林 欽，黃紅霞，張 莉，嚴(yán) 恒，李道霞，劉 美，李曉瑜，黃 瑛

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610097；4.國家食品藥品監(jiān)督管理總局，北京 100053）

高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃

林 欽1，黃紅霞1，張 莉2，嚴(yán) 恒2，李道霞3，劉 美3，李曉瑜4，黃 瑛3

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610097；4.國家食品藥品監(jiān)督管理總局，北京 100053）

建立一種同時測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃的高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法。對提取溶劑及色譜條件進行優(yōu)化，粉碎后的樣品經(jīng)乙腈提取，提取液以HPLC-MS/MS測定，外標(biāo)法定量。二甲基黃、二乙基黃在3min內(nèi)流出并完全分離，兩者在0.05～10μg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999，二甲基黃在0.5～50μg/kg的加標(biāo)回收率為90.0%～93.4%，RSD為0.5%～5.1%，二乙基黃在0.5～50μg/kg水平的加標(biāo)回收率在84.6%～93.8%，RSD為1.1%～4.6%，檢出限兩者均為0.2 μg/kg。該方法操作簡捷、準(zhǔn)確度和精密度高，適用于豆制品中二甲基黃、二乙基黃的檢測。

二甲基黃；二乙基黃；高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜；豆制品

0 引 言

二甲基黃（methyl yellow）[1]、二乙基黃（ethyl yellow）[2-3]是偶氮苯類化工染料，不允許在食品中使用，有研究報道二甲基黃可能使實驗動物患癌[4]。香港食物環(huán)境衛(wèi)生署食物安全中心2014年12月6日發(fā)布了關(guān)于從臺灣豆干制品檢出二甲基黃的新聞，12月24日臺灣食品藥物管理部門公布了豆制品乳化劑中又驗出另一種致癌物二乙基黃。為排查風(fēng)險隱患，福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院研究提出了食品中二甲基黃的檢測方法，湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院提出了二乙基黃的檢測方法。四川食品藥品檢驗檢測院作為全國豆制品抽檢監(jiān)測工作牽頭單位，整合修改了兩種檢測方法，形成了同時測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），并經(jīng)北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、河北省食品檢驗研究院等5家機構(gòu)驗證表明效果良好。目前文獻報道的可用于二甲基黃的測定方法主要有HPLC[5-8]、LC-MS[9-12]、GC-MS[13]，液相色譜法的選擇性較差、靈敏度低，易造成假陽性的檢測結(jié)果。迄今尚未見文獻報道食品中二乙基黃的檢測方法。本文建立的方法可同時用于檢測食品中的二甲基黃、二乙基黃，樣品前處理較文獻[12]報道的更為快速、簡便，且測得二甲基黃的線性及回收率均較文獻報道的更好。本方法將三重四級桿質(zhì)譜用于同時檢測二甲基黃和二乙基黃，具有很高的選擇性和靈敏度，兩對定性離子同時監(jiān)測有利于測定準(zhǔn)確性，能有效避免假陽性結(jié)果的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配Quattro Premier XE串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；渦旋混勻器（美國熱電公司，MIXII）；冷凍高速離心機 （美國貝克曼公司，Avanti J-E）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng) （美國 Millipore公司）；超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司，KQ-800KDE）；分析天平（賽多利斯北京有限公司，BSA224S）。

1.2 材料與試劑

二甲基黃、二乙基黃對照品，純度均大于98%（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH）；豆制品試驗樣品（超市購買和網(wǎng)購）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（美國Fisher公司）；氯化鈉為分析純 （上海國藥集團）；水為Milli-Q超純水純化系統(tǒng)制備的去離子水。

1.3 對照溶液配制

1.3.1 對照儲備液

準(zhǔn)確稱取適量二甲基黃、二乙基黃對照品，分別用乙腈制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的對照儲備液，4℃下保存，有效期6個月。

1.3.2 基質(zhì)對照工作液

分別準(zhǔn)確量取二甲基黃、二乙基黃對照儲備液5.0mL，用乙腈定容至同一100mL容量瓶中，即得混合對照溶液，質(zhì)量濃度均為0.5mg/L。準(zhǔn)確移取混合對照溶液適量，用乙腈分別稀釋至0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/L，即得混合對照系列溶液。

分別精密量取上述混合對照系列溶液1.0 mL，氮吹至近干后，用1.0 mL空白基質(zhì)（不含二甲基黃、二乙基黃的樣品溶液）復(fù)溶，即得基質(zhì)對照工作溶液，質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00μg/L。

1.4 樣品前處理

稱取粉碎后的豆制品試樣約2 g（精確至1 mg）置50mL的離心管中，加入5mL水，渦旋混勻，準(zhǔn)確加入 20.0 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取 30 min（溫度控制在室溫以下），再加入2.0g氯化鈉，混勻后于10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.2 μm有機濾膜，續(xù)濾液供測定。

1.5 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序

表2 二甲基黃、二乙基黃主要質(zhì)譜參數(shù)

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧（ESI）離子源；離子化模式：正模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓3.50kV；源溫度120℃；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流量700 L/h；錐孔反吹氣流量50 L/h；碰撞室壓力2.7×10-3Mbar（1bar=1×105Pa）；電子倍增管電壓650V。二甲基黃、二乙基黃定性離子、定量離子及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表3 回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）

2 結(jié)果與驗證

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

圖1 二甲基黃、二乙基黃空白基質(zhì)加標(biāo)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜MRM色譜圖

試驗中嘗試以甲醇作為提取溶劑，進行直接提取測定，但結(jié)果顯示，甲醇提取干擾較大，不同添加水平的回收率均偏高，故選取乙腈+水作為提取溶劑，并采用鹽析的方法分離乙腈與水。實驗中比較了乙腈（20 mL）、乙腈+水（20 mL+2 mL）、乙腈+水（20mL+5mL）3種不同溶劑對二甲基黃、二乙基黃的提取效果。當(dāng)只用乙腈提取時，回收率明顯偏低，只有60%左右，而加入水后回收率明顯上升；由于當(dāng)水的加入量為2mL時，樣品易結(jié)塊，無法完全浸潤，且在加入氯化鈉后分層不明顯，當(dāng)水的加入量為5mL時則效果良好，因此，實驗選取乙腈+水（20 mL+5 mL）作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的選擇

實驗中考察了0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈、0.5%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈兩種流動相的分離效果，通過對比譜圖，發(fā)現(xiàn)0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈分離效果更好，峰形尖銳，對稱性好，靈敏度更高，故選擇0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈作為流動相,通過優(yōu)化洗脫梯度（見表1），二甲基黃、二乙基黃空白基質(zhì)加標(biāo)分離譜圖見圖1，空白樣品譜圖見圖2。

圖2 空白樣品總離子流色譜圖

2.3 線性范圍及檢出限

取基質(zhì)加標(biāo)對照工作液，依次進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，二甲基黃、二乙基黃在0.05～10 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.999）。取低濃度混合基質(zhì)加標(biāo)對照溶液（二甲基黃、二乙基黃質(zhì)量濃度約為0.05 μg/L）進樣，根據(jù)峰高計算信噪比為3時的檢測限和信噪比為 10時的定量限，計算得二甲基黃、二乙基黃的檢出限均為 0.2 μg/kg，定量限均為0.5 μg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗

取一豆干樣品，分別加入二甲基黃、二乙基黃混合對照品溶液，按0.5，5，10，50μg/kg水平加標(biāo)，每個水平平行檢測6份，測得二甲基黃回收率為90.0%～93.4%，RSD為0.5%～5.1%。二乙基黃回收率為84.6%～93.8%，RSD為1.1%～4.6%（見表3）。

2.5 方法驗證

在國家食品藥品監(jiān)督管理總局的組織下，有5家檢驗機構(gòu)對該方法進行了驗證，二甲基黃、二乙基黃在0.05～10μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.999）?；厥章式Y(jié)果顯示，二甲基黃0.5～50 μg/kg水平的加標(biāo)回收率為89.68%～90.61%，RSD為5.07%～10.94%，二乙基黃0.5～50μg/kg水平加標(biāo)回收率在83.66%～100.01 %，RSD為5.65%～9.87%。

3 結(jié)束語

本實驗考察了樣品的前處理方法，優(yōu)化了色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，建立了同時測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃的高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜（HPLCMS/MS）方法。所建方法二甲基黃、二乙基黃分離良好，兩對定性離子同時監(jiān)測有利于測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，能有效避免假陽性結(jié)果的發(fā)生。應(yīng)用建立的方法檢測國內(nèi)豆干和腐竹200批，均未檢出二甲基黃、二乙基黃。本檢測方法前處理快速、簡便，檢測靈敏度高，定性結(jié)果準(zhǔn)確。經(jīng)5家檢驗機構(gòu)驗證，該方法線關(guān)系r2＞0.999、回收率二甲基黃為89.68%～90.61%、二乙基黃為83.66%～100.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差二甲基黃為 5.07%～10.94%、二乙基黃為 5.65%～9.87%，檢出限兩者均為0.2 μg/kg。本方法線性范圍、回收率、精密度、檢出限等均能滿足檢測要求和質(zhì)量監(jiān)管需要，適用于豆制品中二甲基黃、二乙基黃的同時檢測。

[1]王春英，劉福德，王娟.對二氨基偶氮苯及其衍生物的合成與表征[J].天津理工大學(xué)學(xué)報，2010（6）：79-81.

[2]陳世驄，錢挹芬，甘品珍，等.取代（4-氨基-1-萘偶氮）苯和取代[4-（二乙氨基乙基氨基）-1-萘偶氮]苯類的合成[J].藥學(xué)學(xué)報，1966（1）：30-37.

[3]WANG Y P，ZHANG S，SUN S M，et al.Ultrafast dynamics of trans-4-diethylaminoazobenzene studied by femtosecond transient absorption spectroscopy[C]∥中國化學(xué)會.第29屆學(xué)術(shù)年會摘要集——第39分會：化學(xué)動力學(xué)0657.3.北京：中國化學(xué)會，2014：50.

[4]李北泉，徐曉利.二甲氨基偶氮苯誘發(fā)大白鼠肝癌形成過程中染色質(zhì)非組蛋白變化的觀察[J].中山醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1983（Z1）：1-9.

[5]WU Z Q，YANG S，LIAO W Y，et al.Novel amphiphilic fluorescent graft copolymer：synthesis，characterization and encapsulation of a hydrophobic agent[J].Chinese Journal of Polymer Science，2006（3）：315-321.

[6]王菡，儲曉剛，曹遠(yuǎn)銀.肉制品中非法添加色素的高效液相色譜快速檢測方法[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2011（135）：90-95.

[7]吳敏，林建忠，鄒偉，等.高效液相色譜法同時測定食品中對位紅和蘇丹色素等8種脂溶性染料[J].分析測試學(xué)報，2006，25（3）：74-76.

[8]韓勁松，徐明霞，陳湛.高效液相色譜法測定食品中蘇丹紅的研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6（7）：1245-1246.

[9]喻凌寒，宋之光，蘇流坤，等.高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用測定食品中7種蘇丹紅類染料[J].質(zhì)譜學(xué)報，2006（4）：221-225.

[10]MAZZOTTI F，DONNA L D，MAIUOLO L，et al.Assay of set all sudan azodye（I，II，III，IV and Para-Red）contaminating agents by liquid chromatography-tandam mass spectrometry and isotope dilution methodlogy[J].J Agric Food Chem，2007（56）：63-67.

[11]CALBIANIF，CAERI M，ELVIRI L，et al.Accurate mass measurements for the confirmation of Sudan azo-dyes in hot chilli products by capillary liquid chromatographyelectrospray tandem quadrupole orthogonal-acceleretion time of flight mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2004（1058）：127-135.

[12]張協(xié)光，曾泳艇，黎永樂.固相萃取-超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜同時測定食品中蘇丹橙G、二甲基黃、蘇丹黑B[J].廣東化工，2012，39（1）：109-110.

[13]廖梅東，杭義萍.GC-MS與HPLC/DAD聯(lián)用對紡織品中4-氨基偶氮苯的測定[J].分析測試學(xué)報，2010（8）：846-849.

（編輯：莫婕）

Simultaneous determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIN Qin1，HUANG Hongxia1，ZHANG Li2，YAN Heng2，LI Daoxia3，LIU Mei3，LI Xiaoyu4，HUANG Ying3
（1.Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430070，China；3.Sichuan Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610097，China；4.China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）

To establish a method for determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）. According to the optimization of extraction solvent and chromatographic conditions，the samples were extracted by acetonitrile and determined by HPLC-MS/MS using external standard method. Methyl yellow and ethyl yellow were separated completely within 3min.The linearity of methyl yellow and ethyl yellow was 0.05-10μg/L with correlation coefficients（r2）above 0.999.Recoveries ranged from 90.0%to 93.4%for methyl yellow at spiked levels ranging from 0.5μg/kg to 50μg/kg，and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 0.5%-5.1%.As for ethyl yellow，recoveries were 84.6%-93.8%at spiked levels ranging from 0.5 μg/kg to 50 μg/kg，and the RSDs were 1.1%-4.6%.The limits of detection were 0.2μg/kg.The method is rapid，simple，accurate and sensitive.It is suitable for determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products.

methyl yellow；ethyl yellow；HPLC-MS/MS；soy products

A

：1674-5124（2017）01-0055-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.01.012

2016-05-21；

：2016-07-18

林 欽（1970-），男，福建福州市人，高級工程師，博士，主要從事食品理化檢驗工作。

黃 瑛（1965-），女，陜西山陽縣人，主任藥師，碩士，主要從事食品安全標(biāo)準(zhǔn)研究。