祁 杰， 朱火蘭， 薛孟華， 鐘妮兒， 梁 磊， 孫超峰(

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科，西安 710068； 2陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科； 3唐都醫(yī)院胸外科； 4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科； *通訊作者，E-mail：zhuhuolan2016@163.com)

非洛地平對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響

祁 杰1， 朱火蘭2*， 薛孟華3， 鐘妮兒1， 梁 磊1， 孫超峰4(1

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科，西安 710068；2陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科；3唐都醫(yī)院胸外科；4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；*通訊作者，E-mail：zhuhuolan2016@163.com)

目的 研究非洛地平對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA、蛋白表達(dá)影響及其抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制。 方法 將氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共孵育，篩選合適的 ox-LDL干預(yù)濃度梯度與時間，與不同濃度的非洛地平(0.1，1，10 μmol/L)共孵育24 h，real time-PCR檢測細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)，Western blot檢測ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)變化。將HUVECs與U937單核細(xì)胞共培養(yǎng)，高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，計數(shù)被黏附的HUVECs個數(shù)并計算黏附率。 結(jié)果 隨著ox-LDL刺激濃度(6，12.5，25 mg/L)的增加，ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平及蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，當(dāng)ox-LDL濃度增加為25 mg/L時，作用最為顯著(P<0.05)。非洛地平可抑制ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)；25 mg/L ox-LDL處理時被黏附的HUVECs較空白對照明顯增多(P<0.01)；0.1 μmol/L非洛地平顯著抑制HUVECs與U937的相互黏附(P<0.01)。 結(jié)論 非洛地平通過下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)從而抑制單核-血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附。

非洛地平； 氧化型低密度脂蛋白； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥反應(yīng)過程[1]，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。近年來隨著相關(guān)研究的逐漸深入，已從基因調(diào)控水平和信號傳導(dǎo)的相關(guān)研究揭示了炎癥是AS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。目前常用降壓類藥物中二氫吡啶類鈣通道阻滯劑的多效作用備受關(guān)注，而其中的抗AS作用尤其受到推崇，但其中的具體機(jī)制尚未闡明。非洛地平(felodipine)是臨床常用的長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，作為治療高血壓病的藥物已得到廣泛應(yīng)用，在我們前期的研究中，發(fā)現(xiàn)非洛地平可減輕兔主動脈粥樣硬化病變[2]。本實驗擬從細(xì)胞分子水平探討非洛地平的抗AS作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清購自杭州四季青生物研究所；M199培養(yǎng)基購自GIBCO公司；非洛地平藥物原粉、溶劑二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑(Trizol)為Invitrogen公司產(chǎn)品；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測試劑盒為北京中杉生物公司產(chǎn)品；ICAM-1,VCAM-1兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成；DNA熒光染料(SYBR GreenⅡ)為Takara公司產(chǎn)品；實驗中所用其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)取自于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科正常足月妊娠分娩的新生兒臍帶。首先在無菌條件下剪下臍帶，3 h內(nèi)行HUVECs的分離培養(yǎng)；之后置于條件為37 ℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，待原代細(xì)胞生長至85%左右，融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；接著將原代和第3代的內(nèi)皮細(xì)胞接種于蓋玻片上，待均勻鋪滿孔底后用PBS沖洗，吹干后放置于-20 ℃低溫冰箱中凍存，用于Ⅷ因子相關(guān)抗原的檢測。本實驗中選用傳代至第4代細(xì)胞；U937是一種單核細(xì)胞，體外培養(yǎng)呈懸浮生長，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心提供。

1.3 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)的制備

使用一次性密度梯度超速離心法分離低密度脂蛋白(LDL)。從血庫購買新鮮健康人的血漿。將新鮮血漿置于密度為1.063、1.020的梯度液中，在4 ℃、50 000 r/min的條件下離心5 h。之后在透析液中將分離出的LDL透析36 h，接著用濾膜除菌保存。然后在無EDTA的PBS中透析36 h，加入含有CuSO4的PBS液繼續(xù)氧化，最后置于PBS液中透析24 h。制備完成后避光保存。選用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定LDL和ox-LDL的純度。采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法確定LDL氧化修飾的程度。

1.4 實驗分組

在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育第3代HUVEC，傳代后接種在6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長融合至80%后，在胎牛血清的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，接著采用不同濃度的ox-LDL與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育，完成后使用不同濃度的非洛地平進(jìn)行干預(yù)。具體實驗分組：①空白對照組；②ox-LDL組(As模型)；③非洛地平組：非洛地平與濃度為25 mg/L ox-LDL共培養(yǎng)；④溶劑對照組。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的鑒定

取出凍存的蓋玻片，加入多聚甲醛固定，再用PBS沖洗；本研究采用免疫熒光染色法，先滴加1∶10的兔抗人Ⅷ因子抗體血清，再滴加1∶100熒光素標(biāo)記的羊抗兔免疫熒光抗體，實驗同時設(shè)定陰性對照及空白對照。完成后置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測ICAM-1,VCAM-1 mRNA的表達(dá)

①RNA的提?。簠⒄赵噭┖兴鶐дf明書提取RNA，實驗中所用的器皿均采用1 g/L DEPC水處理以防止RNA酶污染；②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：在PCR儀上按照逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒說明書的流程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；③ICAM-1、VCAM-1及GAPDH引物的設(shè)計與合成：ICAM-1的正義引物為5′-CCGGAAGGTGTATGAACGT-3′,反義引物為5′-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3′； VCAM-1的正義引物為5′-GGGACCACATCTACGCTGACAA-3′,反義引物為5′-GGCCACTCAAATGAATCTCTGGA-3′；GAPDH的正義引物為5′-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAG-3′，反義引物為5′-GTGGAATCATATTGGAACATGTAG-3′；④擴(kuò)增目的基因ICAM-1、VCAM-1：反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，在95 ℃ 5 min，58.5 ℃ 15 min，72 ℃ 10 min條件下擴(kuò)增40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將采集到的各個反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長指數(shù)進(jìn)行分析。

1.7 Western blot分析

將HUVEC細(xì)胞以3×105/ml接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，用ox-LDL孵育以及用非洛地平干預(yù)的細(xì)胞用預(yù)冷PBS沖洗3遍。加入80 μl的細(xì)胞裂解液，細(xì)胞刮刀充分刮下細(xì)胞，使其與裂解液充分接觸，置于冰浴20 min。將收集的細(xì)胞在置于預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中離心20 min，收集細(xì)胞上清。用BCA法進(jìn)行細(xì)胞蛋白含量的測定。取等量的蛋白按照4∶1的比例將其用5×loading buffer進(jìn)行稀釋，并在沸水浴中煮沸5 min。12%的SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，與在300 mA恒流的條件下轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用8%的牛奶封閉2 h，過夜孵一抗(1∶100 ICAM-1及VCAM-1兔抗人多克隆抗體)，用PBST充分洗膜后，加入相應(yīng)的二抗孵育2 h。按說明使用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.8 細(xì)胞黏附實驗

將24孔板中單層HUVECs培養(yǎng)上清棄去；按實驗分組分別加入不同處理試劑；將U937細(xì)胞離心洗滌，制成4×106個/ml的細(xì)胞懸液；將干預(yù)處理完成的HUVECs每孔加入500 μl的U937細(xì)胞懸液共培養(yǎng)，置于孵箱中孵育0.5 h；取出后每孔用500 μl PBS液吹打洗滌2次；高倍鏡(10×40)下計數(shù)被黏附的HUVECs個數(shù)，并計算黏附率(被黏附的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)/總內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)×%)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HUVEC形態(tài)學(xué)觀察及驗證

細(xì)胞接種24 h后，在倒置顯微鏡下，呈鋪路石狀排列，為扁平多角形，胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮，核仁1-2個，傳代細(xì)胞比原代生長旺盛。在熒光顯微鏡下可見HUVEC胞質(zhì)內(nèi)有黃綠色熒光，從而證實人Ⅷ因子相關(guān)因子的存在。

2.2 ox-LDL及非洛地平對HUVEC的ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響

ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)隨著ox-LDL濃度的增加逐漸上調(diào)；當(dāng)ox-LDL刺激濃度達(dá)到25 mg/L時作用最為顯著，分別為對照組的2.24±0.25，2.69±0.38倍(P<0.05，見圖1)。不同藥物干預(yù)濃度的非洛地平均可抑制ox-LDL刺激下ICAM-1、VCAM-1mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示以低濃度作用顯著，分別為對照組的0.46±0.12和0.38±0.13倍(P<0.05，見圖2)。

2.3 ox-LDL及非洛地平對HUVEC的ICAM-1，VCAM-1蛋白水平表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，HUVEC與ox-LDL孵育后，ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)增加；而非洛地平可抑制25 mg/L ox-LDL刺激下ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)(見圖3)。

與空白組比較，*P<0.05圖1 不同濃度ox-LDL作用下ICAM-1、VCAM-1mRNA的表達(dá)Figure 1 The effects of ox-LDL on mRNA level of ICAM-1,VCAM-1

與25 mg/L ox-LDL比較，*P<0.05圖2 非洛地平對HUVEC中ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響Figure 2 Effects of felodipine on ox-LDL-induced ICAM-1,VCAM-1 mRNA levels in HUVECs

2.4 HUVEC與U937共培養(yǎng)細(xì)胞黏附實驗

25 mg/L ox-LDL處理后被黏附的HUVECs較空白對照明顯增多(P<0.01)；加入0.1 μmol/L非洛地平后顯著抑制HUVECs與U937細(xì)胞的相互黏附(P<0.01，見圖4)。

3 討論

目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)是AS形成、不穩(wěn)定斑塊的進(jìn)展和急性冠脈綜合征的主要病因；動脈內(nèi)皮損傷引起表面黏附性改變，表達(dá)黏附分子，促進(jìn)單核細(xì)胞黏附，是AS形成的始動環(huán)節(jié)[3]。ICAM-1和VCAM-1是目前研究較多的分子。相關(guān)研究表明ox-LDL通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)以介導(dǎo)單核細(xì)胞與其黏附[4-6]。VCAM-1在AS形成早期主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，ox-LDL同樣可誘導(dǎo)VCAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)增加。大量研究證據(jù)表明黏附分子所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與了AS病理過程[7]。隨著研究的深入，研究者對ICAM-1、VCAM-1在AS中的分子表達(dá)機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討，發(fā)現(xiàn)了是以活性氧(ROS)作為中介，從而激活NF-κB加強(qiáng)了ICAM-1、VCAM-1的轉(zhuǎn)錄[8]。本實驗表明,ox-LDL呈濃度依賴性上調(diào)ICAM-1、VCAM-1mRNA及蛋白水平的表達(dá)。在前期實驗工作中我們得出ox-LDL可誘導(dǎo)HUVECs的ROS產(chǎn)生增加，非洛地平可明顯抑制ROS產(chǎn)生，提示降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可減少ROS的產(chǎn)生，從而下調(diào)ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)。由于黏附分子參與了內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的黏附，因此探討其黏附過程、機(jī)制及影響因素等具有重要的意義。為觀察藥物影響炎癥細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，以U937細(xì)胞與HUVECs的黏附作為實驗?zāi)Ｐ鸵延袌蟮繹9-11]，本研究同樣證明非洛地平對ox-LDL誘導(dǎo)的黏附具有抑制效應(yīng)，與ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平結(jié)果一致，說明非洛地平抑制兩種細(xì)胞的黏附與其抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)密切相關(guān)，這對于解釋非洛地平的抗炎作用提供了一個有力的證據(jù)。大量基礎(chǔ)研究及臨床試驗[12-14]證實了多數(shù)鈣離子拮抗劑具有抗AS作用，其可能的機(jī)制為：①抑制單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附；②抗氧化作用；③減輕炎癥反應(yīng)。Tan等[15]研究表明非洛地平能減輕代謝綜合征模型小鼠的血管炎癥反應(yīng)；Yao等[16]發(fā)現(xiàn)非洛地平對載脂蛋白E基因敲除模型小鼠有抗AS作用。本實驗表明非洛地平可顯著下調(diào)ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，具有抗炎的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

圖3 非洛地平抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)增加(n=8)Figure 3 Felodipine (0.1 μmol/L) inhibit ox-LDL-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression (n=8)

圖4 非洛地平抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs與U937細(xì)胞的相互黏附(n=8)Figure 4 Felodipine blocked ox-LDL-induced monocyte cell adhesion of U937 to HUVECs(n=8)

綜上，本實驗研究得出非洛地平可能通過減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC的鈣負(fù)荷，抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮抗AS的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能，從而進(jìn)一步證實了鈣離子拮抗劑在AS發(fā)生發(fā)展中的保護(hù)作用，為其在臨床上老藥新用，合理、準(zhǔn)確用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.

[2] 盛嬰,孔澍.非洛地平減輕兔動脈粥樣硬化的實驗研究[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(12):1091-1094.

[3] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423):801.

[4] Takami S,Yamashita S,Kihara S,etal.Lipoprotein(a) enhances the expression of intercellular adhesion molecule-1 in cultured human umbilical vein endothelial cell[J].Circulation,1998,97(8):721-728.

[5] Li D,Chen H,Romeo F,etal.Statins modulate oxidized low-density lipoprotein-mediated adhesion molecule expression in human coronary artery endothelial cells:role of LOX-1[J].J Parmacol Exp Ther,2002,302(2):601-605.

[6] 王斌,管思明.氧化型低密度脂蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1及NO表達(dá)的影響[J].中國微循環(huán),2004,8(3):140-142.[7] Libby P,Ridker PM,Maaseri A.Inflammation and atherosclerosis[J].Circulation,2002,105(9):1135-1143.

[8] Guha M,Bai W,Nadler JL,etal.Molecular mechanisms of tumor necrosis factor alpha gene expression in monocyte cells via hypenglycemia-induced oxidant stress-dependent and independent pathways[J].J Biol Chem,2000,275(23):17728-17739.

[9] Mori M,Tsukahara F,Yoshioka T,etal.Suppression by 17beta-estradiol of monocyte adhesion to vascular endothelial cells is mediated by estrogen receptors[J].Life Sci,2004,75(5):599-609.

[10] Lei ZB,Zhang Z,Jing Q,etal.OxLDL upregulates CXCR2 expression in monocytes via scavenger receptors and activation of p38 mitogen-activated protein kinase[J].Cardiovasc Res,2002,53(2):524-532.

[11] Gutierrez G,Mendoza C,Zapata E,etal.Dehydroepiandrosterone inhibits the TNF-alpha-induced inflammatory response in human umbilical vein endothelial cells[J].Atherosclerosis,2007,190(1):90-99.

[12] Uetake Y,Shimosawa T.Antiatherosclerotic hopes of calcium channel blockers[J].Clin Calcium,2005,15(10):1689-1694.

[13] Mancini GB.Antiatherosclerotic effects of calcium channel blockers[J].Prog Cardiovasc Dis,2002,45(1):1-20.

[14] Simon A,Levenson J.Effects of calcium channel blockers on atherosclerosis:new insights[J].Acta Cardiol,2002,57(4):249-255.

[15] Tan HW,Xing SS,Bi XP,etal.Felodipine attenuates vascular inflammation in a fructose-induced rat model of metabolic syndrome via the inhibition of NF-κB activation[J].Acta Pharmacol Sin,2008,29(9):1051-1059.

[16] Yao R,Cheng X,Liao YH,etal.Molecular mechanisms of felodipine suppressing atherosclerosis in high-cholesterol-diet apolipoprotein E-knockout mice[J].J Cardiovasc Pharmacol,2008,51(2):188-195.

Effects of felodipine on the expression of cell adhesion molecule in human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein

QI Jie1，ZHU Huolan2*，XUE Menghua3，ZHONG Ni’er1，LIANG Lei1, SUN Chaofeng4

(1SecondDepartmentofCardiovascularMedicine,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2FirstDepartmentofCardiovascularMedicine,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;3DepartmentofThroacicSurgery,TangduHospital;4DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：zhuhuolan2016@163.com)

ObjectiveTo investigate the effect of felodipine on the mRNA and protein expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) in human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein and its mechanism of anti-atherosclerosis.MethodsThe concentration gradient and time of incubation of oxidized low density lipoprotein(ox-LDL) were screened, and then the human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were co-incubated with ox-LDL and different concentration of felodipine(0.1,1,10 mol/L) for 24 h. Then the mRNA and protein expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 were detected by real time-PCR and Western blot. After HUVECs and U937 cells were co-cultured, the morphological changes were observed under light microscope, and the number of HUVECs adhesion was counted and the adhesion rate was calculated.ResultsWith the increase of ox-LDL concentration, the mRNA and protein expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 gradually increased, and peaked at the concentration of 25 mg/L(P<0.05). Felodipine suppressed the mRNA and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1(P<0.05). Adhesion rate of U937 cells to HUVECs were significantly higher in in 25 mg/L ox-LDL group than in 0 mg/L ox-LDL group(P<0.01). Felodipine(0.1 mol/L) significantly inhibited the adhesion of HUVECs and U937(P<0.01).Conclusionfelodipine may inhibit the adhesion of monocyte and endothelial cell through down-regulation of ICAM-1, VCAM-1 expression in endothelial cells and play an anti-inflammatory protective effect.

felodipine; ox-LDL; atherosclerosis; HUVECs

祁杰，女，1983-09生，在職博士，主治醫(yī)師，E-mail：qijie_1983@163.com

2016-11-08

R543.5

A

1007-6611(2017)01-0001-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.001