耿月華， 楊立民， 盧曉梅， 劉美蓮， 孟加榕*

(1解放軍175醫(yī)院，廈門大學附屬東南醫(yī)院病理科，漳州 363000；2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院； *通訊作者，E-mail:mengjiarong@sina.com)

AKAP12基因啟動子甲基化在哈薩克族食管鱗癌中研究

耿月華1， 楊立民1， 盧曉梅2， 劉美蓮1， 孟加榕1*

(1解放軍175醫(yī)院，廈門大學附屬東南醫(yī)院病理科，漳州 363000；2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院；*通訊作者，E-mail:mengjiarong@sina.com)

目的 研究A激酶錨定蛋白12(A kinase anchoring protein 12,AKAP12)基因在哈薩克族食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中，是否發(fā)生高度甲基化及其與臨床病理參數(shù)間的關系。 方法 應用甲基化特異性PCR(MSP)檢測用5-aza-CdR處理及正常培養(yǎng)的食管鱗癌細胞系Eca109和18對哈薩克族食管鱗癌組織中AKAP12的甲基化狀態(tài)。通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測食管鱗癌細胞系Eca109和18對哈薩克族食管鱗癌組織中AKAP12的表達量。 結(jié)果 AKAP12在Eca109細胞系，5-aza-CdR處理組及正常培養(yǎng)組中甲基化率為0；在18對哈薩克族食管鱗癌組織中甲基化率為5.6%(1/18)。AKAP12在5-aza-CdR組表達量與對照組以β-actin為內(nèi)參相差0.99倍(P=0.96)，以GAPDH為內(nèi)參相差1.93倍(P=0.47)；在18對哈族食管鱗癌組織中，癌組織與癌旁組織表達量以β-actin為內(nèi)參相差0.86倍(P=0.74)，以GAPDH為內(nèi)參相差2.87倍(P=0.11)。AKAP12表達量及甲基化率與性別、大體類型、分化程度及有無轉(zhuǎn)移無相關性(P>0.05)。 結(jié)論 AKAP12在食管鱗癌中甲基化發(fā)生率低，與病理參數(shù)之間無相關性。

食管鱗癌； DNA甲基化； AKAP12

在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中,食管癌(esophagel cancer,EC)的發(fā)病率和致死率分別位于第8位和第6位[1]，且其早期癥狀不明顯，臨床診治大部分都處于中晚期，預后極差，5年生存率不足10%[2]。我國是食管癌的高發(fā)國家，占全球食管癌發(fā)病率的50%以上[3],亦是食管癌死亡率最高的國家，其死亡率僅次于胃癌居第二位[4]。食管癌的組織類型主要有兩種：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocacinoma,EAC)，我國以ESCC為主。在我國食管癌中，新疆哈薩克族發(fā)病率較高，遠高于全國平均水平[5]。

DNA 高度甲基化主要發(fā)生在基因啟動子區(qū)域CpG小島，導致基因轉(zhuǎn)錄失活或基因沉默(gene silencing)，在基因表達調(diào)控、細胞增殖、分化及發(fā)育等方面起著重要的作用，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切?；騿幼痈叨燃谆桓淖兊鞍踪|(zhì)編碼序列，但可以使基因轉(zhuǎn)錄表達失活，產(chǎn)生一系列基因的沉默，導致基因表達調(diào)控網(wǎng)絡紊亂[6,7]。近年來，研究結(jié)果表明若干抑癌基因啟動子CpG島區(qū)域高度甲基化，與消化道腫瘤的形成密切相關。如通過對抑癌基因DNA甲基化研究，可能成為食管癌進行早期診斷、預防及治療、預后的重要工具[8]。

A激酶錨定蛋白12(A kinase anchoring protein 12,AKAP12；或被認為酪氨酸抑制的蛋白激酶C底物(SSeCK)及Gravin)是多價錨定蛋白，最初是在重癥肌無力患者血清中發(fā)現(xiàn)[9,10]。AKAP12定位于6q24-25.2，這個區(qū)域在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)生基因的缺失[11,12]。最近研究報道，在胃癌、結(jié)腸癌中AKAP12啟動子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化，同時顯示在結(jié)直腸癌和胃癌細胞系，通過去甲基化試劑5雜氮2’脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-CdR)，可以逆轉(zhuǎn)AKAP12啟動子區(qū)甲基化，恢復表達[13,14]。本課題組成員前期實驗用5-aza-CdR處理人食管鱗癌細胞系Eca109，發(fā)現(xiàn)其增殖速率降低，且呈現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)改變[15]。為了研究在哈薩克族食管鱗癌中AKAP12基因是否甲基化，本實驗通過采用MSP及RT-PCR檢測在食管鱗癌細胞系Eca109及哈薩克族食管鱗癌中AKAP12基因甲基化狀態(tài)及表達量，并探討AKAP12甲基化，5-aza-CdR處理組和正常培養(yǎng)組表達差異與哈薩克族食管鱗癌病理參數(shù)的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 人食管鱗癌細胞株Eca109由中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫提供。18對組織樣本取自2008-12～2011-07新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科行手術治療的哈薩克族食管鱗癌患者。所有患者在手術前均未經(jīng)過任何的放療和化療，且所有樣本均經(jīng)HE染色病理確診為鱗癌，每例標本取腫瘤組織及其遠端5 cm的正常食管組織，其中18對新鮮組織(離體后30 min內(nèi)置于液氮保存)。所有患者均獲得知情同意書，并且項目通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.1.2 引物與試劑 RT-PCR、MSP引物由大連寶生物公司合成。小牛血清購自Gibico公司；DMEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；5-aza-CdR購自美國Sigma公司； CpGenomeTMDNA Modification Kit(S7820)試劑盒購自chemicon 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、r-taq酶及SYBR Premix購自大連寶生物公司。

1.2 方法

甲基化特異性PCR(MSP)檢測用5-aza-CdR處理的及正常培養(yǎng)的Eca109和18對哈薩克族ESCC組織中AKAP12的甲基化狀態(tài)。通過RT-PCR檢測Eca109和18對哈薩克族ESCC組織中AKAP12的表達量。

1.2.1 細胞培養(yǎng)及抑制劑處理 Eca109細胞用含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。按照1×105濃度接種在培養(yǎng)，瓶，培養(yǎng)24 h。在對數(shù)生長期的Eca109中加入10-4mol/L濃度的5-aza-CdR處理96 h，以不加抑制劑為陰性對照組，同步培養(yǎng)，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RNA提取 按1×106細胞，Trizol法提取總RNA并經(jīng)檢測符合RT-PCR要求；100 mg組織Trizol法提取組織總RNA符合RT-PCR要求。

1.2.3 DNA提取 按動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒說明書，提取哈族食管鱗癌及癌旁正常組織總DNA，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 AKAP12表達檢測 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行RT-PCR反應，每個樣本設2個復孔。AKAP12反應參數(shù)為95 ℃預變性3 min、95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s，熒光檢測，反應35個循環(huán)；內(nèi)參β-actin、GAPDH反應參數(shù)為95 ℃預變性10 min、95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s，熒光檢測，反應35個循環(huán)。繪制溶解曲線，記錄每個反應管中的熒光信號值，利用每組與內(nèi)參SQ Mean比值，計算食管鱗癌細胞系、食管鱗癌組織中AKAP12表達量。

1.2.5 AKAP12甲基化檢測(MSP檢測) 取1 μg DNA加入3 mol/L NaOH進行解鏈，之后用CpGenomeTMDNA Modification Kit(S7820)試劑盒進行修飾，修飾后DNA在甲基化特異性PCR反應中用甲基化引物序列(5′-TTCGTTTTTGGGCGAGTTGAAAGTCG-3′和5′-CAAAAACGCTACGACGCGCC-3′)和非甲基化引物(5′-TGGATTTGTTTTTGGGTGAGTTGAAAGTT-3′和5′-AACCAAAAACACTACAACACACC-3′)分別擴增AKAP12基因啟動子區(qū)5′CpG島甲基化和非甲基化的等位基因，擴增產(chǎn)物長度分別為238 bp和245 bp。反應參數(shù)為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。擴增行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件包處理，采用配對t檢驗。Fisher’s確切概率法用來評價基因甲基化與病理參數(shù)的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察，食管鱗癌細胞系Eca109在DMEM培養(yǎng)96 h，細胞成貼壁生長，呈多角形，不規(guī)則生長，輪廓清晰，細胞間結(jié)構(gòu)緊密，細胞生長旺盛(見圖1A)；在10-4mol/L 5-aza-CdR中培養(yǎng)96 h，細胞密度降低，細胞間接觸變松，細胞體積增大，細胞內(nèi)可見大量空泡，呈凋亡形態(tài)，存活數(shù)減少(見圖1B)。

A.對照組培養(yǎng)96 h;B.10-4 mol/L 5-aza-CdR干預組培養(yǎng)96 h可見處理組細胞明顯減少，且處于凋亡狀態(tài)，細胞內(nèi)可見大量空泡圖1 Eca109細胞形態(tài)(倒置顯微鏡，10×10)Figure 1 Eca109 cell morphology under inverted microscope (10×10)

2.2 RT-PCR檢測AKAP12 mRNA表達

在食管鱗癌Eca109細胞中，5-aza-CdR處理組與正常培養(yǎng)組的AKAP12表達量，以β-actin為內(nèi)參相差0.99倍，P=0.96，以GAPDH為內(nèi)參相差1.93倍，P=0.47；在18對哈族食管鱗癌組織中，癌組織與癌旁組織表達量以β-actin為內(nèi)參相差0.86倍，P=0.74，以GAPDH為內(nèi)參相差2.87倍，P=0.11(見圖2-5)。

+,5-aza-CdR處理組； -,未處理組；1，2，3為重復次數(shù) 圖2 RT-PCR分析AKAP12在Eca109細胞表達，以GAPDH、β-actin作為內(nèi)參Figure 2 AKAP12 expression in Eca109 by qRT-PCR with GAPDH and β-actin as the internal reference

2.3 甲基化特異性PCR(MSP)檢測

AKAP12基因啟動子區(qū)甲基化結(jié)果：經(jīng)MSP檢測，在Eca109細胞中，重復3次的結(jié)果中甲基化率為0；在18對哈薩克族食管鱗癌患者的癌組織和癌旁正常組織中，甲基化陽性率為5.6%(1/18)(見圖6，7)。

T.癌組織； N.癌旁組織圖3 RT-PCR分析AKAP12在哈薩克族食管鱗癌及癌旁表達(GAPDH、β-actin作為內(nèi)參)Figure 3 TFPI2 expression in Kazak ESCC tissues by qRT-PCR with GAPDH and β-actin as the internal reference

圖4 對照組與處理組AKAP12表達差異(GAPDH、β-actin為內(nèi)參)Figure 4 The diffierence of AKAP12 expression in 5-aza-CdR-treated group and control group with GAPDH and β-actin as internal reference

圖5 18對哈薩克族食管鱗癌組織中AKAP12表達差異(GAPDH、β-actin為內(nèi)參)Figure 5 TFPI2 expression in 18 paired Kazak ESCC tissues with GAPDH and β-actin as internal reference

+,5-aza-CdR處理組； -,未處理組; M.238 bp,甲基化引物擴增結(jié)果；U.235 bp,非甲基化引物擴增結(jié)果圖6 AKAP12基因在Eca109細胞重復3次的甲基化MSP分析結(jié)果Figure 6 The methylation of AKAP12 in Eca109 by MSP

-為陰控；T.癌組織；N.癌旁組織；M.238 bp，甲基化引物擴增結(jié)果；U.235 bp,為非甲引物擴增結(jié)果圖7 AKAP12基因在18對哈薩克族食管鱗癌組織MSP分析結(jié)果Figure 7 The methylation of AKAP12 in 18 pairs of Kazak ESCC tissues by MSP

2.4 18對哈薩克族食管鱗癌組織甲基化率與病理參數(shù)之間的關系

通過Fisher’s確切概率法分析18對癌組織表達量及甲基化率與其病理參數(shù)之間的關系分析，發(fā)現(xiàn)AKAP12基因甲基化與性別、大體分型、分化程度、轉(zhuǎn)移之間無相關性(P>0.05，見表1,2)。

3 討論

5-aza-CdR是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的抑制劑，在DNA復制過程中與DNA分子相結(jié)合，并與DNMT1形成共價復合物，抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，生成低甲基化子鏈，從而實現(xiàn)去甲基化功能[16]。很多體外研究證實，5-aza-CdR通過去甲基化作用使多種CpG島過度甲基化的抑癌基因重新表達，而恢復抑癌功能[17]。還有證據(jù)可以誘導腫瘤細胞凋亡[18]。本課題組成員前期實驗用5-aza-CdR處理人食管鱗癌細胞系Eca109，發(fā)現(xiàn)其增殖速率低，且呈現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)改變[15]。本次試驗中，在食管鱗癌細胞系Eca109應用甲基化酶抑制劑5-aza-CdR干預組細胞較正常培養(yǎng)組細胞，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞密度降低，細胞間接觸變松，細胞體積增大，細胞內(nèi)可見大量空泡，呈凋亡形態(tài)，存活數(shù)減少。提示，5-aza-CdR在濃度10-4mol/L，培養(yǎng)96 h后，抑制作用明顯，說明5-aza-CdR對Eca109細胞的生長有抑制作用。

表1 AKAP12 mRNA在哈薩克族食管鱗癌組織中的表達與臨床病理資料的關系

Table 1 Correlation of AKAP12 mRNA expression with clinical parameters in Kazak patients with ESCC

因素AKAP12表達降低+-P性別1．000 男78 女12大體類型0．352 潰瘍型46 髓樣型01 隆起型43分化程度0．219 高分化31 中分化47 低分化12有無轉(zhuǎn)移0．382 有轉(zhuǎn)移13 無轉(zhuǎn)移77

表2 AKAP12 基因啟動子區(qū)甲基化與哈薩克族食管鱗癌臨床病理資料的關系

Table 2 Correlation of promoter region methylation of AKAP12 with clinical parameters in Kazak patients with ESCC

因素AKAP12表達降低+-P性別1．00 男114 女03大體類型0．556 潰瘍型19 髓樣型01 隆起型07分化程度0．275 高分化02 中分化112 低分化12有無轉(zhuǎn)移0．222 有轉(zhuǎn)移13 無轉(zhuǎn)移014

AKAP12是一種通過錨定關鍵信號蛋白(如蛋白激酶A和蛋白激酶C)和調(diào)節(jié)細胞周期蛋白的表達和凋亡來調(diào)節(jié)有絲分裂的蛋白激酶A。AKAP12通過誘導凋亡Caspase-3，使Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，抑制腫瘤細胞活性和增殖。AKAP12通過誘導細胞周期關鍵蛋白Cip1/p21和Kip/p27,使其表達增加，cyclin D1表達量減少，使細胞周期停滯[19]。AKAP12可以使血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達減少，抑制血管生長，這對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是關鍵的。在小鼠實驗中，SSeCKS(人鼠同源的AKAP12)過表達可以減少前列腺癌細胞向肺的惡性轉(zhuǎn)移[20]。有報道AKAP12調(diào)控RAS信號通路，啟動子甲基化使基因沉默，在青少年單核細胞白血病中發(fā)揮很大作用[21]。在多種腫瘤中，如胃癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等，AKAP12基因的抑癌作用被強烈抑制，而且在胃癌、兒童髓系惡性腫瘤中報道AKAP12啟動子區(qū)甲基化介導AKAP12基因失活[22,23]。

因5-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和β-肌動蛋白(β-actin)mRNA水平一般相對恒定,常用于基因表達研究時樣本加樣量的校正[24]。GAPDH和β-actin應用于本實驗，來校正實驗數(shù)據(jù)，使實驗結(jié)果更嚴謹。

本次實驗結(jié)果提示，AKAP12在Eca109細胞系5-aza-CdR處理組及正常培養(yǎng)組中甲基化率為0；在18對哈薩克族食管鱗癌組織中甲基化率為5.6%(1/18)。AKAP12在5-aza-CdR組表達量與對照組以β-actin為內(nèi)參相差0.99倍，P=0.96，以GAPDH為內(nèi)參相差1.93倍，P=0.47；在18對哈族食管鱗癌組織中，癌組織與癌旁組織表達量以β-actin為內(nèi)參相差0.86倍，P=0.74，以GAPDH為內(nèi)參相差2.87倍，P=0.11。AKAP12表達量及甲基化率與臨床病理參數(shù)，無相關性(P>0.05)。據(jù)文獻報道，AKAP12基因啟動子區(qū)甲基化在食管腺癌中比較普遍且具有組織特異性，在食管腺癌甲基化率為52.2%，而在食管鱗癌中AKAP12的甲基化率僅為7.7%[25]。且在相關腺癌中均有AKAP12啟動子區(qū)高甲基化報道，如肺腺癌[26]、乳腺癌等[22]。在組織水平上，AKAP12基因與病理參數(shù)之間也沒有統(tǒng)計學意義，可能是由于樣本例數(shù)造成的，因此需要進一步加大樣本例數(shù)對其進行進一步的研究。AKAP12基因雖然在前期實驗中被篩選出屬于經(jīng)5-aza-CdR處理組及正常培養(yǎng)組的差異表達基因，且表達倍數(shù)具有一定意義，但通過對其分別在食管鱗癌細胞系及食管鱗癌組織的驗證過程中，發(fā)現(xiàn)AKAP12基因在mRNA表達水平和甲基化水平，均沒有差異。得出結(jié)論，AKAP12基因具有組織特異性，在食管鱗癌中其甲基化發(fā)生率低。

綜上所述，5-aza-CdR作為甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑之一，可以促進凋亡，抑制Eca109細胞生長，可以為EC治療提供一種方法。在本次實驗AKAP12基因在ESCC細胞系Eca109及其18對哈族ESCC組織中，甲基化率低，表達量差異無統(tǒng)計學意義，但說明該基因甲基化具有組織特異性，對AKAP12基因甲基化做進一步研究時，需考慮該特性。

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Promoter methylation of AKAP12 in Kazakh patients with esophageal squamous cell carcinoma

GENG Yuehua1, YANG Limin1, LU Xiaomei2, LIU Meilian1, MENG Jiarong1*

(1Departmentofpathology,PLA175hospital,XiamenUniversityAffiliatedSouthestHospital,Zhangzhou363000,China;2ClinicalMedicalResearchInstitute,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversityofXinjiangMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:mengjiarong@sina.com)

ObjectiveTo explore the promoter methylation of AKAP12 gene in patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC), and its relationship with clinical parameters.MethodsAKAP12 methylation status was detected in Eca109 treated by 5-aza-CdR or normal culture, and 18 pairs of Kazakh’s ESCC tissues by methylation specific PCR(MSP). The expression of AKAP12 in ESCC cell lines Eca109 and 18 pairs of Kazakh ESCC tissues was detected by real time PCR(RT-PCR).ResultsThe methylation rate of AKAP12 and the normal cells was 0 in 5-aza-CdR-treated Eca109 cells and 5.6%(1/18) in ESCC tissues. The expression of AKAP12 in 5-aza-CdR group was 0.99 times as high as control group with β-actin as the internal reference(P=0.96), 1.93 times with GAPDH as the internal reference(P=0.47). The expression of AKAP12 in the tumor tissues of 18 pairs Kazakh’s ESCC was 0.86 times as high as that of paracancerous tissues with β-actin as the internal reference(P=0.74),2.87 times with GAPDH as the internal reference(P=0.11). The expression and the methylation rate of AKAP12 were not correlated with sex, morphologic type, differentiation and metastases(P>0.05).ConclusionThe methylation of AKAP12 is relatively low in esophageal squamous cell carcinoma.

esophageal squamous cell carcinoma; DNA methylation; AKAP12

解放軍175醫(yī)院苗圃基金資助項目(14Y005)

耿月華，女，1984-10生，碩士，住院醫(yī)師，E-mail:gengyuehua888@163.com

2016-09-20

R735.1

A

1007-6611(2017)01-0016-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.004