn)運到低濃度的一側(cè)，又能利用 Na+協(xié)同轉(zhuǎn)運提供的動力逆濃度梯度將核苷從低濃度的一側(cè)向高濃度的一側(cè)轉(zhuǎn)運。

對大腸桿菌中2種核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白NupG和NupC的拓撲學結(jié)構(gòu)進行了預測研究［8］。雖然這2種蛋白質(zhì)都是核苷轉(zhuǎn)運蛋白，其功能比較相似，但在細胞內(nèi)的分布及拓撲學結(jié)構(gòu)明顯不同。其研究發(fā)現(xiàn)，NupG有12個跨膜螺旋，N端和C端位于胞內(nèi)一側(cè)，而NupC只有10個跨膜螺旋，N端和C端位于細胞外側(cè)。NupG和NupC除了其拓撲學結(jié)構(gòu)的不同，兩種蛋白空間上的折疊方式也有明顯的不同［9］。NupG N端的6個螺旋和C端的6個螺旋以同向平行假對稱的方式排列，對稱軸垂直于膜平面，N端和C端的兩個對稱部分在細胞內(nèi)一側(cè)距離很近，所以是以向外開口的構(gòu)象存在（圖1）。而NupC是以不對稱方式排列，并以向內(nèi)開口的構(gòu)象存在（圖2）。

圖1 NupG結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 NupC結(jié)構(gòu)示意圖

2 核苷分泌機理的理論分析

Villas-Boas等［10］的研究認為細胞的生長、細胞膜上受體蛋白的嵌入、細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換以及再循環(huán)等細胞生理功能的實現(xiàn)都與細胞分泌活動有關，都涉及膜轉(zhuǎn)運蛋白及其分子機制。張星元［11］、Baranyi等［12］提出了微生物的細胞經(jīng)濟學原理（節(jié)約原理、適應原理、生命保障原理），細胞中存在經(jīng)濟性自我響應機制。由此可知，若生產(chǎn)菌株細胞內(nèi)核苷濃度超過其閾值，必將受到細胞內(nèi)相關代謝調(diào)節(jié)機制的干預，胞內(nèi)核苷的濃度過高，就會對合成核苷的代謝過程施加負反饋調(diào)節(jié)，促進核苷向胞外空間分泌，迫使其回到正常濃度。因此，無論從化學平衡的角度還是從生物學信息反饋的角度，及時將核苷轉(zhuǎn)移到細胞外，都將有利于載流路徑上代謝主流的流動。Chokkathukalam等［13］的研究也表明，細胞能夠感受環(huán)境的變化，產(chǎn)生應激反應，在面對內(nèi)外界一些環(huán)境因素變化時也會做出相應的代謝變化，要不斷地通過細胞內(nèi)的代謝調(diào)控途徑來調(diào)節(jié)代謝水平以達到一種穩(wěn)態(tài)，若這些應激反應失調(diào)，就會使細胞代謝發(fā)生異變，并排出代謝產(chǎn)物，這可能是導致核苷向胞外分泌的因素之一。

目前對代謝產(chǎn)物分泌機制的報道多見于對氨基酸特別是谷氨酸的研究，對于如何誘導谷氨酸分泌的認識是最清楚的，但是對胞苷分泌過程調(diào)控機制方面的研究未見報道。分析谷氨酸棒桿菌谷氨酸分泌的研究成果，對于胞苷分泌機制的研究有重要的借鑒意義。張星元等［14］提出3種氨基酸分泌機制的模型：溢流代謝模型、受限的分解代謝模型和去調(diào)節(jié)的合成代謝模型；姚輝等［15］也提出3種谷氨酸分泌的假定模式：“泄漏”模式、“載體功能逆轉(zhuǎn)”模式及“特殊載體系統(tǒng)”模式，這3種假定模式是從細胞膜的組成、載體蛋白等方面研究谷氨酸的分泌，而且在細胞壁上存在的孔蛋白能允許親水溶質(zhì)透過細胞壁；Eggeling等［16］提出了解釋谷氨酸分泌機理的滲漏模型和代謝流改變模型；也有人采用局部麻醉和對細胞殼層施加滲透壓的方法來調(diào)節(jié)膜狀態(tài)，認為膜應力可能激活谷氨酸的分泌［17］。但是，在每一種模式的輸送系統(tǒng)中，并不僅存在一種模型，幾種模型往往同時存在。這些研究結(jié)果在研究微生物的核苷分泌機制中具有重要參考價值，依據(jù)氨基酸及谷氨酸的分泌機理推測，在微生物中核苷的分泌過程可能也有類似的模式及分泌機制。

3 轉(zhuǎn)運蛋白NupC對核苷分泌的作用

NupC屬于易化擴散性核苷轉(zhuǎn)運蛋白（ENT），通過介導核苷由胞內(nèi)向胞外分泌，該轉(zhuǎn)運蛋白是根據(jù)電化學勢梯度驅(qū)動的單向跨膜轉(zhuǎn)運，將核苷由高濃度一側(cè)轉(zhuǎn)運到低濃度一側(cè)［18］。同時，NupC能夠在向外開口的狀態(tài)和向內(nèi)開口的狀態(tài)間發(fā)生異構(gòu)變化，引發(fā)核苷的結(jié)合位點交替開口向細胞膜的兩側(cè)，從而將核苷分泌到細胞外。而NupC的C端和N端均位于大腸桿菌的細胞外側(cè)，組氨酸含正電荷側(cè)鏈，引入多聚組氨酸親和標簽會影響NupC的表達。NupC轉(zhuǎn)運蛋白對核苷的分泌機制可能與核苷內(nèi)分子的磷酸化、去磷酸化有關。Zhu等［19］由非特異性5-磷酸酶催化，抑制其轉(zhuǎn)運核苷的內(nèi)在活性，細胞內(nèi)的CMP和UMP可以去磷酸化形成胞嘧啶和尿嘧啶。胞嘧啶核苷脫氨酶（cdd基因編碼）作用于胞嘧啶核苷可以進一步脫去氨基形成尿苷［20］。在dra-nupC-pdp操縱子中，pdp基因編碼嘧啶核苷磷酸化酶催化降解的尿苷形成尿嘧啶并分泌到細胞外［21］。最初研究大腸桿菌，證明NupC可作為核苷轉(zhuǎn)運蛋白，利用H+協(xié)同轉(zhuǎn)運提供動力轉(zhuǎn)運腺苷和胞嘧啶核苷［22］。類似大腸桿菌的還有金黃色葡萄球菌、幽門螺旋桿菌、枯草芽孢桿菌等，以NupC作為能量來源或核苷酸從頭合成的核苷轉(zhuǎn)運蛋白［23］。

4 轉(zhuǎn)運蛋白NupG對核苷分泌的作用

NupG屬于主動擴散載體超家族（major facilitator superfamily，MFS）。Munch-Petersen等［24］研究發(fā)現(xiàn)，通過NupG染色體突變證明已被克隆在質(zhì)粒載體的DNA片段能夠誘導合成NupG核苷轉(zhuǎn)運蛋白。轉(zhuǎn)運蛋白NupG需要有相應的結(jié)合位點與之結(jié)合才能對核苷的分泌起到作用。有研究表明，核苷轉(zhuǎn)運蛋白NupG與所需的羥基基團結(jié)合，必須存在C-3'和C-5'核糖位置。更重要的是用于結(jié)合核糖部分NupG核苷轉(zhuǎn)運蛋白和低聚糖之間的進化關系是一致的［25］?？梢杂?0世紀60年代提出的交替開放模型（alternating access model）［26］來解釋其對核苷分泌的機制。轉(zhuǎn)運蛋白NupG首先在膜的一側(cè)暴露其與底物的結(jié)合位點，底物分子在與蛋白結(jié)合的同時可以誘導蛋白的構(gòu)象發(fā)生較大變化，使蛋白的開口由向胞外開放變成向細胞另外一側(cè)開放，進一步引起對核苷物質(zhì)的分泌，從而完成整個轉(zhuǎn)運的過程［27］；當?shù)孜锝Y(jié)合時可以引起鹽橋弱化，使底物結(jié)合產(chǎn)生的能量驅(qū)動蛋白的構(gòu)象變化［28］。

5 轉(zhuǎn)運蛋白的修飾改造對于核苷合成的影響

通過改造核苷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的代謝工程對于核苷類物質(zhì)的合成具有重要作用，可以通過過表達編碼核苷轉(zhuǎn)運蛋白NupC和NupG來提高轉(zhuǎn)運效率。NupG作為大腸桿菌核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白，屬于主動擴散載體超家族，其N端位置位于胞質(zhì)一側(cè)，在構(gòu)建重組 NupG時，不需要考慮引入和包含信號序列［29］，類似的蛋白質(zhì)還有 LacY和GlpF［30，31］。NupG轉(zhuǎn)運蛋白其C端位于胞質(zhì)一側(cè)，可以在該位置引入多聚組氨酸親和標簽，符合正電荷氨基酸向內(nèi)原則，重組構(gòu)建NupG其表達不受影響［29］。

對于生產(chǎn)菌株來說，趙偉睿等［32］認為控制細胞膜通透性的方法有控制磷脂的合成、控制細胞壁的合成等。在微生物中，通過改變細胞膜滲透性對代謝控制具有非常重要的作用［33］。微生物自身存在著許多種負責物質(zhì)跨膜運輸?shù)奶禺惡头翘禺愞D(zhuǎn)運蛋白，因此加強這些通道蛋白的表達就有可能降低細胞對底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力。這對于解決發(fā)酵過程中由于產(chǎn)物不能及時排出而造成的產(chǎn)物抑制效應是一個極其有效的方法。因此，可通過基因敲除和過量表達實驗，驗證這些基因在核苷生產(chǎn)菌株中的功能，將為核苷生產(chǎn)菌的設計與核苷分泌機制的研究提供更有價值的理論依據(jù)。

6 可能存在的其他核苷分泌機制

在微生物細胞內(nèi)核苷分泌過程中，除了轉(zhuǎn)運蛋白NupC和NupG之外，還有一些轉(zhuǎn)運蛋白也起到了重要的作用。大多數(shù)已知功能的NAT 家族的蛋白都與核酸（包括嘌呤和嘧啶）特異性的轉(zhuǎn)運有關。根據(jù)序列比較，有研究對NAT家族提出利用質(zhì)子或鈉離子共轉(zhuǎn)運底物的分子機理。自2007年開始顏寧教授等對NAT家族蛋白進行研究，首先利用現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學的方法對這一家族代表性成員大腸桿菌尿嘧啶-質(zhì)子共轉(zhuǎn)運蛋白（Uracil：proton Symporter）UraA進行研究，終于在2010年4月首次獲得了UraA與底物尿嘧啶高分辨率三維精細結(jié)構(gòu)，其分辨率高達2.8?，研究表明，蛋白底物尿嘧啶在跨膜轉(zhuǎn)運的過程中首先被準確地定位在兩個結(jié)構(gòu)域之間，進而通過門控結(jié)構(gòu)域和核心結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)像變化完成整個轉(zhuǎn)運過程，其中胞嘧啶（cytosine）分子的運輸也是通過協(xié)同運輸?shù)牡鞍證odB完成的［31］，經(jīng)過脫氨基作用，又進一步被尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（UPRTase）修飾，從而被細胞利用。UraA不但對尿嘧啶轉(zhuǎn)運功能，對尿嘧啶的衍生物5-氟尿嘧啶也能夠特異性轉(zhuǎn)運。這為解釋5-氟尿嘧啶作為抗癌的化療藥物如何進入細胞提供了良好的分子機理［34］。另外，還存在一些膜轉(zhuǎn)運蛋白，如在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白LacY以及大腸桿菌甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運蛋白GlpT，大腸桿菌蛋白 NhaA在對Na+、H+反向轉(zhuǎn)運的機制研究也有類似的結(jié)果。Mohanty等［35］通過對位于胞質(zhì)側(cè)的腸桿菌水通道N端和C端的研究表明，雖然其N端或C端分別含有6-10個組氨酸的重組AqpZ 蛋白，但不會受多聚組氨酸的長度和位置對表達產(chǎn)生影響。Sheremet等［36］在對解淀粉芽胞桿菌AJ1991中研究發(fā)現(xiàn)，途徑末端代謝物存在強烈的酶水平反饋抑制作用，過表達編碼核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白的pbuE基因，肌苷產(chǎn)量較AJ1991提高100%，達到6 g/L，而過表達來自大腸桿菌的編碼核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白的nepl基因，肌苷產(chǎn)量可以提高190%。

7 結(jié)語

隨著膜蛋白和代謝組學等研究技術的日益發(fā)展，核苷代謝調(diào)控機制受到了廣泛的關注，核苷轉(zhuǎn)運蛋白通過介導核苷跨膜轉(zhuǎn)運起到了關鍵作用，而不同的核苷轉(zhuǎn)運蛋白有各自的底物轉(zhuǎn)運特點和選擇性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多已知功能轉(zhuǎn)運蛋白家族都與核酸（包括嘌呤和嘧啶）特異性的轉(zhuǎn)運有關，但是關于轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機理仍知之甚少，如底物識別與結(jié)合機制、水解機制、跨膜方式等。本文結(jié)合核苷分泌機理的理論研究，對核苷轉(zhuǎn)運蛋白NupC和NupG結(jié)構(gòu)及分泌機制進行分析，闡述了它們對核苷分泌的作用，提出了通過修飾改造NupC和NupG來提高轉(zhuǎn)運效率的策略，為大規(guī)模、單一地發(fā)酵生產(chǎn)核苷，降低其生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵生產(chǎn)效率提供參考。由于轉(zhuǎn)運蛋白的研究越來越深入，這些轉(zhuǎn)運蛋白的功能將需要利用更多先進的實驗技術手段并可能利用分子動力學模擬（molecular dynamics simulation）等方法對核苷轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機理從分子水平上得以全面詮釋。

［1］劉永康, 陳國民. 細胞膜對大分子物質(zhì)及顆粒物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運［J］. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2006（5）：674-675.

［2］馬蓉, 張立軍, 丁銳, 等. 大腸桿菌氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究進展［J］. 科技通報, 2012, 3：49-56, 99.

［3］ 王晶敏. 核苷轉(zhuǎn)運蛋白在細胞水平跨膜轉(zhuǎn)運作用的研究進展［J］. 國外醫(yī)學·藥學分冊, 2003, 1：17-22.

［4］ 李劍, 李光永, 王道文. 核苷轉(zhuǎn)運蛋白的研究進展［J］. 科學通報, 2002, 7：481-484.

［5］ Martinussen J, Willemo?s M, Kilstrup M. Nucleotide metabolism［M］. Second Edition. Comprehensive Biotechnology, 2011：91-107.

［6］Charles L. Turnbough Jr, Robert L, et al. Regulation of pyrimidine biosynthetic gene expression in bacteria：repress ion without repressors［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2008, 72（2）：266-300.

［7］Paulsen IT, Sliwinski MK, Saier MH. Microbial genome analyses：Global comparisons of transport capabilities based on phylogenies, bioenergetics and substrate specificities［J］. J Mol Biol, 1998, 277：573-592.

［8］http//bioweb. pasteur. fr/seqanal/interfaces/toppred. html

［9］Madej T, Lanczycki CJ, Zhang D, et al. MMDB and VAST+：tracking structural similarities between macromolecular complexes［J］. Nucleic Acids Res, 2014, 42（Database issue）：D297-303.

［10］Villas-Boas S, Han TL, Liu T, et al. What is the relationship between intracellular and extracellular metabolites? The theory of“metabolic overflow” put into test［J］. New Biotechnology, 2014, 31：S28-S29.

［11］張星元. 發(fā)酵原理［M］. 北京：科學出版社, 2011.

［12］Baranyi J, Metris A, George SM. Bacterial economics：Adaptation to stress conditions via stage-wise changes in the response mechanism［J］. Food Microbiology, 2015, 45：162-166.

［13］Chokkathukalam A, Kim DH, Barrett MP, et al. Stable isotopelabeling studies in metabolomics：new insights into structure and dynamics of metabolic networks［J］. Bioanalysis, 2014, 6（4）：511-524.

［14］張星元, 李秀敏, 楊毅, 等. 谷氨酸棒桿菌的氨基酸輸送系統(tǒng)的存在、功能及其在氨基酸生產(chǎn)上的重要性［J］. 無錫輕工大學學報, 2004, 23（3）：105-110.

［15］姚輝, 張建華, 毛忠貴. 谷氨酸棒狀桿菌的谷氨酸分泌模式初探［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39（5）：54-58.

［16］Eggeling L, Krumbach K, Shahm H. L-Glutamate efflux with Corynebacterium glutamicum：why is penicillin treatment or Tween addition doing the same［J］. J Mol Microbiol Biotechnol, 2001, 3（1）：67-68.

［17］Puech V, Chami M, Lemassu A, et al. Structure of the cell envelope of corynebacteria：importance of the non-covalently bound lipids in the formation of the cell wall permeability barrier and fracture plane［J］. Microbioloy, 2001, 147：1365-1382.

［18］Ramadan A, Naydenova Z, Stevanovic K, et al. The adenosine transport ENT1 in cardiomyocytes is sensitive to inhibition by ethanol in akinase-dependent manner：implications for ethanol-dependent cardioprotection and nucleoside analog drug cytotoxicity［J］. Purinergic Signalling, 2014, 10（2）：305-312.

［19］Zhu H, Yang SM, Yuan ZM, et al. Metabolic and genetic factors affecting the productivity of pyrimidine nucleoside in Bacillus subtilis［J］. Microbial Cell Factories, 2015, 14：54.

［20］Song BH, Jan N. Chromosomal location, cloning and nucleotide sequence of the Bacillus subtilis cdd gene encoding cytidine/ deoxycytidine deaminase［J］. Mol Gen Genet, 1989；216：462-468.

［21］Saxild HH, Andersen LN, Hammer K. Dra-nupC-pdp operon of Bacillus subtilis：nucleotide sequence, induction by deoxyribonucleosides, and transcriptional regulation by the deoR-encoded DeoR repressor protein［J］. J Bacteriol, 1996, 178：424-434.

［22］Henderson PJ, Herbert RB. The nucleoside transport proteins, NupC and NupG, from Escherichia coli：specific structural motifs necessary for the binding of ligands［J］. Org Biomol Chem, 2005, 3：462-470.

［23］Karatza P, Frillingos S. Cloning and functional characterization of two bacterial members of the NAT/NCS2 family in Escherichia coli［J］. Mol Membr Biol, 2005, 22（3）：251-261.

［24］Munch-Petersen A, Jensen N, et al. Cloning and expression of genes encoding the nupG nucleoside transport system in Escherichia coli［J］. The Cell Membran, 1984, 411（2）：85-99.

［25］Zhu H, Yang SM, Yuana ZM, et al. Metabolic and genetic factors affecting the productivity of pyrimidine nucleoside in Bacillus subtilis［J］. Microbial Cell Factories, 2015, 14（54）：2-12 .

［26］Jardetzky O. Simple allosteric model for membrane pumps［J］. Nature, 1966, 211：969-970.

［27］Mitchell P. A general theory of membrane transport from studies of bacteria［J］. Nature, 1957, 180（4577）：134-136.

［28］Smirnova I, Kasho V, Choe JY, et al. Sugar binding induces an outward facing conformation of LacY［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104：16504-16509.

［29］Monné M, Chan KW, Slotboom DJ, et al . Functional expression of eukaryotic membrane proteins in Lactococcus lactis［J］. Protein Sci, 2005, 14（12）：3048-3056.

［30］Abramson J, Smirnova I, Kasho V, et al . Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli［J］. Science, 2003, 301（5633）：610-615.

［31］Huang Y, Lemieux MJ, Song JM. Structure and mechanism of theglycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli［J］. Science, 2003, 301（5633）：616-620.

［32］趙偉睿, 胡升, 黃俊, 等. 微生物細胞通透性改善方法與策略［J］. 中國生物工程雜志, 2014, 34（3）：125-131.

［33］Yamada S, Awano N, Inubushi K, et al. Effect of drug transporter genes on cysteine export and overproduction in Escherichia coli［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72（7）：4735-4742.

［34］Kuhn JG. Fluorouracil and the new oral fluorinated pyrimidines［J］. Ann Pharmacother, 2001, 35（2）：217-227.

［35］Mohanty AK, Wiener MC. Membrane protein expression andproduction：effects of polyhistidine tag length and position［J］. Protein Expr Purif, 2004, 33（2）：311-325.

［36］Sheremet AS, Gronskiy SV, Akhmadyshin RA, et al. Enhancement of extrancellular purine nucleoside accumulation by Bacillus strains through genetic modifications of genes involved in nucleoside export［J］. Jlnd Microbiol Biotechnol, 2011, 38（1）：65-70.

（責任編輯 狄艷紅）

Research Progresses on the Role of Transport Proteins NupC and NupG During the Nucleoside Secretion Processing in Microbial Cells

WANG Meng-jiao FANG Hai-tian LIU Hui-yan HE Xiao-guang WU Qing ZHAO Bei-bei
（School of Agriculture，Ningxing University，Yingchuan 750021）

The nucleosides are used extensively，and microbial fermentation is one of main methods of producing it. The secretion of nucleoside in microbial cells plays a critical role for high-yield nucleoside. There are many transport proteins as the role of transportation in the cell membrane，which are involved in the secretion of metabolites. Here，this article mainly elaborates the role of nucleoside transport proteins such as NupG and NupC during the nucleoside secretion process in microbial cells. Additionally，the effects of modification for transport protein on nucleoside biosynthesis were introduced，aiming at providing evidence for the breeding strategy of engineering high-yield strains.

microbes；nucleoside transporter；NupC；NupG

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.004

2016-05-08

國家自然科學基金項目（3130542，31560445）

王夢嬌，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵與代謝工程；E-mail：1563437986@qq.com

方海田，男，博士，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵與代謝工程；E-mail：fanght@nxu.edu.cn