鞏 凡，王立峰，程鎖利，高 俊，馬 峰，汪玉海，趙 飛

·論 著·

不同劑量地塞米松對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂聯(lián)素及PPARγ-2表達(dá)影響的研究

鞏 凡，王立峰，程鎖利，高 俊，馬 峰，汪玉海，趙 飛

目的 觀察不同劑量地塞米松對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中脂聯(lián)素、過氧化物酶增殖物激活受體γ-2(PPARγ-2)的影響，探索糖皮質(zhì)激素對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中脂肪代謝的影響。方法 用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分為空白組、成脂細(xì)胞分化組、地塞米松組;將地塞米松組再分為：10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組。分別培養(yǎng)1、3、7、9 d取材，進行脂聯(lián)素、PPARγ-2、堿性磷酸酶、甘油三酯的檢測。結(jié)果 不同濃度地塞米松對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有不同的影響，在10-8mol/L組、10-7mol/L組，具有一定的成骨作用。但隨著地塞米松濃度的增加，脂聯(lián)素的表達(dá)逐漸減少、PPARγ-2的表達(dá)逐漸增多。結(jié)論 地塞米松的濃度對脂聯(lián)素、PPARγ-2的表達(dá)具有影響，并影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；地塞米松；脂聯(lián)素；PPARγ-2

在人體的骨組織中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可以根據(jù)人體的各種需要向多種細(xì)胞分化，是人體重要的干細(xì)胞之一。然而有文獻研究表明糖皮質(zhì)激素對于BMSCs的生長及活性具有一定的影響[1]，現(xiàn)在已經(jīng)證實糖皮質(zhì)激素對于BMSCs具有誘導(dǎo)分化的作用。多年的臨床觀察已經(jīng)明確，糖皮質(zhì)激素作為股骨頭缺血性壞死的致病因素之一已經(jīng)被廣泛的科研人員接受，然而其致病原因至今仍沒有一個定論，在眾多的理論中，骨髓中脂肪代謝紊亂是其中重要的理論之一。脂聯(lián)素是一種脂肪源性的細(xì)胞因子，近年的實驗已經(jīng)表明，脂聯(lián)素與骨代謝有著密切關(guān)系。脂聯(lián)素在人體內(nèi)含量豐富，其中血清中的濃度較高。已經(jīng)有實驗表明脂聯(lián)素直接影響成骨和破骨細(xì)胞的增殖與分化，與骨的重建存在著一定的相關(guān)性。過氧化物酶增殖物激活受體(PPARs)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是脂代謝中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一[2]。在沒有PPARγ的時候，前脂肪細(xì)胞很難分化為脂肪細(xì)胞，大部分PPARγ的目標(biāo)基因都直接或間接參與脂肪的合成途徑。本實驗希望通過在不同濃度糖皮質(zhì)激素中人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素及PPARγ-2的差異，探討糖皮質(zhì)激素對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (美國sciencell)；地塞米松(Sigma)公司；間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基(Hyclone)；油紅O；O’YMPUS IX71倒置顯微鏡)；Trizol 試劑盒、RT-PCR試劑盒(Invitrogen 公司，美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞計P0代生長融合達(dá)90%時，吸出原培養(yǎng)基，PBS沖洗。加入0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞已經(jīng)完全脫離瓶壁，收集懸浮的細(xì)胞加入L-DMEM(10%FBS)培養(yǎng)基混合，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL；以1∶2傳代培養(yǎng)，記作Pl代，以后的傳代細(xì)胞依此類推。傳代細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液，倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況。

1.2.2 實驗細(xì)胞分組方法:實驗細(xì)胞分為空白組、成脂細(xì)胞分化組、地塞米松組，將地塞米松組(D組)再分為：10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組。空白組：細(xì)胞按正常程序傳代及培養(yǎng)；成脂細(xì)胞分化組：取生長狀態(tài)良好的P3期細(xì)胞，待細(xì)胞融合90%，加入間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基，3 d更換培養(yǎng)基1次，37 ℃、5%、CO2條件下培養(yǎng)；地塞米松組：取生長狀態(tài)良好的P3期細(xì)胞，待細(xì)胞融合90%，加入含不同濃度地塞米松(10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)的培養(yǎng)基，3 d更換培養(yǎng)基1次。分別于分組培養(yǎng)后1 d、3 d、7 d、9 d 取材行檢測，每組取10份細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞特性觀察:倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.4 細(xì)胞油紅“O”染色及茜素紅染色:培養(yǎng)9 d后取空白組、成脂細(xì)胞分化組、地塞米松組，細(xì)胞行油紅“O”染色及茜素紅染色。

油紅“O”染色，倒去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，95%乙醇固定10 min，油紅“O”稀釋液染色10 min，75%酒精脫色，顯微鏡觀察并照相。

茜素紅染色，倒去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，PBS漂洗2次,95%乙醇固定10 min，PBS沖洗2次；0.1%茜素紅染液染色6 min，PBS沖洗2次，觀察并照相。

1.2.5 細(xì)胞中堿性磷酸酶、三酰甘油的檢測:取空白組、成脂細(xì)胞分化組、地塞米松組細(xì)胞，收集細(xì)胞，通過反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，使用氯仿+甲醇提取液提取5 min，37 ℃水浴后使用三酰甘油試劑盒在全自動生化分析儀上測定。

取空白組、成脂細(xì)胞分化組、地塞米松組細(xì)胞，收集細(xì)胞，通過反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，離心取上清液后使用堿性磷酸酶試劑盒在全自動生化分析儀上測定。

1.2.6 細(xì)胞中PPARγ-2、脂聯(lián)素、堿性磷酸酶基因轉(zhuǎn)錄水平檢測:于細(xì)胞培養(yǎng)第7天，取空白組、成脂細(xì)胞分化組、地塞米松組細(xì)胞，提取總RNA，用紫外分光光度計進行RNA定量，用A260與A280的比值確定RNA的純度。設(shè)計引物并經(jīng)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)行PCR擴增。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃ 變性20 s，54 ℃ 退火20 s(ALP 為50 ℃)，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。采用Quantity One軟件測定條帶凈灰度值，并與β-actin內(nèi)參進行比較，計算其比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量。每組3 個樣本，引物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，見表1。

表1 PPARγ-2、脂聯(lián)素、堿性磷酸酶基因引物

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)檢查:倒置相差顯微鏡下觀察見P0代細(xì)胞貼壁生長，呈梭形或多邊形；成脂細(xì)胞分化組：在加入間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基后4d，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)小的脂滴。地塞米松組：10-10mol/L組和10-9mol/L組培養(yǎng)9 d后未見明顯細(xì)胞學(xué)變化，偶見細(xì)胞增大；10-8mol/L組第7天細(xì)胞較前增大，第9天見細(xì)胞內(nèi)顆粒增多；10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組第7天細(xì)胞內(nèi)見小脂滴。

2.2 細(xì)胞中堿性磷酸酶、三酰甘油的檢測：各組細(xì)胞在第1天僅有10～8 mol/L組堿性磷酸酶較高，余各組均未見明顯差異；第3天空白組、成脂細(xì)胞分化組、10-5mol/L組、10-6mol/L組未見明顯增高，余各組均出現(xiàn)堿性磷酸酶升高；第7天10-8mol/L組堿性磷酸酶明顯升高；第9天10-8mol/L組堿性磷酸酶仍較其他組高。隨著時間的推移，地塞米松各組細(xì)胞均可表達(dá)堿性磷酸酶，但10-8mol/L組表達(dá)最多，較其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組細(xì)胞中堿性磷酸酶的檢測

各組細(xì)胞在第1天未見三酰甘油明顯差異。第3天成脂細(xì)胞分化組三酰甘油含量明顯增高，較各組明顯增高并差異有統(tǒng)計學(xué)意義。第7天10-10mol/L組至10-5mol/L組三酰甘油逐漸升高，其中10-5mol/L組與成脂細(xì)胞分化組含量最多且與其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第9天地塞米松各組三酰甘油仍較高，且10-5mol/L組升高最多，見表3。

表3 各組細(xì)胞中三酰甘油的檢測

2.3 細(xì)胞中PPARγ-2、脂聯(lián)素、堿性磷酸酶基因轉(zhuǎn)錄水平檢測: 各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后10-8mol/L組、10-7mol/L組堿性磷酸酶表達(dá)量較其他組增高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。隨著地塞米松濃度的增加細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的水平逐漸減低，10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組脂聯(lián)素降低最明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時隨著地塞米松濃度的增加細(xì)胞，PPARγ-2的表達(dá)量逐漸在增加，地塞米松組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 第7天各組PPARγ-2、脂聯(lián)素、堿性磷酸酶的表達(dá)

3 討論

PPARs是核激素受體超家族的成員之一[3]，這是一種屬于Ⅱ型核激素受體超家族的一種，包括PPARα、PPARβ/δ 和PPARγ 3 種表型。PPARs是一種參與調(diào)節(jié)糖類、脂類以及脂肪儲存的基因，是一種參與代謝的重要基因。PPARs參與脂肪細(xì)胞的代謝已經(jīng)被相關(guān)實驗室證實。目前過氧化物酶增殖物激活受體-γ的研究比較多，同時也是最重要的是一種受體。PPARγ具很多種生物學(xué)功能，并積極參與脂肪細(xì)胞的分化過程[4]。目前有研究人員發(fā)現(xiàn)PPARγ的表達(dá)主要分布在脂肪細(xì)胞中。有文獻報道表明PPARγ在不同物種中的脂肪細(xì)胞均具有重要的表達(dá)[5-6]。近些年有研究人員研究發(fā)現(xiàn)，這種基因的表達(dá)量與脂肪細(xì)胞的分化程度、大小、體積均呈正相關(guān)性[7]。PPARγ之所以非常重要，是因為在沒有其的情況下，目前研究結(jié)果還沒有發(fā)現(xiàn)有另一種信號可以誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化，而且PPARγ能夠誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。PPARγ在前脂肪細(xì)胞中其并不表達(dá)，但如果前脂肪細(xì)胞需要分化時其先于其他脂肪基因的表達(dá)。沒有PPARγ，其他細(xì)胞因子不可能將前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，所以PPARγ在細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵性作用[8-9]。目前研究表明，PPARγ可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，已有實驗證明PPARγ的表達(dá)增加將抑制成骨的發(fā)生[10]，而使用雷奈酸鍶治療大鼠股骨頭壞死時可以降低PPARγ的表達(dá)。因此，PPARγ 是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化必須的調(diào)控因子。目前文獻報道，大部分PPARγ的目標(biāo)基因都直接參與脂肪合成途徑，包括脂蛋白脂肪酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、乙酰輔酶A 合成酶和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白。

目前的研究已經(jīng)在人類股骨和脛骨的成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了脂聯(lián)素及其受體AdipoR1/2的表達(dá)，同時使用免疫染色等試驗方法證實了，即骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞中均可檢測到脂聯(lián)素基因的表達(dá)。有實驗研究表明，在體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，檢測脂聯(lián)素蛋白的分泌及脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)均增加[11]。國外研究人員[12]發(fā)現(xiàn)，在小鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞表面有脂聯(lián)素及其受體的表達(dá)。

已有實驗研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素分別通過AdipoR/JNK和AdipoR/p38兩個細(xì)胞通道促進成骨細(xì)胞的增殖和分化，并且對時間和劑量具有依賴性。如果使用siRNA抑制AdipoRl，就可以阻止脂聯(lián)素對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞以及其細(xì)胞增殖和ALP的表達(dá)[13]。有實驗研究發(fā)現(xiàn)[14]，脂聯(lián)素可以通過自分泌或旁分泌的方式促進成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。將成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、單核細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗中，脂聯(lián)素可以通過AdipoRl/p38 MAPK徑路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，從而間接地誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[15]。曾有學(xué)者總結(jié)，骨骼局部產(chǎn)生的脂聯(lián)素以自分泌或旁分泌的途徑促進骨形成，而循環(huán)中脂聯(lián)素則以內(nèi)分泌的形式抑制骨形成，同時脂聯(lián)素通過影響胰島素信號通路間接促進骨的形成[16]。脂聯(lián)素與骨代謝關(guān)系密切。

既往的實驗研究表明，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下可以用地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素和吲哚美辛誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，用地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C 可誘導(dǎo)其定向分化為成骨細(xì)胞，而脂肪細(xì)胞的特點是能夠在細(xì)胞內(nèi)合成并儲存三酰甘油。因此，本實驗通過檢測三酰甘油含量作為細(xì)胞成脂能力的方法，堿性磷酸酶是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨形成所必需的酶。

本實驗結(jié)果顯示，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在地塞米松濃度改變時表達(dá)的基因有所不同。此次實驗中發(fā)現(xiàn)，低濃度地塞米松使細(xì)胞堿性磷酸酶含量增高，但隨地塞米松濃度的增高，堿性磷酸酶含量降低,但三酰甘油的含量逐漸增高，說明大劑量地塞米松誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。正常人體血液中生理濃度的糖皮質(zhì)激素為10～8 mol/L、10～7 mol/L,所以對成骨分化而言，10～8 mol /L 的地塞米松可以促使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)很高的堿性磷酸酶。但當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，大劑量地塞米松則促進細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞而造成骨髓內(nèi)脂肪堆積。高濃度的地塞米松促進PPARγ的表達(dá)同時抑制脂聯(lián)素表達(dá)，由此說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)向脂肪細(xì)胞開始轉(zhuǎn)變。

[1] 王佰亮，李子榮，婁晉寧，等.激素性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的檢測[J].中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版),2008,2(2)：25-28.

[2] 李龍江，余瑜.脂代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J].兒科藥學(xué)雜志，2005(1)：7-9.

[3] Ryan KK，Li B，Grayson BE，et al.A role for central nervous system PPAR-(Jgamma) in the regulation of energy balance[J].Nat Med，2011,17(5):623-626.

[4] 樊月圓.肉牛PPARs 家族和PLIN 基因遺傳變異及其與秦川牛胴體、肉質(zhì)性狀相關(guān)分析[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2010.

[5] 王麗，那威，王宇祥，等.雞PPARγ 基因的表達(dá)特性及其對脂肪細(xì)胞增殖分化的影響[J].遺傳，2012，34(5):454-464.

[6] Lee EK，Lee MJ，Abdelmohsen K，et al.miR-130 suppresses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator activated receptor γ expression [J].Mol Cell Biol，2011，31(4):626-638.

[7] 王義生，劉沛霖，殷力，等.葛根素對乙醇性股骨頭壞死的預(yù)防作用[J].中華實驗外科雜志，2007，24(4):479.

[8] 吳學(xué)建，尹萬樂，李月白，等.乙醇對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂轉(zhuǎn)錄因子C和骨鈣素mRNA 表達(dá)的影響[ J] .鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,41(6):1098.

[9] Ali AA，Weinstein RS，Stewart SA，et al.Rosiglitazone causes bone loss in mice by suppressing osteoblast differentiation and bone formation.Endocrinology，2005，1 46(3):1226-1235.

[10] Muruganandan S,Roman AA，Sinal CJ.Adipocyte ifferentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells:ross talk with the osteoblastogenic program[J].Cell Mol Life Sci，2009，66(2):236.

[11] Yusuke Shinoda，Masayuki Yamaguchi，Naoshi ogata.Regulation of bone formation by adiponectin through autocrine/paracrine and endocrine pathways[J].Journal of Cellular Biochemistry,2006,99:196-208.

[12] Xiang Hang Luo，Li Juan Guo，Ling Qing Yuan,et al.Adiponectin stimulates human osteoblasts proliferation and differentiation via the MAPK signaling pathway[J].Experimental Cell Research，2005，309:99-109.

[13] Ippei Kanazawa，Toru Yamaguchi，Shozo Yano,et al.Adiponectin and AMP kinase activator stimulate proliferation,differentiation，and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].BMC Cell Biology，2007,33:12.

[14] Xiang Hangluo，Li Juanguo，Hui Xie,et a1.Adiponectin stimulates RANKL and inhibits OPG expression in human osteoblasts through the MAPK signaling pathway[J].Journal of Bone and Mineral Research，2006，21(10):1648-1656.

[15] 譚振,康鵬德,謝小偉，等.雷奈酸鍶對大鼠激素性股骨頭壞死的作用及其機制的研究[J].中國矯形外科學(xué)雜志，2015，23(1):70-76.

[16] Zhao XY,Chen XY,Zhang ZJ，et al.Expression patterns of transcription factor of PPARγ and C/EBP family members during in vitro adipogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Cell Biol Int，2015，39(4):457-465.

Peroxisome proliferator activated receptorsgamma expression in rabbit hormone osteonecrosis

GONGFan，WANGLifeng，CHENGSuoli，GAOJun,MAFeng,WANGYuhai,ZHAOFei.

DepartmentofOrthopedics,NingxiaPeople'sHospital，Yinchuan750011，China

Correspondingauthor：ZHAOFei,Email:88652588@qq.com

Objective To observe the PPARγ expression in avascular necrosis of femoral headinduced by glucocorticoid，and to explore the effects of hormones on avascular necrosis of femorallipid metabolism disorder.Methods The animal model were established by prednisolone acetate.The PPARγin the hip-joint was detectedby using Western-Blot and the bone marrow fat cellswas examined by using the histopathology.Results The expression of PPAR γin bone tissue were higher in normal tissue(P<0.05).The differences of the empty bone lacuna rate，bone marrow fat cells area and diameter were statistically significant between the two groups (P<0.05).Conclusion The differentiation signal transduction pathway of PPAR γ in fat cells plays an important role in glucocorticoid induced avascular necrosis of the femoral head in lipid metabolism-2.

Rabbit；Steroid-inducedavascularnecrosisofthefemoralhead；PPARγ-2

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0009

寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ13185)

寧夏人民醫(yī)院骨科，寧夏 銀川 750002

鞏凡(1982-)，男，寧夏籍，碩士研究生，主要從事骨科學(xué)研究方向。

趙飛，Email:88652588@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170116.1122.006.html

R681.8

A

2016-09-20 [責(zé)任編輯]王凱榮