劉 穎， 柳云恩， 劉學磊， 佟 周， 佟昌慈， 張玉彪， 施 琳， 叢培芳， 史秀云， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.急診醫(yī)學部；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

·創(chuàng)傷性休克·

創(chuàng)傷性休克對兔腎組織不同時相NGAL、Kim-1與HSP70表達影響

劉 穎1,2， 柳云恩1,2， 劉學磊1,2， 佟 周1,2， 佟昌慈1,2， 張玉彪1,2， 施 琳1,2， 叢培芳1,2， 史秀云1,2， 金紅旭1,2， 侯明曉1,2

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.急診醫(yī)學部；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

目的 探討創(chuàng)傷性休克對兔腎組織不同時相中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、腎損傷分子-1(Kim-1)與熱休克蛋白70(HSP70)表達的影響。方法 健康新西蘭大白兔30只，隨機分為對照組、0 h模型組、6 h模型組、12 h模型組和24 h模型組，每組6只。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)與實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)測定各組兔血液、尿液及腎組織中NGAL、Kim-1、HSP70的含量與mRNA的表達變化。結果 與對照組比較，模型組各時相血液及尿液中NGAL、Kim-1及HSP70含量均升高，6 h開始增加，24 h時有所恢復，但仍為高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組兔腎組織在不同時相NGAL、Kim-1及HSP70表達量均顯著升高，在6 h時升高最明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 NGAL、Kim-1、HSP70與創(chuàng)傷性休克導致腎損傷的發(fā)生和發(fā)展相關。監(jiān)測血液、尿液及腎組織中NGAL、Kim-1及HSP70的變化情況，有助于對創(chuàng)傷性休克導致腎損傷的判斷和治療。

創(chuàng)傷性休克； 腎損傷； 中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白； 腎損傷分子-1； 熱休克蛋白70

隨著社會的進步和經(jīng)濟的發(fā)展，交通肇事傷、自殺、職業(yè)傷等因創(chuàng)傷導致的死亡呈不斷上升趨勢[1]。嚴重的創(chuàng)傷往往伴有機體大量失血進而引起休克。創(chuàng)傷性休克發(fā)生時，患者有效微循環(huán)血容量急劇下降，進而導致機體發(fā)生一系列的損傷[2]。研究表明，創(chuàng)傷性休克患者死亡的首要原因為外傷直接導致重要臟器不可逆轉(zhuǎn)的損傷，尤其是腎組織[3]。目前，雖然進行了大量相關研究，但許多問題仍未解決，尤其是創(chuàng)傷性休克造成腎損傷的機制仍是當前研究的關鍵和難點之一[4]。關于創(chuàng)傷性休克致腎損傷的發(fā)病機制，組織低灌注、氧代謝障礙是最為經(jīng)典的理論，其他可能機制包括組織因子和彌散性血管內(nèi)凝血、細胞凋亡、全身性炎癥反應等[5-6]。中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、尿腎損傷分子-1(Kim-1)與熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)已被報道與多種腎疾病的發(fā)生、發(fā)展相關，但有關NGAL、Kim-1、HSP70在創(chuàng)傷性休克致腎損傷后的表達變化研究較少[7-9]。因此，本研究通過建立創(chuàng)傷性休克兔模型，分析創(chuàng)傷性休克致腎損傷后血液、尿液中NGAL、Kim-1、HSP70的變化，以及腎組織NGAL、Kim-1、HSP70mRNA的表達水平，為深入探討創(chuàng)傷性休克致腎損傷的診斷與救治提供理論基礎?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年健康新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體質(zhì)量(3.0±0.5)kg，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供，于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，食物及水由動物實驗中心提供，確保不含會對本實驗結果引起干擾的成分。實驗動物隨機分為對照組、0 h模型組、6 h模型組、12 h模型組和24 h模型組，每組各6只。

1.2 研究方法

1.2.1 創(chuàng)傷性休克模型建立 水合氯醛(0.49 mg/kg)與阿托品(0.03 mg/kg)腹腔注射麻醉。頸動脈置管并連接多道生理信號監(jiān)測儀，監(jiān)測動脈壓力等生理信息。在血壓、心率、平均動脈壓監(jiān)測下予2 500 g鐵陀垂直砸傷兔股骨，造成雙側(cè)股骨完全性骨折。30 min后，自頸動脈快速放血，直至平均動脈壓降至30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的休克水平。維持60 min后，進行液體復蘇。5 min內(nèi)快速回輸全血，并輸注等量5%葡萄糖生理鹽水，兔蘇醒后可自由飲水進食。

1.2.2 腎組織病理觀察 各組均取左側(cè)腎相同部位標本，置入10%多聚甲醛溶液中固定24 h，脫水、透明，常規(guī)石蠟包埋切片行HE染色，光學顯微鏡觀察動物腎病理組織形態(tài)學變化。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測 應用NGAL、Kim-1及HSP70試劑盒(美國R&D公司)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組兔血液及尿液NGAL、Kim-1、HSP70的表達量。將標準品按0～500 ng/L倍比稀釋8份，尿液樣本編號并稀釋，每孔加樣50 ml。按照試劑盒說明書進行后續(xù)操作，反應中止后于波長450 nm的酶標儀上讀取各孔的光密度(D)值。根據(jù)8個標準品的濃度及D值畫出以D值為縱坐標，分別以NGAL、Kim-1及HSP70濃度為橫坐標的曲線圖，根據(jù)各樣本的D值查找對應的濃度范圍。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測 蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測各組兔腎組織中NGAL、Kim-1及HSP70蛋白的表達變化。將蛋白樣品加入相應比例的十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠上樣緩沖液(6×Loading Buffer)，煮沸變性5 min，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，然后將膜移至5%的脫脂奶粉PBST緩沖液室溫封閉1 h，PBST洗膜3次。加入一抗4℃孵育過夜。用PBST 洗膜3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。洗膜3次，暗室顯影。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)檢測各組兔腎組織中NGAL、Kim-1及HSP70 mRNA的表達變化。取2.0 μg總RNA，65℃變性5 min，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，合成cDNA。取cDNA產(chǎn)物5 μl,依次加入10×PCR緩沖液(上、下游引物各50 pmol)、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、TaqDNA poly-merase 1 U，以下列條件進行擴增：94℃ 3 min,94℃ 45 s，50℃ 45 s(NGAL),52℃ 45 s(Kim-1),55℃ 45 s(HSP70)，55℃ 45 s(β-actin)，72℃ 45 s。進行30次循環(huán)后，進一步延伸，72℃ 5 min。根據(jù)基因庫中序列，用引物設計軟件Primer 5設計特異性引物。見表1。

表1 特異性引物序列

2 結果

2.1 腎組織病理觀察 鏡下觀察，對照組兔腎組織腎間質(zhì)無充血，腎小管邊界清晰，管腔內(nèi)無脫落細胞(圖1a)；模型組兔腎組織則可以看見明顯的腎組織水腫，腎小管擴張，上皮細胞變性壞死脫落(圖1b)。結果表明，創(chuàng)傷性休克可致腎損傷模型腎組織病理改變。

圖1 腎組織病理觀察(HE染色×400；a.對照組；b.模型組)

2.2 血液與尿液中NGAL、Kim-1及HSP70檢測 結果表明，與對照組比較，創(chuàng)傷性休克模型組各時相血液與尿液中NGAL、Kim-1及HSP70的表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，NGAL及HSP70在6 h開始顯著增高，24 h時有所恢復。Kim-1的表達6 h開始升高，12 h達到最高。見表2、3。

表2 血清中NGAL、Kim-1及HSP70表達變化

表3 尿液中NGAL、Kim-1及HSP70表達變化

2.3 Western blot檢測 結果顯示，與對照組比較，模型組腎組織在不同時相NGAL、Kim-1及HSP70表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，NGAL、Kim-1及HSP70在6 h升高最明顯。見圖2、表4。

圖2 Western blot檢測結果

表4 腎組織NGAL、Kim-1及HSP70表達量

2.4 RT-PCR檢測 結果顯示，與對照組比較，模型組腎組織在不同時相NGAL、Kim-1及HSP70mRNA表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，NGAL、Kim-1及HSP70在6 h升高最明顯。見圖3。

圖3 RT-PCR檢測結果(與對照組比較，①P<0.05)

3 討論

創(chuàng)傷造成的急性應激狀態(tài)、全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，進而造成的重要臟器不可逆轉(zhuǎn)的損傷，已成為創(chuàng)傷性休克患者死亡的首要原因。創(chuàng)傷性休克致腎損傷已得到越來越廣泛的關注[10-11]。

NGAL作為損傷急性期反應蛋白，在腎缺血再灌注所引起的腎小管損傷及其他原因引起的腎近曲小管細胞損傷后的高度表達已被報道[12]。此外，慢性腎病的發(fā)生也能夠?qū)е翹GAL水平顯著升高[13]。NGAL在創(chuàng)傷性休克致腎損傷時，表達情況可能與患者長期處于微炎癥狀態(tài)有關。NGAL能夠誘導腎小管間質(zhì)中浸潤的中性粒細胞發(fā)生凋亡，以保護腎組織免于炎性細胞損害[14-15]。在創(chuàng)傷性休克致腎損傷模型中，能夠明顯檢測到NGAL表達的變化，說明NGAL可為創(chuàng)傷性休克致腎損傷的敏感性和特異性較高的生物標記物。

Kim-1是一種正常成人腎中微弱表達的跨膜蛋白質(zhì)，由334個氨基酸殘基組成，首先被Ichimura等[16]在大鼠的腎組織中發(fā)現(xiàn)。Kim-1是受損近曲小管上皮細胞表達的黏附分子，在缺血及腎毒性損傷后，近曲小管上皮細胞中呈高表達狀態(tài)[17]。據(jù)報道，Kim-1能夠參與腎小管上皮細胞的早期損傷與修復，清除凋亡細胞和壞死細胞碎片，參與腎間質(zhì)纖維化、黏附功能、信號轉(zhuǎn)導功能、免疫反應等多個過程，有利于腎小管上皮細胞的再生及小管重構[18]。研究顯示，在評估腎早期損傷中，Kim-1因其較高的敏感度、特異度而存在一定優(yōu)勢，但目前有關Kim-1在創(chuàng)傷性休克致腎損傷不同時相表達的研究較少[19]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性休克致腎損傷后6 h，Kim-1的表達顯著升高，到24 h雖已下降，但與正常對照組比較仍顯著升高，與既往報道的腎相關疾病發(fā)生時體內(nèi)Kim-1表達情況相一致[20]。因此，檢測Kim-1水平可間接評價腎組織，特別是腎小管損傷情況。

HSP70是一種應激狀態(tài)時表達增高的保護性蛋白質(zhì)，廣泛存在、結構保守[21]。HSP70可通過其分子伴侶作用，幫助蛋白質(zhì)折疊及移位、防止蛋白質(zhì)聚集、幫助變性蛋白質(zhì)的解聚及復性、促進嚴重受損蛋白質(zhì)的降解等。從而保護組織或細胞不受或少受傷害，在細胞保護中發(fā)揮重要的作用，是細胞生理狀態(tài)下所必需[22-23]。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，HSP70表達增加后，亦可抑制細胞凋亡發(fā)生，對維護細胞的正常功能與生存具有重要作用[24]。

本研究對創(chuàng)傷性休克致腎損傷后不同時間點NGAL、Kim-1及HSP70的表達情況進行分析。Western blot結果表明，創(chuàng)傷性休克致腎損傷6 h后，兔腎組織中NGAL、Kim-1及HSP70的表達顯著增加，隨后有所恢復，但仍為高表達。血液、尿液及RT-PCR檢測結果同樣證明NGAL、Kim-1及HSP70在創(chuàng)傷性休克致腎損傷中異常表達情況。早期創(chuàng)傷性休克致腎損傷后，大量炎性因子的釋放能夠引起腎小管上皮細胞損傷。NGAL、Kim-1及HSP70的高表達，可能與創(chuàng)傷性休克引起早期腎組織病理性改變，恢復受損的腎小管上皮細胞有關[25-26]。

綜上所述，NGAL、Kim-1及HSP70可作為創(chuàng)傷性休克致腎損傷的生物標志物，監(jiān)測NGAL、Kim-1及HSP70的變化，可了解疾病的發(fā)展過程，對評估疾病嚴重程度及實施干預治療可有重要的臨床意義。

[1] Wolf SJ,Bebarta VS,Bonnett CJ,et al.Blast injuries[J].Lancet,2009,374(9687):405-415.

[2] 劉 洋,王 剛.創(chuàng)傷性休克復蘇后臟器缺血/再灌注損傷的實驗研究[J].遼寧醫(yī)學雜志,2007,6(21):366-368.

[3] 林明強,呂有凱,王日興.曲美他嗪配合常規(guī)抗休克方案治療休克時改善腎功能的作用分析[J].臨床急診雜志,2016,2(17):121-127.

[4] Chertow GM,Burdick E,Honour M,et al.Acute kidney injury,mortality,length of stay,and costs in hospitalized patients[J].J Am Soc Nephml,2005,10(2):3365-3370.

[5] Spinella PC,Holcomb JB.Resuscitation and transfusion principles for traumatic hemorrhagic shock[J].Blood Rev,2009,23(6):231-240.

[6] 劉泮力，崔東清.參附注射液對創(chuàng)傷失血性休克患者凝血功能和炎性因子的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2016,25(10):1120-1122.

[7] Mishra J,Dent C,Tarabishi R,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery[J].Lancet,2005,365(9466):1231-1238.

[8] Vaidya VS,Ramirez V,Ichimura T,et al.Urinary kidney injury molecule-1:a sensitivequantitative biomarker for early detection of kidney tubular injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,290(2):F517-F529.

[9] 孫玲娣,趙 浦,張鴻雁,等.HSP70 在缺血再灌注大鼠腎臟中的表達及意義[J].中國小兒急救醫(yī)學,2006,13(4):349-351.

[10] 王 瑋.嚴重創(chuàng)傷性休克患者的急診護理與并發(fā)癥預防措施[J].臨床醫(yī)學,2011,6(24):3782-3783.

[11] Wolfgang G,Shawn G,Sandro B,et al.Resuscitation of traumatic hemorrhagic shock patients with hypertonic saline-without dextraninhibits neutrophil and endothelial cell activation[J].Shock,2012,38(4):341-350.

[12] Sirota JC,Walcher A,Faubel S,et al.Urine IL-18,NGAL,IL-8 and serum IL-8 arebiomarkers of acute kidney injury following liver transplantation[J].BMC Nephrol,2013,14:17-23.

[13] Mishra J,Ma Q,Prada A,et al.Identification of neutrophil gelatinase-associatedlipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury[J].Am J SocNephrol,2003,14(10):2534-2543.

[14] 陳世民,葛 菲.創(chuàng)傷性休克與全身性炎癥反應[J].中國病理生理雜志,2003,19(4):567-571.

[15] Prabhu A,Sujatha DI,Ninan B,et al.Neutrophil gelatinase associatedlipocalin as a biomarker for acute kidney injury in patients undergoing coronary arterybypass grafting with cardiopulmonary bypass[J].Ann Vasc Surg,2010,24:525-531.

[16] Ichimura T,Bonventre JV,Bailly V,et al.Kidney injury molecule-1(KIM-1),a putativeepithelial cell adhesion molecule containing a novel immunoglobulin domain,isup-regulated in renal cells after injury[J].J Bio Chem,1998,273(7):4135-4142.

[17] Han WK,Bailly V,Abichandani R,et al.Kidney InjuryMolecule-l(KIM-l):a novel biomarker for human renal proimal tubule injury[J].Kidney Int,2002,62(1):237-244.

[18] Ichimura T,Bonventre JV,Bailly V,et al.Kidney injury molecule-l(KIM-l),a pulativeepithelial ceell adhesion molecule containing a novel innnunoglobulin domain,is upregulated in renal cells after injury[J].J Biol Chem,1998,273(7):4135-4142.

[19] Han WK,Waikar SS,Johnson A,et al.Urinary biomarkers in the early diagnosis ofacute kidney injury[J].Kidney Int,2008,73(7):863-869.

[20] Van Timmeren MM,van den Heuvel MC,Bailly V,et al.Tubular kidney injurymolecule-1(KIM-1)in human renal disease[J].J Pathol,2007,212(2):209-217.

[21] 張鴻彥,趙達亞,孫玲娣.環(huán)胞霉素誘導急性腎損傷大鼠腎臟熱休克蛋白70的表達[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,2007,41(2):136-139.

[22] 丁 弘,劉殿閣.不同類型熱休克蛋白在腎臟疾病中作用[J].臨床薈萃,2008,23(18):1366-1367.

[23] Kang KJ.Mechanism of hepatic ischemia-reperfusion injury and protectionagainst reperfusion injury[J].Tansplant Proc,2005,34(7):2659-2661.

[24] Wells AD,Malkovsky M.Heat shock proteins,tumor immunogenicity and antigen prescentation:an integrated view[J].Immunol Today,2000,21(3):129-132.

[25] Malhotra R,Siew ED.Biomarkers for the early detection and prognosis of acute kidney injury[J].Clin J Am Soc Nephrol,2017,12(1):149-173.

[26] Devarajan P.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL):a new marker of kidney disease[J].Scand J Clin Lab Invest Suppl,2008,241:89-94.

Traumatic shock on the expression of NGAL,Kim-1 and HSP70 in renal tissue of rabbits

LIU Ying,LIU Yun-en,LIU Xue-lei,TONG Zhou,TONG Chang-ci,ZHANG Yu-biao,SHI Lin,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao
(Department of Emergency Medicine,Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the expression of neutrophil gelatinase associated lipocal(NGAL),kidney injury molecule-1(Kim-1),heat shock protein 70(HSP70)in rabbit at different time points after traumatic shock were studied to explore their possible role.Methods A total of 30 healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into control group,0 hour model group,6 hours model group,12 hours model group and 24 hours model group.ELISA,Western blot and Real-time PCR were used to detect the change and expression of NGAL,Kim-1,HSP70 and their mRNA in blood,urine and nephridial tissue.Results Compared with control group,the expression of NGAL,Kim-1 and HSP70 in blood and urine 6 hours increased after the traumatic shock,and then recovered at 24 hours,was still in the high expression(P<0.05).The expression of NGAL,Kim-1 and HSP70 tissues and mRNA expression in nephridial tissue of modeling groups of rabbits were also significantly elevated,and reached the highest in 6 hours(P<0.05).Conclusion Kim-1 and HSP70 are related to the occurrence and development NGAL of kidney injury in traumatic shock;monitoring the change of NGAL,Kim - 1,and HSP70 in blood,urine and nephridial tissue will help to the carry out judgment and treatment of kidney injury in traumatic shock.

Traumatic shock; Kidney injury; Neutrophil gelatinase associated lipocal; Kidney injury molecule-1; Heat shock protein 70

2013年遼寧省科技攻關(2013225089)；2012年全軍十二五面上項目(CSY12J002)

劉 穎(1990-)，女，遼寧鐵嶺人，技師，碩士

金紅旭，E-mail：hongxuj@126.com；侯明曉，E-mail:houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)01-0013-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.01.04

2016-11-21