康玉明，蘇國愛，張艷麗

·論 著·

LPS對肝癌細(xì)胞TLR4及IL-23/IL17A表達(dá)的影響

康玉明1，蘇國愛2，張艷麗3

目的 觀察Toll樣受體4(TLR4)的激動劑LPS (LPS)對肝癌HepG2細(xì)胞株表達(dá) TLR4、IL-23/IL-17A的影響，探討TLR4、IL-23/IL-17A在肝癌發(fā)生中的作用及可能機(jī)制。方法 用LPS 1 mol/L作用HepG2細(xì)胞24 h，或先用LPS作用HepG2細(xì)胞24 h后再用髓樣分化因子-88(MyD88)的阻斷劑ST2825作用HepG2細(xì)胞8 h，運(yùn)用Q-PCR法檢測TLR4、IL-23、IL-17A在HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平；應(yīng)用Western-blot方法測定TLR4、IL-23及IL-17A在HepG2細(xì)胞的表達(dá)，采用ELISA法檢測HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-23在12 h、24 h、36 h的分泌水平。結(jié)果 LPS可促進(jìn)HepG2細(xì)胞株IL-23的分泌和TLR4、IL-23、IL-17A mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，阻斷MyD88后其表達(dá)水平比LPS組明顯降低，趨于正常組水平。結(jié)論 TLR4、IL-23及IL-17A參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生與進(jìn)展。

肝癌，Toll樣受體；白介素-23；白介素質(zhì)-17A

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球常見惡性腫瘤，也是最難治療的癌癥之一[1]。炎癥與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，Toll樣受體4(TLR4)高表達(dá)與乳腺癌、肺癌、前列腺癌、直腸癌和肝癌[2]的發(fā)生與進(jìn)展有密切關(guān)系。TLR4和骨髓分化因子(MyD88)已被證明在炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用，TLR4識別LPS并與其結(jié)合后，可激活TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中MyD88作為TLR4的鏈接蛋白繼而活化NF-κB轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生相關(guān)促炎細(xì)胞因子。有報(bào)道稱IL-23/IL-17 軸在腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病中起重要作用[3-5]，但TLR4活化與IL-23/IL-17在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進(jìn)展所處的炎癥環(huán)境中的具體分子機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞：肝癌細(xì)胞株HepG2和人正常肝細(xì)胞HL-7702均由本校生化實(shí)驗(yàn)室楊怡教授饋贈。

1.2 主要試劑與儀器:LPS購自美國Sigma公司，ST2825為Med Chem Express公司產(chǎn)品；引物序列由上海生工科技有限公司合成；TLR4、IL-23及IL-17A單克隆抗體購自英國Abcam公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，DMEM培養(yǎng)基為GBICO公司產(chǎn)品；TRIZOL總RNA提取液為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；β-actin為北京中衫金橋有限公司產(chǎn)品；Nanodrop2000由美國Thermo公司制造，ABI-7300 型Real-time PCR 檢測儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，肝癌細(xì)胞株HepG2用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液、人正常肝細(xì)胞系細(xì)胞系HL-7702用RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后移入培養(yǎng)瓶于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成：由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，經(jīng)驗(yàn)證后使用。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3.3 Q-PCR法測定TLR4、IL-23及IL-17A mRNA的轉(zhuǎn)錄水平:生長旺盛狀態(tài)的人肝癌細(xì)胞HepG2置于6孔板培養(yǎng)，按分組條件加樣并培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組：第1組為正常對照組，第2組加LPS 1 mol/L培養(yǎng)24 h，第3組先加 LPS 1 mg/L培養(yǎng)24 h，之后加ST2825 40 μmol/L培養(yǎng)8 h)。嚴(yán)格按試劑盒說明提取細(xì)胞(細(xì)胞計(jì)數(shù)約為106個)總RNA并測定其濃度和純度，采用美國Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；PCR循環(huán)(×40循環(huán))，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(Data collection)，熔解曲線分析(Melting Curve Analysis)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的相對含量用2-ΔΔCt法計(jì)算，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Western blot法檢測TLR4、IL-23及IL-17A的表達(dá):取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件及分組同1.3.3。提取細(xì)胞總蛋白(細(xì)胞計(jì)數(shù)約為106個)，調(diào)節(jié)樣品蛋白濃度為10 μg/L。取10 μl蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，在60 V、300 mA、4 ℃恒流條件下轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；TBST洗3次，TLR4、IL-23、IL17A和β-actin抗體用5%脫脂奶粉PBS溶液1∶1 000稀釋，37 ℃孵育3 h。TBST洗3次后加1∶2 000的羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h后用TBST 洗滌，DAB顯色，ECL發(fā)光及曝光，膠片拍照。

1.3.5 ELISA試劑盒檢測IL-23的水平:培養(yǎng)HepG2細(xì)胞于96孔板，5 000個細(xì)胞/孔，按實(shí)驗(yàn)分組并處理HepG2細(xì)胞，繼續(xù)分別培養(yǎng)12 h、24 h和36 h并收集細(xì)胞上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作流程檢測IL-23的分泌水平，酶標(biāo)儀波長測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖。

2 結(jié)果

2.1 LPS促進(jìn)TLR4、IL-23 及IL-17A mRNA的轉(zhuǎn)錄:HepG2細(xì)胞用LPS或ST2825處理后，采用Q-PCR法測定TLR4、IL-23、IL-17AmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，。經(jīng)LPS 1 mg/L 培養(yǎng)24 h的HepG2細(xì)胞與正常肝細(xì)胞HL-7702比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在HepG2細(xì)胞，LPS組與對照組比較，TLR4 mRNA相對表達(dá)量提高(P<0.05)，ST2825組與LPS組比較，TLR4mRNA的表達(dá)無明顯變化。在HepG2細(xì)胞LPS組的IL-23、IL-17A的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于HL-7702細(xì)胞的(P<0.05)；LPS組與對照組比較，IL-23、IL-17A的 mRNA相對表達(dá)量明顯提高(P<0.05)；而ST2825組相對于LPS組的IL-23、IL-17A的 mRNA表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。

2.2 LPS促進(jìn)TLR4 、IL-23 及IL-17A 在肝癌細(xì)胞的蛋白表達(dá):Western-blot法觀察在HepG2細(xì)胞株TLR4、IL-23、IL-17A蛋白的表達(dá)，經(jīng)灰度掃描分析，以HepG2細(xì)胞TLR4、IL-23、IL-17A條帶灰度值除以相應(yīng)的β-actin條帶灰度值作為HepG2細(xì)胞 TLR4、IL-23、IL-17A蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示LPS促進(jìn)HepG2細(xì)胞株TLR4、IL-23、IL-17A的蛋白表達(dá)(P<0.05)，阻斷MyD88后IL-23和IL-17A蛋白表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。

2.3 LPS促進(jìn)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-23的分泌水平:ELISA結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞的上清液IL-23在不同時(shí)間內(nèi)LPS組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在同一時(shí)間內(nèi)LPS處理組與對照組比較IL-23的表達(dá)升高(P<0.05)，ST2825組與LPS組比較，IL-23的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見表2。

表2 ELISA法檢測HepG2細(xì)胞中IL-23的表達(dá)量

注：*與對照組比較,P<0.05；#與ST2825組比較,P<0.05。

3 討論

肝臟的慢性炎癥是公認(rèn)的致癌危險(xiǎn)因素[6]，TLR4識別并結(jié)合后，可激活依賴MyD88的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶家族(IKKs)磷酸化，最終分別活化轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)和NF-κB，促進(jìn)炎性反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-1等的分泌，引發(fā)炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激肝癌細(xì)胞株HepG2后，TLR4的表達(dá)在基因與蛋白水平明顯提高，且在翻譯與轉(zhuǎn)錄的水平保持一致，而經(jīng)ST2825預(yù)處理后再加入LPS則TLR4表達(dá)無明顯變化，提示肝癌細(xì)胞表面TLR4可以通過與其外源性配體LPS結(jié)合，活化依賴MyD88的TLR4信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)眾多炎癥相關(guān)的特異基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞分泌許多相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，營造出有利于腫瘤生長的炎癥微環(huán)境。

IL-23是IL-12家族成員之一，通過TLR4刺激DC和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-23。許多研究顯示誘導(dǎo)IL-23刺激Th細(xì)胞激活產(chǎn)生IL-17A，MyD88信號在CD4+T細(xì)胞缺乏損害了Th17細(xì)胞分化和IL-23信號，說明IL-17A和IL-23信號途徑依賴MyD88[7]。壞死肝細(xì)胞釋放高遷移率族蛋白1(HMGB1)刺激肝巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-23其依賴TLR-4信號途徑，IL-23幫助肝臟的γδ T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A。因此，TLR4通過上調(diào)巨噬細(xì)胞和γδT細(xì)胞的IL-23/17A軸從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集，加重肝臟的炎癥[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的外源性配體LPS可活化誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞表達(dá)IL-23和IL-17A，其結(jié)果在基因和蛋白表達(dá)水平一致。阻斷MyD88，與較單獨(dú)LPS刺激HepG2細(xì)胞相比，IL-23和IL-17A的基因和蛋白表達(dá)明顯下降。說明LPS-TLR4通路促進(jìn)了肝癌HepG2細(xì)胞IL-23和IL-17A細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與或加重了肝癌炎癥微環(huán)境的形成，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生存、增殖和進(jìn)展。

本研究結(jié)果說明，TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)控IL-23/IL-17A炎癥軸，為肝癌的臨床免疫治療提供了一個有前途的干預(yù)策略，但調(diào)控的具體分子機(jī)制尚需本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)更為詳盡的研究。

[1] Arslanoglu A,Seyal AR,Sodagari F,et al.Current guidelines for the diagnosis and management of hepatocellular carcinoma:a comparative review[J].Am J Roentgenol,2016,4:1-11.

[2] Wang L,Zhu R,Huang Z，et al.Lipopolysaccharide-induced toll like receptor 4 signaling in cancer cells promotes cell survival and proliferation in hepatocellular carcinoma[J].Nature,2013,58:2223-2236.

[3] Burkett PR,Meyer zu Horste G,Kuchroo VK.Pouring fuel on the fire:Th17 cells,the environment,and autoimmunity[J].J Clin Invest,2015,125(6):2211-2219.

[4] Harris KM,Ramachandran G,Basu S,et al.The IL-23/Th17 axis is involved in the adaptive immune response to bacillus anthracis in humans[J].Eur J Immunol,2014,44(3):752-762.

[5] Xu M,Mizoguchi I,Morishima N,et al.Regulation of antitumor immune responses by the IL-12 family cytokines,IL-12,IL-23,and IL-27[J].Clinical & Dev Immunol,2010，107:832454.

[6] Grivennikov SI,Gretcn FR,Karin K.Immunity,inflammation,and cancer[J].Cell,2010,140:883-899.

[7] Chang J,Burkett PR,Borges CM,et al.MyD88 is essential to sustain mTOR activation necessary to promote T helper 17 cell proliferation by linking IL-1 and IL-23 signaling[J].Proc Natl Acad Sci,2013,110(6):2270-2275.

[8] Wang X,Sun R，Wei H,et al.High-mobility group box 1(HMGB1)-Toll-like receptor(TLR)4-interleukin(IL)-23-IL-17A axis in drug-induced damage-associated lethal hepatitis:interaction of γδ T cells with macrophages[J].Hepatology,2013,57(1):373-384.

Effect of LPS on the expression of TLR4，IL-23 and IL-17A in HepG2 cell line

KANGYuming1，SUGuoai2，ZHANGYanli3.

1.DepartmentofHepatobiliarySurgery，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China;2.BeijingRenheHospital，Beijing102600，China;3.LaboratoryofImmunology，BasicMedicineCollegeofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Correspondingauthor:ZHANGYanli,Email:wi_ntersweet@126.com

Objective To explore the effect of TLR4 agonist lipopolysaccharides (LPS)on the expression of interleukin -23 (IL-23)and IL-17A in HepG2 cell line，to analyze the mechanism of TLR4，IL-23 and IL-17A in carcinogenesis of hepatocellular carcinoma.Methods HepG2 cells were stimulated with LPS 24h，then treated HepG2 cells 8h with Myeloid differentiation factor 88 (MyD88)and inhibitors ST2825.The mRNA level of TLR4，IL-23 and IL-17A in HepG2 cells was detected by Q-PCR.The expression of TLR4，IL-23 and IL-17A was measured by Western-blot；The level of IL-23 was measured by ELISA at 12 h，24 h and 36 h.Results LPS promoted mRNA transcription level of TLR4，IL-23 and IL-17A in HepG2 cell lines and the protein expression of TLR4，IL-23，IL-17A，while ST2825 inhibited the expression of TLR4，IL-23，IL-17A.LPS enhanced the secreted level of IL-23 in different time-phase.Conclusion TLR4，IL-23 and IL-17A are involved in the occurrence and progress of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellularcarcinoma；TLR4；IL-23；IL-17A

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0006

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ14139)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科，寧夏 銀川 750004 2.北京仁和醫(yī)院，北京 102600 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004

康玉明(1972-)，男，學(xué)士學(xué)位，主任醫(yī)師，從事肝膽外科專業(yè)。

張艷麗，Email:wi_ntersweet@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170112.1708.022.html

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A

2016-08-17 [責(zé)任編輯]馬興忠