陳巧玲, 白亦光, 肖東琴, 劉 康 ， 馮 剛*

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院腫瘤分院，南充 637000； 2川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院骨科； 3川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所； *通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

攜帶PEDF基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用

陳巧玲1, 白亦光2, 肖東琴3, 劉 康3， 馮 剛3*

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院腫瘤分院，南充 637000；2川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院骨科；3川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所；*通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

目的 探討編碼色素上皮衍生因子的重組腺病毒(Ad-PEDF)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)小鼠Lewis肺癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用。 方法 采用藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估MSCs-PEDF對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞(LL/2)誘導(dǎo)的新生血管形成的抑制作用。C57BL/6小鼠皮下接種LL/2細(xì)胞7 d后，將荷瘤小鼠分為4組，每組18只。每組小鼠分別給予尾靜脈注射100 μl PBS、1×108PFU Ad-PEDF、5×105MSCs-LacZ或5×105MSCs-PEDF；每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤體積。接種后第30天每組處死8只小鼠觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，其余小鼠(n=10)繼續(xù)觀察生存期。 結(jié)果 藻酸鹽包裹實(shí)驗(yàn)顯示，與其他三個(gè)對(duì)照組相比，MSCs-PEDF治療組的藻酸鹽珠表面呈現(xiàn)較少的毛細(xì)血管網(wǎng)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的葡聚糖攝入量也較其他組低(P<0.01)。MSCs-PEDF組小鼠皮下腫瘤的體積明顯小于PBS組、Ad-PEDF組及MSCs-LacZ組[(1 038.8±139.0)mm3vs(2 897.7±274.9)mm3，(2 622.8±359.1)mm3，(3 019.2±360.9)mm3，P<0.01]。MSCs-PEDF組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于PBS組、Ad-PEDF組及MSCs-LacZ組(3.2±2.4vs16.0±4.0，14.6±5.3，16.1±4.9，P<0.05)，MSCs-PEDF組小鼠的生存期較其他各對(duì)照組顯著延長(P<0.01)。 結(jié)論 MSCs-PEDF可抑制LL/2皮下瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可延長荷瘤小鼠生存期，提示通過腺病毒轉(zhuǎn)染使MSCs分泌PEDF可作為一種新的針對(duì)肺癌的治療方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞； 色素上皮衍生因子； 非小細(xì)胞肺癌； 基因治療

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率較高，是最常見的肺癌類型，約占肺癌總數(shù)的85%[1,2]。手術(shù)治療僅對(duì)早期NSCLC患者具有較好療效，而放療和化療則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。因此，亟待開發(fā)治療NSCLC的新策略。

色素上皮衍生因子(PEDF)是一種分子量為50 kD的外分泌糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族成員，最初由Tombran-Tink等在胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中分離出來，后發(fā)現(xiàn)其廣泛表達(dá)于胚胎和成體組織中。由于PEDF選擇性抑制新生血管，而對(duì)已形成的血管則無太大影響，使其作為一個(gè)有吸引力的抗腫瘤血管生成候選因子而受到關(guān)注[3,4]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的非造血系成體干細(xì)胞，目前研究發(fā)現(xiàn)其具有較低的免疫原性，并可向損傷組織及腫瘤組織靶向遷移。因此，MSCs作為基因和藥物的細(xì)胞載體顯示出巨大的應(yīng)用前景，并越來越多地運(yùn)用在腫瘤的基因治療中[5,6]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已成功將重組色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)轉(zhuǎn)染MSCs，并在體外采用Western Blot檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的PEDF表達(dá)，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中PEDF濃度為(78.8±4.8)ng/ml。 HUVECs成管抑制實(shí)驗(yàn)和遷移抑制實(shí)驗(yàn)顯示，MSCs-PEDF分泌至培養(yǎng)液上清中的PEDF可顯著抑制HUVECs形成小管及向生長因子遷移，證明其分泌的是具有生物活性的PEDF蛋白。相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)論已形成論著發(fā)表于《西部醫(yī)學(xué)》[7]，在此基礎(chǔ)上，本研究建立小鼠Lewis肺癌(LL/2)皮下瘤模型，觀察攜帶PEDF基因的MSCs(MSCs-PEDF)在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長的抑制作用及小鼠生存期的影響，為腫瘤的靶向治療提供一種新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 小鼠LL/2肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(LL/2)及HEK293細(xì)胞株均購于美國模式培養(yǎng)物儲(chǔ)藏所(American type culture collection,ATCC)。

將LL/2細(xì)胞置于含有10%胎牛血清及100 U/ml阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代， 2-3 d傳代1次。

1.2 藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將藻酸鈉溶于無菌生理鹽水，使其終濃度為1.5%。收集對(duì)數(shù)生長期的LL/2細(xì)胞，將其用1.5%藻酸鈉溶液重懸。將該細(xì)胞懸液用100 μl加樣器緩慢滴入磁力攪拌的250 mmol/L氯化鈣溶液中，形成乳白色的藻酸鹽小珠，每粒小珠含有LL/2細(xì)胞約1×105個(gè)。8周齡的C57BL/6小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，消毒并切開背部的皮膚，皮下植入2粒藻酸鹽小珠，縫合皮膚，外敷手術(shù)膠膜。次日小鼠隨機(jī)分為4組(3只/組)，每組小鼠分別予以尾靜脈注射100 μl PBS、1×108PFU Ad-PEDF、5×105MSCs-LacZ或5×105MSCs-PEDF。第12天，每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射100 μl FITC標(biāo)記的葡聚糖(FITC-Dextran，100 mg/kg)。麻醉小鼠后解剖暴露出藻酸鹽顆粒(附帶部分皮膚)，在解剖顯微鏡下觀察并照相。注射FITC-Dextran 20 min后處死小鼠，取出藻酸鹽顆粒，加入2 ml生理鹽水后搗碎顆粒并混勻標(biāo)本，室溫靜置1 h。1 500 r/min離心5 min，取上清液，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。用不同濃度的FITC-Dextran制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 小鼠LL/2肺癌皮下瘤模型的建立

6-8周齡C57BL/6雌性小鼠，清潔動(dòng)物，購自四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。收集對(duì)數(shù)生長期的LL/2細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，細(xì)胞沉淀以無血清培養(yǎng)基洗滌3次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量后調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml，無菌條件下送到動(dòng)物室。在C57BL/6小鼠一側(cè)背部皮下接種LL/2細(xì)胞100 μl(5×105個(gè)細(xì)胞/只)。接種后7-8 d，腫瘤最大徑達(dá)到3-5 mm，小鼠腫瘤模型即建立成功。

1.4 小鼠分組及治療

將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。Ⅰ組：100 μl PBS；Ⅱ組：100 μl 1×108PFU Ad-PEDF病毒液；Ⅲ組：100 μl 5×105MSCs-LacZ；Ⅳ組：100 μl 5×105MSCs-PEDF。分別給予尾靜脈注射，每4 d注射1次，共給予2次治療。

我父親在省醫(yī)院看過，不過大醫(yī)院人多，幾百人排隊(duì)掛號(hào)、取藥。他可能意識(shí)到自己的病沒救了，整個(gè)人無精打采的，打完針就去睡覺，不愿和人說話。對(duì)于我來說，父母親這么大年紀(jì)，去大醫(yī)院我們不放心，但在莫多寺曼巴照顧得十分周到，我心里特別感謝。在莫多寺看病，活佛讓他一邊服藥，一邊鼓勵(lì)他參加寺院的開示和法會(huì)?？赡苁鞘芑罘鸬慕袒?，他完全放開了，感覺他有精神了，人也開朗了，有時(shí)還和我母親開開玩笑。[注]訪談人：歐陽麗婷；訪談對(duì)象：云丹；訪談時(shí)間：2015年9月15日；訪談地點(diǎn)：青海省興?？h莫多寺。

1.5 觀察指標(biāo)

每隔3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長、寬徑及小鼠體重，并觀察荷瘤小鼠的行動(dòng)、對(duì)外界刺激的反應(yīng)及飲食情況等。計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤的生長曲線。腫瘤體積計(jì)算公式：體積(mm3)=0.52×長2×寬2。在接種后第30天采用斷頸法處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎浸泡于4%多聚甲醛固定。每個(gè)腫瘤組織取一部分置于-80 ℃凍存，其余部分浸泡于4%多聚甲醛。

1.6 生存分析

為進(jìn)一步了解PEDF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)LL/2荷瘤小鼠生存期的影響，取40只LL/2皮下瘤模型小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為PBS組、Ad-PEDF組、MSC-LacZ組、MSC-PEDF組，具體給藥及治療方案完全同皮下瘤的療效研究。記錄每只小鼠的死亡時(shí)間。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

通過藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察MSCs-PEDF在體內(nèi)對(duì)腫瘤新生血管形成的抑制作用,結(jié)果顯示，PBS、Ad-PEDF及MSCs-LacZ組藻酸鹽珠表面有較多微血管生成，而MSCs-PEDF組則微血管明顯減少(見圖1)。FITC-Dextran攝入量檢測(cè)顯示，MSCs-PEDF組較其余3組 FITC-Dextran攝入明顯減少(P<0.01)。以上結(jié)果說明，MSCs-PEDF可抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的新生血管形成。

圖1 藻酸鹽包裹實(shí)驗(yàn)觀察MSCs-PEDF抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管形成Figure 1 The antiangiogenic activity of MSCs-PEDF by alginate-encapsulated tumor cell assay

2.2 MSCs-PEDF抑制小鼠LL/2皮下瘤生長

如圖2所示，MSCs-PEDF治療組與其余各組相比，可顯著抑制腫瘤生長(P<0.01)，MSCs-LacZ治療組與PBS組相比無顯著差異(P>0.05)。而Ad-PEDF組與PBS組比較，僅在給藥后短期內(nèi)對(duì)腫瘤稍有抑制作用，而到后期則與PBS組差異不明顯(P>0.05)

2.3 MSCs-PEDF對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用

處死LL/2荷瘤小鼠后, 摘取各組小鼠的肺臟計(jì)算肺表面的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù),結(jié)果顯示，MSCs-PEDF治療明顯抑制了肺轉(zhuǎn)移，與其他三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。Ad-PEDF組與PBS組無明顯差異(P>0.05)。

2.4 MSCs-PEDF延長LL/2荷瘤小鼠生存期

PBS治療組于接種后第42 天全部死亡，而對(duì)生存期進(jìn)行Log-Rank(Mantel-Cox)分析顯示，MSCs-PEDF治療組與其余各組相比生存期明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

2.5 觀察毒副反應(yīng)

每3d測(cè)量1次小鼠體重，作為毒性反應(yīng)的評(píng)估指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)過程中，MSCs-PEDF治療組與PBS組比較，荷瘤小鼠的體重變化無明顯差異(P>0.05，見圖5)。同時(shí)，各組小鼠的皮毛、食欲、行為等也無特殊改變。表明MSCs-PEDF對(duì)小鼠并不產(chǎn)生明顯的毒副作用。

與其余三個(gè)對(duì)照組比較，*P<0.01圖2 MSCs-PEDF對(duì)LL/2皮下瘤模型的生長抑制作用Figure 2 MSCs-PEDF inhibited growth in LL/2 subcutaneous tumor model

與其余三個(gè)對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 不同處理后LL/2皮下瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)Figure 3 Lung metastasis nodules number in the LL/2 subcutaneous tumor model in different groups

圖4 LL/2荷瘤小鼠生存分析Figure 4 Survival analysis of LL/2 tumor bearing mice

圖5 荷瘤小鼠體重改變情況Figure 5 Changes of body weight of tumor bearing mice

3 討論

腫瘤進(jìn)展依賴于新的血管網(wǎng)的生成以供給其營養(yǎng)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是血管依賴性疾病，腫瘤血管生成在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著重要作用。如果能有效地阻止NSCLC的血管生成，就有望控制手術(shù)或放、化療治療后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8,9]。

PEDF具有強(qiáng)有力的抗血管生成活性，并且還可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化等多種途徑來抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。以上的生理特性，奠定了PEDF應(yīng)用于腫瘤治療的基礎(chǔ)[3]。目前，已有大量的實(shí)驗(yàn)研究顯示，PEDF在包括NSCLC在內(nèi)多種腫瘤模型中取得了良好的效果，可顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[10]。在本研究中，攜帶PEDF基因的腺病毒(AD-PEDF)在LL/2皮下瘤的生長及轉(zhuǎn)移中相對(duì)于PBS組均表現(xiàn)出了強(qiáng)有力的抑制作用，證實(shí)了PEDF在NSCLC中具有抑瘤作用。然而，病毒或非病毒為載體的基因治療，由于缺乏靶向性，不能滲透脈管壁難以穿透至腫瘤組織。而純化的重組蛋白在體內(nèi)易于降解，需要長期、反復(fù)給藥，并且因蛋白的制備、純化困難，價(jià)格較為昂貴。這些缺點(diǎn)大大降低了它們潛在的治療效果和應(yīng)用價(jià)值[10,11]。因此，如何將PEDF基因有效地運(yùn)送到腫瘤部位，并使其在局部持續(xù)表達(dá)是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為一種理想的細(xì)胞載體而被廣泛應(yīng)用于腫瘤的基因治療。首先，MSCs的低免疫原性可使其在宿主體內(nèi)存活數(shù)百天以上并長效表達(dá)外源基因，對(duì)慢性疾病可活的更好的治療效應(yīng)；其次，MSCs具有向腫瘤組織歸巢的特性，因此，它們可以使抗腫瘤藥物在腫瘤局部達(dá)到較高的濃度，并可降低這些藥物對(duì)機(jī)體正常組織器官的副作用；最后，MSCs易于在體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增以及基因修飾，為以后的臨床應(yīng)用提供了便利并且花費(fèi)相對(duì)低廉[12]。已有研究證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)IFN-β的MSCs在體內(nèi)對(duì)黑色素的治療效應(yīng)，這是MSCs在體內(nèi)作為細(xì)胞載體的第一個(gè)報(bào)道[13]。后續(xù)的大量研究也證實(shí)了MSCs與不同的治療策略相結(jié)合在抗腫瘤治療中的巨大潛力[14-16]。在本研究中，MSCs-PEDF與Ad-PEDF相比對(duì)LL/2皮下瘤具有更強(qiáng)的抑制作用，并且能更好地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，使荷瘤小鼠獲得更長的生存期。因此，MSCs是一個(gè)相對(duì)完美的運(yùn)輸載體，它們可以保護(hù)PEDF基因在循環(huán)系統(tǒng)中不被清除，并且也不會(huì)因?yàn)樵谘褐袧舛冗^高而對(duì)其他組織造成影響，同時(shí)還可促進(jìn)PEDF的治療作用。MSCs-PEDF可定向遷移到腫瘤部位，而Ad-PEDF卻沒有這種能力。

本研究證實(shí)MSCs-PEDF可通過抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的新生血管形成，從而抑制LL/2腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可延長荷瘤小鼠的生存期。這些結(jié)果預(yù)示著用MSCs作為基因載體是一個(gè)很有前景的腫瘤治療策略，它改變了腺病毒載體本身固有的一些缺陷，為將來的臨床應(yīng)用研究打下了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)展性腫瘤的靶向治療提供了一個(gè)新的策略。

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Inhibitory effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells carrying PEDF gene on Lewis lung carcinoma in mice

CHEN Qiaoling1, BAI Yiguang2, XIAO Dongqin3, LIU Kang3, FENG Gang3*

(1DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2OrthopaedicDepartment,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail：lssmd18@gmail.com)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs) transfected with recombinant adenovirus encoding pigment epithelium-derived factor(Ad-PEDF) on the growth and metastasis of Lewis lung carcinoma in mice.MethodsAn alginate-encapsulated tumor cell assay was conducted to evaluate the inhibition of MSCs-PEDF on angiogenesis induced by Lewis lung carcinoma cells(LL/2).C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously in the right flank with LL/2 cells. At 7 d after inoculation, the mice were divided into four groups(n=18 in each group). Mice were administered with 100 μl PBS, 1×108PFU Ad-PEDF, 5×105MSCs-LacZ or 5×105MSCs-PEDF in four groups by tail vein injection, respectively. Tumors were monitored every 3 d with caliper. Eight mice from each group were sacrificed at 30 d after inoculation to observe the pulmonary metastases nodules, and the rest ten mice in each group were monitored for observing the long-term survival.ResultsAlginate-encapsulated tumor cell assay exhibited that capillary network of alginate beads was apparently reduced and FITC-dextran uptake was decreased in MSCs-PEDF-treated mice compared with that in controls. The volume of subcutaneous tumors was significantly smaller in MSCs-PEDF group than in PBS group, Ad-PEDF group or MSCs-LacZ group [(1 038.8±139.0)mm3vs(2 897.7±274.9)mm3,(2 622.8±359.1)mm3, (3019.2±360.9)mm3，P<0.01). The number of pulmonary metastases nodules in MSCs-PEDF group was also less than in PBS group, Ad-PEDF group or MSCs-LacZ group(3.2±2.4vs16.0±4.0, 14.6±5.3,16.1±4.9，P<0.05), and the survival time of mice in MSCs-PEDF group was prolonged compared to the other control groups(P<0.01). Furthermore, the body weight of mice had no significant difference between MSCs-PEDF group and PBS group(P>0.05).ConclusionMSCs-PEDF may inhibit the growth and metastasis of LL/2 subcutaneous tumors, and promote the survival of tumor-bearing mice, which suggesting that MSCs engineered to secrete PEDF by adenoviral transfection may be a novel therapeutic approach for lung carcinoma.

mesenchymal stem cells； pigment epithelium-derived factor； non-small cell lung carcinoma； gene therapy

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30872614)；四川省教育廳理科重點(diǎn)資助項(xiàng)目(15ZA0216,15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項(xiàng)目(14A0017,14A0022)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(CBY14-A-ZD02,CBY15-A-ZD02)；四川省衛(wèi)計(jì)委科研基金資助項(xiàng)目(16PJ202)

陳巧玲，女，1983-03生，博士，主治醫(yī)師，E-mail:cql166@163.com

2016-10-27

R734.2

A

1007-6611(2017)01-0011-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.003