郭莎莎，溫思鈺，喬亞琪，武懿茂，段杰，李紅英

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西太谷030801）

谷子BAS1基因生物信息學(xué)分析及其在干旱脅迫下的表達分析

郭莎莎1，溫思鈺1，喬亞琪1，武懿茂1，段杰1，李紅英2，3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西太谷030801）

BAS1是一種過氧化物酶，廣泛存在于植物中，具有清除生物體內(nèi)ROS、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和分子伴侶的功能，在鹽脅迫、光氧化、干旱及低溫脅迫等方面起著重要的作用。通過生物信息學(xué)分析了谷子中的8個SiBAS1基因，并與近緣種高粱中SiBAS1基因進行親緣關(guān)系比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高粱和谷子的SiBAS1基因家族同源性極高；對谷子SiBAS1基因進行啟動子分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，很多與干旱脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件包括干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點MBS、低溫響應(yīng)元件LTR、熱響應(yīng)元件HSE、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件Box-W1、乙烯響應(yīng)元件ERE、赤霉素響應(yīng)元件P-box、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE等；通過對勾勾母雞咀（GG，耐干旱品種）和晉汾16（JF16，干旱敏感品種）的SiBAS1基因轉(zhuǎn)錄組表達情況的分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下不同品種中同一SiBAS1基因的表達水平不同，且差異較大。其結(jié)果可為深入研究SiBAS1基因與谷子抗旱性的關(guān)系提供依據(jù)，且有助于SiBAS1基因?qū)Ω珊档捻憫?yīng)機制及作用機制的后續(xù)研究。

谷子；BAS1；干旱脅迫；抗旱性

谷子（Setaria italica）古稱粟，去皮即小米，是禾本科黍族狗尾草屬1年生草本植物，是我國北方主要的糧食作物之一[1]。谷子在我國分布廣泛，幾乎全國都有種植，但目前其產(chǎn)區(qū)主要分布在北方各省的干旱、半干旱地區(qū)[2]。有研究表明，近50 a來，東北、華北大部、西北東部降水量明顯減少，干旱化趨勢非常突出[3]。由于谷子主產(chǎn)區(qū)降水量逐年下降，干旱逐漸成為作物產(chǎn)量的主要限制因素。隨著人們對小米的了解逐漸加深，對小米的需求不斷增加，而谷子產(chǎn)量卻受到高溫、低溫、干旱等不良環(huán)境因素的極大影響，導(dǎo)致供給與需求之間存在很大差距。因此，研究谷子抗逆機制顯得尤為重要。

植物體內(nèi)的2-cys過氧化物酶被稱為BAS1[4]，是過氧化蛋白（Prxs）的一種。第1個被發(fā)現(xiàn)并被確定的Prxs是巰基特異性抗氧化蛋白thiol-specific antiorident protein（TSA），其能夠保護酵母和哺乳動物的谷胱甘肽合成酶與DNA的完整性[5-6]。根據(jù)Cys殘基數(shù)目和位置的不同，將Prxs分為6種亞型（PrxsⅠ～Ⅵ），這6種亞型又可分為3個亞類[7]（2-Cys Prxs、非典型2-Cys Prxs和1-Cys Prxs）。其中，2-Cys Prxs具有清除生物體內(nèi)ROS、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[8-10]和分子伴侶[11-12]的功能。

2-cys過氧化物酶在生物體內(nèi)普遍存在，已有研究重組大麥、大白菜、豌豆、油菜和水稻BAS1的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小球藻、擬南芥和大麥BAS1在鹽、光氧化、干旱及低溫脅迫中參與去除活性氧毒性、抗氧化防御及氧化還原信號傳導(dǎo)，這種功能多樣性與BAS1的分子組成、亞細胞分布、組織特異性和脅迫因子有關(guān)[13]。然而，有關(guān)谷子SiBAS1基因家族的研究鮮見報道，谷子抗旱基因的研究也相對較少。

本研究就谷子中SiBAS1基因進行分析，并分析勾勾母雞咀（GG，耐干旱品種）和晉汾16（JF16，干旱敏感品種）在PEG干旱脅迫下BAS1基因的表達情況，旨在研究谷子SiBAS1基因是否參與谷子對干旱逆境的脅迫應(yīng)答，為進一步弄清谷子抗旱機制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

供試材料勾勾母雞咀和晉汾16由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供[14]。

1.2 研究方法

1.2.1 谷子BAS1基因的生物學(xué)分析利用網(wǎng)站Phytozome v 11.0中谷子、高粱、擬南芥、水稻、谷子基因組數(shù)據(jù)（https://phytozome.jg i.doe.gov/pz/portal. html）進行關(guān)鍵詞搜索，進一步結(jié)合NCBI，GenBank等網(wǎng)站獲取BAS1基因的信息，并下載整理[15]。

使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）在線分析啟動子元件。使用MEGA 7.0軟件中的Neibor-joining算法對下載的谷子BAS1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Multalin（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）進行在線雙序列比對。

1.2.2 干旱情況下谷子BAS1基因的表達情況分析GG和JF16在人工氣候室中培養(yǎng)，采用營養(yǎng)土∶蛭石為3∶1的混合土種植，培養(yǎng)條件為：14 h光照28℃/10 h黑暗23℃，相對濕度為50%左右，光強為500 μmol/（m2·s）。出苗后2 d澆一次蒸餾水，培養(yǎng)21 d后，采用20%PEG-6000模擬干旱，處理材料0.5 h；對照用蒸餾水處理相同時間。每個處理取3株用于RNA的提取，并進行表達譜測序[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子BAS1基因的基本信息

利用網(wǎng)站Phytozome v11.0中谷子、高粱、擬南芥、水稻基因組數(shù)據(jù)進行關(guān)鍵詞搜索，結(jié)合NCBI網(wǎng)站獲取以上4種作物的部分BAS1的氨基酸序列共27個（其中，谷子有8個，高粱有11個，擬南芥有3個，水稻有5個），并制作了親緣關(guān)系分布圖（圖1）。然后取與谷子BAS1基因親緣關(guān)系最近的其他作物氨基酸序列進行雙序列比對。

按照上述方法從谷子基因組中鑒定了8個SiBAS1基因，根據(jù)與高粱BAS1基因的同源性，暫時命名為SiBAS1-1～SiBAS1-8。從圖1可以觀察到各基因起源與進化間的關(guān)系，所有BAS1基因被分為3組，谷子BAS1基因分布在3個不同的組中，Ⅰ組中包含SiBAS1-1，SiBAS1-2，SiBAS1-4和SiBAS1-6；Ⅱ組中包含SiBAS1-3和SiBAS1-5；Ⅲ組中包含SiBAS1-7和SiBAS1-8。在每組中還存在著平行同源性基因?qū)?。根?jù)雙序列比對圖得出，SiBAS1-1基因與Sobic.004G086400.1基因，SiBAS1-2基因與Sobic.010G182966.1基因，SiBAS1-6基因與Sobic.002G398600.1基因（圖2），SiBAS1-4基因與Sobic.002G398600.1基因的氨基酸序列相似性極高，也表明谷子的BAS1可能與高粱的BAS1基因同源性極高。

表1 谷子BAS1基因的基本信息

由表1可知，SiBAS1-2基因和SiBAS1-3基因在第4染色體上，SiBAS1-1基因、SiBAS1-5基因、SiBAS1-7基因和SiBAS1-8基因在第1染色體上，SiBAS1-4基因在第2染色體上，SiBAS1-6基因在第5染色體上。

谷子BAS1基因家族中不同BAS1基因的內(nèi)含子數(shù)目、大小都存在差異（表1）。8個SiBAS1基因中，SiBAS1-4基因和SiBAS1-5基因均含有1個內(nèi)含子，SiBAS1-3基因含2個內(nèi)含子，SiBAS1-7基因和SiBAS1-8基因均含有6個內(nèi)含子，SiBAS1-1基因、SiBAS1-2基因和SiBAS1-6基因均含有4個內(nèi)含子。

2.2 谷子BAS1基因家族啟動子元件

根據(jù)谷子的全基因組序列，選取CDS區(qū)上游3 000 bp的核苷酸序列作為啟動子，用PlantCARE進行在線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了基本啟動子元件TATA-box和CAAT-box外，谷子BAS1基因還含有很多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，包括脫落酸響應(yīng)元件ABRE、干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點MBS、熱響應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、光響應(yīng)元件light等（表2）。

表2 啟動子順式元件個

利用PlantCARE在線分析8個谷子SiBAS1基因啟動子上游3 000 bp的順式作用元件，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，每個基因含有至少130個調(diào)控元件，最少的是SiBAS1-5基因，含有133個順式作用元件。調(diào)控SiBAS1-2基因的順式作用元件最多，高達167個。在SiBAS1-4中，與病蟲害脅迫相關(guān)的茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif多達14個，是家族成員中最多的。有7個BAS1基因家族成員包含2～9個脫落酸響應(yīng)元件ABRE，其中，SiBAS1-2基因和SiBAS1-3基因均含有9個；SiBAS1-6基因沒有脫落酸響應(yīng)元件ABRE。BAS1家族成員包含1～5個干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點MBS，其中，SiBAS1-3基因和SiBAS1-4基因均含有5個。7個谷子BAS1基因家族成員中都包含30個以上的光響應(yīng)調(diào)控元件，其中，SiBAS1-2基因最多，高達57個。

2.3 谷子BAS1基因在干旱脅迫下的表達情況

對耐干旱品種勾勾母雞咀（GG）和干旱敏感品種晉汾16（JF16）分別進行模擬干旱脅迫處理，使2個品種的處理組（Drought）和對照組（CK）中BAS1基因進行表達，并對表達情況進行分析，結(jié)果表明，2個品種的SiBAS1-5基因在正常情況（CK）下的表達量都明顯高于各自在干旱脅迫情況（Drought）下的表達量，而且耐干旱品種GG在正常情況下表達量較高，但在干旱脅迫下表達量卻顯著下調(diào)（圖3）。

2個品種的SiBAS1-7基因在干旱脅迫情況（Drought）下的表達量都明顯高于各自在正常情況（CK）下的表達量，而且JF16品種的2種情況下的基因表達水平高于GG品種2種情況下基因表達水平。耐干旱品種GG的SiBAS1-7基因在正常情況下幾乎不表達，而在干旱脅迫下表達量顯著上調(diào)（圖3）。

干旱敏感品種JF16的SiBAS1-3基因在正常情況（CK）下的表達量顯著高于其在干旱脅迫情況（Drought）下的表達量；此基因在干旱脅迫情況（Drought）下的表達量顯著下降，且在干旱脅迫下幾乎不表達（圖3）。

3 討論與結(jié)論

BAS1是植物抗逆的重要物質(zhì)，廣泛存在于植物基因組中。通過對谷子SiBAS1基因組的分析，有利于我們了解SiBAS1基因基本特征及功能，對后續(xù)研究具有重要意義。

谷子BAS1基因在谷子基因組中呈不均勻分布，集中分布在第1，2，4，6染色體上。BAS1系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，谷子、高粱、擬南芥、水稻4種植物的BAS1家族可以分為3組，在每組中還存在著平行同源性基因?qū)?，其中，SiBAS1-6基因與Sobic. 002G398600.1基因的同源性最高。

通過對谷子SiBAS1基因啟動子上游約3000bp進行啟動子分析，發(fā)現(xiàn)其中含有多個與逆境相關(guān)的順式作用元件，包括低溫響應(yīng)元件LTR、熱響應(yīng)元件HSE、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件Box-W1、干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點MBS、乙烯響應(yīng)元件ERE、赤霉素響應(yīng)元件P-box、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE等。這些結(jié)果表明，BAS1基因可能正是通過這些順式作用元件參與了谷子對脅迫信號傳導(dǎo)途徑的應(yīng)答,在植物響應(yīng)脅迫過程中發(fā)揮作用。

通過對谷子3個SiBAS1基因的表達情況分析發(fā)現(xiàn)，耐干旱品種GC的SiBAS1-7基因在正常情況下幾乎不表達，而且在干旱脅迫下表達量顯著上調(diào)；而且此基因在干旱脅迫下干旱敏感品種JF16中表達量也增加，說明該基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)，只是在不同品種中對干旱的響應(yīng)程度不同；2個品種的SiBAS1-7基因在干旱脅迫下均高表達，是否意味著它在谷子抗旱中的重要性，還值得更詳細和深入的研究。耐干旱品種GG和干旱敏感品種JF16的SiBAS1-5基因在干旱脅迫情況下表達量均下降，且耐干旱品種GC表達量下調(diào)明顯，說明該基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)，且在2個品種中不具有表達特異性；干旱敏感品種JF16的SiBAS1-3基因在干旱脅迫情況下的表達量顯著下降，表明此基因可能與干旱脅迫有關(guān)。

結(jié)合啟動子順式調(diào)控元件的預(yù)測結(jié)果分析，并未找出脅迫相關(guān)的調(diào)控元件與BAS1基因表達之間的關(guān)聯(lián)。我們推測，可能有5個原因：一是同一基因在不同組織中的表達水平不同；二是SiBAS1基因的表達非常復(fù)雜，不僅會受其他外界條件的調(diào)控如光、溫度等，還會受內(nèi)部因素的誘導(dǎo)如內(nèi)源植物激素的影響；三是各種逆境之間存在信號交叉，并非所有BAS1都只與干旱脅迫相關(guān)，如在擬南芥的葉片生長中，BAS1能夠保護光合組織免遭氧化脅迫[16]；四是在谷子的不同生育期，GG和JF16的抗旱性也有差別，如在孕穗期GG抗旱性較JF16強，但在灌漿期JF16抗旱性較GG強[14]；五是SiBAS1基因家族各成員的表達模式可能不盡相同，這與SiBAS1基因參與逆境應(yīng)答調(diào)控的信號途徑不同有一定的關(guān)系。

綜合以上分析，初步研究表明谷子BAS1家族中部分SiBAS1基因受干旱的強烈誘導(dǎo)，因此推斷谷子中一些SiBAS1基因可能參與谷子對干旱逆境的脅迫應(yīng)答。目前，還不清楚SiBAS1基因的具體功能，而且其在谷子中的作用機制也不清楚，因此，要解決這一系列的困惑，仍需對進化樹中垂直同源、平行同源基因?qū)χ谢虻木唧w功能與作用機制進行更深入的研究。

［1］李蔭梅.谷子作物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

［2］山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院.中國谷子栽培學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1987.

［3］鄧振鏞，王強，張強，等.中國北方氣候暖干化對糧食作物的影響及應(yīng)對措施[J].生態(tài)學(xué)報，2010，30（22）：6278-6288.

［4］周偉輝，薛大偉，張國平.高溫脅迫下水稻葉片的蛋白響應(yīng)及其基因型和生育期差異[J].作物學(xué)報，2011，37（5）：820-831.

［5］KIMK，KIMI H，LEE K Y，et al.The isolation and purification of a specific"protector"protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe（Ⅲ）/O2mixed-function oxidation system[J].Journal ofBiological Chemistry，1988，263（10）：4704-4711.

［6］CHANG T S，JEONG W，CHOI S Y，et al.Regulation of peroxiredoxinsⅠactivity by cdc2-mediated phosphorylation[J].Journal of Biological Chemistry，2002，227（28）：25370-25376.

［7］程雷，王蕾蕾，程備久，等.玉米過氧化物還原蛋白BAS1的原核表達及其功能研究[J].中國生物工程雜志，2010，30（11）：24-29.

［8］CHANG T S，CHO C S，PARK S，et al.PeroxiredoxinⅢ，a mitochondrion-specific peroxidase，regulates apoptotic signaling by mitochondria[J].Journal of Biological Chemistry，2004，279（40）：41975-41984.

［9］NONN L，BERGGREN M，POWIS G.Increased expression of mitochondrial peroxiredoxin-3（thioredoxin peroxidase-2）protects cancer cells against hypoxia and drug-induced hydrogen peroxide-dependent apoptosis[J].Molecular Cancer Research，2003，1（9）：682-689.

［10］PETERSONT M，LUCKHART S.A mosquito2-Cys peroxiredoxin protects against nitrosative and oxidative stresses associated with malaria parasite infection[J].Free Radical Biology and Medicine，2006，40（6）：1067-1082.

［11］NOH D Y，AHN S J，LEE R A，et al.Overexpression of peroxiredoxin in human breast cancer[J].Anticancer Research，2001，21（3B）：2085-2090.

［12］YANAGAWA T，ISHIKAWA T，ISHII T，et al.PeroxiredoxinⅠexpression in human thyroid tumors[J].Cancer Letters，1999，145（1/2）：127-132.

［13］TRIPATHI B N，BHAT T I，DIETZ K J.Peroxiredoxins a less studied component of hydrogen peroxide detoxification in photosynthetic organisms[J].Protoplasma，2009，235（1/4）：3-15.

［14］張雁明.不同谷子品種抗旱性比較及干旱相關(guān)基因表達分析[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［15］李昊陽，施楊，丁亞娜，等.楊樹擴展蛋白基因家族的生物信息學(xué)分析[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，36（2）：59-67.

［16］BAIER M，DIETZKJ.Protective function ofchloroplast 2-cysteine peroxiredoxin in photosynthesis:evidence from transgenic Arabidopsis[J].Plant Physiology，1999，119：1407-1414.

Bioinformatics Analysis ofBAS1Genes from Foxtail Millet（Setaria italica（L.）Beauv.）and Its Expression under Drought Stress

GUOShasha1，WENSiyu1，QIAOYaqi1，WUYimao1，DUANJie1，LI Hongying2，3
（1.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.KeyLabaratoryofCrop Gene Resources and GermplamEnhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofAgricultural Bioengineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

BAS1 is a kind of peroxiredoxin in plant,which is widely distributed in almost every plant genome.BAS1 can remove ROS,which plays a vital role in the varies of aspects,such as the salt stress,light oxidation,drought and low temperature stresses,etc. This paper analysed eight SiBAS1 gene offoxtail millet through bioinformatics,and compared their relationship between SiBAS1 genes in sorghum.The results showed that foxtail mille was high homologous with sorghum.And analysed SiBAS1 genes promoter,and the result found that many was elements related to drought stress response including drought response MYB binding sites of MBS,lowtemperature response element LTR,thermal response element HSE,fungus induced response element Box-W1,ethylene response elements ERE, gibberellin response element P-box,salicylic acid response element TCA-element and abscisic acid response element ABRE,etc.And analysed GG（drought resistant varieties）and JF16（drought sensitive cultivars）peroxide protease gene expression,and the result found that for one SiBAS1 gene,its expression level was different in different varieties under drought stress.These results not only provide a foundation for the further study of the relationship between SiBAS1 gene and millet drought resistance,but also are helpful for further research on the response mechanismofthe SiBAS1 gene todrought.

foxtail millet;BAS1;drought stress;drought-resistance

S515

A文獻標識碼：1002-2481（2017）02-0151-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.01

2016-09-13

國家自然科學(xué)基金項目（31471556）；地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2015082）

郭莎莎（1993-），女，山西長治人，在讀本科，研究方向：作物遺傳。李紅英為通信作者。