施華球，謝瑞蓮

·論著·

白介素1受體相關激酶1在乳腺癌紫杉醇耐受患者治療中的作用機制研究

施華球*，謝瑞蓮

目的 探討白介素1受體相關激酶1(IRAK1)在乳腺癌紫杉醇耐受患者治療中的作用機制。方法 選取2013年5月—2015年9月贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科收集的乳腺組織(對照)及乳腺癌組織，其中對照女性16例，Basal-like型乳腺癌患者38例，Luminal-A型乳腺癌患者25例，Luminal-B型乳腺癌患者31例，HER2過表達型乳腺癌患者31例，三陰乳腺癌患者58例。取對照乳腺組織及乳腺癌組織，采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測IRAK1 mRNA的相對表達水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測炎性因子白介素(IL)-6、IL-8和CXC趨化因子配體1(CXCL-1)表達水平。培養(yǎng)乳腺癌細胞株HMEC、MCF7、MB415、MB436、MB468、BT549、SUM159，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導乳腺癌細胞株產(chǎn)生紫杉醇耐受性，檢測未經(jīng)處理的細胞株和紫杉醇耐受細胞株IRAK1 mRNA相對表達水平。經(jīng)shRNA或空白序列NC-shRNA轉(zhuǎn)染紫杉醇耐受乳腺癌細胞株，采用qPCR檢測增殖相關基因細胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖細胞核抗原(PCNA)和Cyclin A相對表達水平，凋亡相關基因p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相對表達水平，遷移相關基因Cullin 1、Bcl-6和KLF6相對表達水平，采用ALDEFLUOR實驗檢測醛脫氫酶(ALDH)活性。結(jié)果 各類型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1 mRNA相對表達水平均高于不耐受患者(P<0.05),三陰乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1 mRNA相對表達水平均高于其他類型乳腺癌紫杉醇耐受患者(P<0.05)。對照者及各類型乳腺癌紫杉醇耐受患者IL-6、IL-8、CXCL-1表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株IRAK1 mRNA相對表達水平均高于未經(jīng)紫杉醇處理的細胞株(P<0.05)。經(jīng)shRNA轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株Cyclin D1、PCNA、Cyclin A相對表達水平均低于經(jīng)NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株,p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相對表達水平均高于經(jīng)NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株，Cullin 1、Bcl-6相對表達水平、ALDH活性均低于經(jīng)NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株，KLF6相對表達水平高于經(jīng)NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株(P<0.05)。結(jié)論 IRAK1在紫杉醇耐受的乳腺癌細胞，尤其是三陰乳腺癌細胞中發(fā)揮重要作用。抑制IRAK1表達可顯著降低乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，誘導癌細胞凋亡，IRAK1抑制劑可用于乳腺癌尤其是三陰乳腺癌的治療。

乳腺腫瘤；抗藥性，腫瘤；白介素1受體相關激酶類；細胞增殖；細胞凋亡

施華球，謝瑞蓮.白介素1受體相關激酶1在乳腺癌紫杉醇耐受患者治療中的作用機制研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(2)：165-171.[www.chinagp.net]

SHI H Q,XIE R L.Mechanisms of interleukin-1 receptor-associated kinase 1 in the treatment for breast cancer patients with resistance to paclitaxel[J].Chinese General Practice，2017，20(2)：165-171.

紫杉醇是乳腺癌患者最常用的化療藥物之一，乳腺癌紫杉醇耐受是臨床治療的最大難題之一[1]。乳腺癌主要包括Basal-like型、Luminal-A型、Luminal-B型、HER2過表達型和三陰乳腺癌，其中三陰乳腺癌最易產(chǎn)生耐受性，發(fā)病率和病死率居高不下。因此，研究乳腺癌尤其是三陰乳腺癌紫杉醇耐受的機制，并尋找新型的治療策略勢在必行[2]。白介素1受體相關激酶(IRAK)1在多種癌癥的固有免疫反應中發(fā)揮重要作用，是IRAK家族中關鍵的固有免疫信號調(diào)節(jié)分子。目前，已發(fā)現(xiàn)IRAK1有4種剪接異構(gòu)體，即IRAK1a、IRAK1b、IRAK1s和IRAK1c，其在結(jié)構(gòu)和功能上有共同點，但又各自具有特點。IRAK1c是新發(fā)現(xiàn)的剪接異構(gòu)體，缺少激酶活性，成為當前研究重點。IRAK1具有激酶活性，作為細胞溶質(zhì)激酶、核激酶及接頭蛋白，參與調(diào)控Toll樣受體(TLR)/白介素1受體(IL-1R)兩個受體家族的信號級聯(lián)反應，調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、Ⅰ型干擾素(IFN)及AP-1等炎性因子的表達[3]，但其在乳腺癌尤其是三陰乳腺癌紫杉醇耐受治療中的作用機制尚有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌細胞株HMEC、MCF7、MB415、MB436、MB468、BT549、SUM159購于ATCC公司；小牛血清和DMEM培養(yǎng)基購于Invitrogen公司；IRAK1的NC-shRNA和shRNA由Dharmacon公司合成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamin 2000購于Bio-Rad公司；紫杉醇購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，用所隨溶媒1 ml溶解成藥物原液，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋成實驗所需濃度；ALDEFLUOR試劑盒購于Stem Cell Technology公司；流式細胞儀購于BD公司。

1.2 乳腺癌組織

1.2.1 組織來源 選取2013年5月—2015年9月贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科收集的女性乳腺活檢組織(對照)及乳腺癌患者手術(shù)切除的癌組織，其中對照女性16例(因乳腺包塊行組織活檢，病理證實為乳腺纖維瘤)，平均年齡(45.0±2.3)歲；Basal-like型乳腺癌患者38例，平均年齡(55.0±3.3)歲，紫杉醇耐受18例；Luminal-A型乳腺癌患者25例，平均年齡(52.0±2.6)歲，紫杉醇耐受10例；Luminal-B型乳腺癌患者31例，平均年齡(57.0±1.6)歲，紫杉醇耐受12例；HER2過表達型乳腺癌患者31例，平均年齡(58.0±3.1)歲，紫杉醇耐受10例；三陰乳腺癌患者58例，平均年齡(53.0±2.1)歲，紫杉醇耐受45例。受試者均簽署書面知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理學會支持。

1.2.2 IRAK1 mRNA相對表達水平檢測 取乳腺癌組織，采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測IRAK1 mRNA的相對表達水平。IRAK1引物序列：上游：5′-GCACCCACAACTTCTCGGAG-3′，下游：5′-CACCGTGTTCCTCATCACCG-3′。PCR反應條件：50 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，重復40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.2.3 炎性因子表達水平檢測 取對照乳腺組織及紫杉醇耐受患者乳腺癌組織，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測炎性因子白介素(IL)-6、IL-8和CXC趨化因子配體1(CXCL-1)表達水平。(1)包被：設置空白對照和陰性對照，將抗原用稀釋液稀釋到適當濃度，每孔加入100 μl抗原，為避免蒸發(fā)，蓋上蓋子，37 ℃放置4 h，移除每孔中的液體；(2)封閉酶標反應孔：每孔加滿5%小牛血清，37 ℃封閉40 min，去除每孔中的氣泡，封閉結(jié)束后，用洗滌液滿孔洗滌3次，3 min/次；(3)加入待檢測樣品：將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每個樣品設置2個復孔，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h，用洗滌液滿孔洗滌3次，3 min/次；(4)加入酶標抗體：將酶標抗體按照說明書的要求稀釋成特定濃度，37 ℃孵育1 h，用洗滌液滿孔洗滌3次，3 min/次；(5)加入底物：加入TMB-過氧化氫尿素溶液，100 μl/孔，37 ℃避光孵育5 min；(6)終止反應：每孔加入終止液50 μl顯色，20 min內(nèi)測定實驗結(jié)果；(7)結(jié)果判斷：TMB顯色后，在450 nm波長處檢測吸光度值，檢測時，將空白孔系統(tǒng)調(diào)零，用測定標本孔的吸光度值與陰性標本孔平均值的比值表示IL-6、IL-8和CXCL-1表達水平。

1.3 乳腺癌細胞株

1.3.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌細胞株HMEC、MCF7、MB415、MB436、MB468、BT549、SUM159用含有10%小牛血清、100×103U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化傳代。

1.3.2 紫杉醇耐受乳腺癌細胞株的篩選及IRAK1 mRNA相對表達水平檢測 采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊法誘導乳腺癌細胞株產(chǎn)生紫杉醇耐受性，紫杉醇起始濃度為1 nmol/L，終濃度為10 nmol/L，每隔1個月使用5 nmol/L紫杉醇間斷沖擊，誘導12個月后得到紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株。誘導過程中，培養(yǎng)液含有大量被紫杉醇殺死的細胞，移除培養(yǎng)液并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，剩下的細胞即為紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株。MTT法測定紫杉醇對親本細胞和耐受細胞的半數(shù)致死濃度(IC50)，耐受指數(shù)(RI)=耐受細胞株IC50/親本細胞株IC50，本實驗乳腺癌細胞株耐受指數(shù)見表1。檢測未經(jīng)紫杉醇處理的細胞株和紫杉醇耐受細胞株IRAK1 mRNA相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.3 shRNA轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的紫杉醇耐受乳腺癌細胞株接種于6孔板中，細胞密度為2×105個，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞密度達到70%～80%時進行shRNA轉(zhuǎn)染或?qū)φ招蛄蠳C-shRNA轉(zhuǎn)染。用預熱過的無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌待轉(zhuǎn)染的細胞，用DMEM將2.5 μl NC-shRNA或shRNA和5 μl Lipofactamin 2000分別稀釋至250 μl，混勻后室溫放置5 min，將二者混勻，室溫靜置20 min，緩慢加入對應的6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換預熱的DMEM培養(yǎng)基。

表1 乳腺癌細胞株耐受指數(shù)

注：IC50=半數(shù)致死濃度，RI=耐受指數(shù)

1.3.4 細胞增殖相關基因表達水平檢測 采用qPCR檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株增殖相關基因細胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖細胞核抗原(PCNA)和Cyclin A相對表達水平。提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。Cyclin D1引物序列：上游：5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游：5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；PCNA引物序列：上游：5′-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3′，下游：5′-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3′；Cyclin A引物序列：上游：5′-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3′；下游：5′-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3′。PCR反應條件：50 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，重復40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。實驗重復3次。

1.3.5 細胞凋亡相關基因表達水平檢測 采用qPCR檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株凋亡相關基因p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相對表達水平。p53引物序列：上游：5′-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3′，下游：5′-TCATCCAAATACTCCACACGC-3′；c-myc引物序列：上游：5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA -3′，下游：5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′；Bcl-2引物序列：上游：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG -3′，下游：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′；c-erb-2引物序列：上游：5′-CAGAAGAAGCGGGTCAAGTTG-3′，下游：5′-GCTCCTCTTTCGGAGTTCAATC-3′。PCR反應條件及計算方法同上。實驗重復3次。

1.3.6 遷移能力

1.3.6.1 細胞遷移相關基因表達水平檢測 采用qPCR檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株遷移相關基因Cullin 1、Bcl-6和KLF6相對表達水平。Cullin 1引物序列：上游：5′-ACACATCTCGGCTCAATTTGC -3′，下游：5′-AGTGTCCACAACATGCTCCAT-3′；Bcl-6引物序列：上游：5′-GGAGTCGAGACATCTTGACTGA -3′，下游：5′-ATGAGGACCGTTTTATGGGCT-3′；KLF6引物序列：上游：5′-GGCAACAGACCTGCCTAGAG -3′，下游：5′-CTCCCGAGCCAGAATGATTTT-3′。 PCR反應條件及計算方法同上。實驗重復3次。

1.3.6.2 ALDEFLUOR實驗 取106個紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株用ALDEFLUOR緩沖液重懸，添加15 μmol/L醛脫氫酶(ALDH)特異性抑制劑4-(二乙氨基)-2-羥基苯甲醛和0.15 μmol/L ALDH底物，37 ℃孵育25 min，流式細胞儀檢測ALDH活性。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者IRAK1mRNA相對表達水平比較 各類型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1mRNA相對表達水平均高于非耐受患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。各類型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1mRNA相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=18.215,P<0.05)，其中三陰乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1mRNA相對表達水平均高于其他類型乳腺癌紫杉醇耐受患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 對照與各類型乳腺癌紫杉醇耐受組織炎性因子表達水平比較 對照及各類型乳腺癌紫杉醇耐受組織IL-6、IL-8、CXCL-1表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 其中，Basal-like型、Luminal-A型、Luminal-B型、HER2過表達型和三陰乳腺癌紫杉醇耐受組織IL-6、IL-8和CXCL-1的表達水平均高于對照組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

2.3 各乳腺癌細胞株IRAK1mRNA相對表達水平比較 紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株IRAK1mRNA相對表達水平均高于未經(jīng)紫杉醇處理的細胞株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4)。

2.4shRNA轉(zhuǎn)染對紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株細胞增殖相關基因表達水平的影響 經(jīng)shRNA轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株CyclinD1、PCNA、CyclinA相對表達水平均低于NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表5)。

Table 2 Comparison of relative expression level of IRAK1 mRNA between various breast cancer with or without paclitaxel-resistance

乳腺癌類型紫杉醇耐受例數(shù)IRAK1mRNA相對表達水平t值P值Basal?like型10773<0001否20132±016是18189±011Luminal?A型4689<0001否15124±026是10165±009Luminal?B型4425<0001否19135±014是12173±018HER2過表達型7726<0001否21126±023是10186±016三陰乳腺癌19179<0001否13122±011是45213±014

注：IRAK1=白介素1受體相關激酶1

Table 3 Comparison of relative expression levels of inflammatory cytokines in control breast tissues and paclitaxel-resistant breast cancer tissues

組織例數(shù)IL?6IL?8CXCL?1對照16213±012313±021291±016Basal?like型18312±011a424±018a328±017aLuminal?A型10323±012a439±025a347±021aLuminal?B型12319±023a427±017a358±019aHER2過表達型10341±016a453±016a423±018a三陰乳腺癌45561±015a893±021a1256±019aF值420153621647319P值<0001<0001<0001

注：IL=白介素，CXCL-1=CXC趨化因子配體1；與對照組織比較，aP<0.05

2.5 shRNA轉(zhuǎn)染對紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株細胞凋亡相關基因表達水平的影響 經(jīng)shRNA轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株p53、c-myc、Bcl-2、c-erb-2相對表達水平均高于NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表6)。

2.6 shRNA轉(zhuǎn)染對紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株細胞遷移能力的影響 經(jīng)shRNA轉(zhuǎn)染的紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株Cullin 1、Bcl-6相對表達水平、ALDH活性均低于NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株，KLF6相對表達水平高于NC-shRNA轉(zhuǎn)染的各乳腺癌細胞株，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表7)。

Table4ComparisonofrelativeexpressionlevelofIRAK1mRNAinbreastcancercelllineswithresistancetopaclitaxelandthosewithoutpaclitaxeltreatment

干預HMECMCF7MB415MB436MB468BT549SUM159未經(jīng)紫杉醇處理113±018132±016135±010143±011126±016123±013154±017紫杉醇耐受159±011189±021172±011185±013176±011198±015273±021t值3494508543114272420176289091P值0025000700120013001400020001

Table5Comparisonoftheexpressionlevelsofproliferation-associatedgenesbetweenvariouspaclitaxel-resistantbreastcancercelllineswithNC-shRNAtransfectionandthosewithshRNAtransfection

乳腺癌細胞株CyclinD1NC?shRNA shRNA t值 P值PCNANC?shRNA shRNA t值 P值CyclinANC?shRNA shRNA t值 P值HMEC231±012109±0118737<0001251±013129±0018556<0001138±012108±01329370042MCF7356±018113±00819952<0001258±012103±01822295<0001259±013108±01214226<0001MB415349±021098±01419346<0001289±011078±02417325<0001269±016078±01116541<0001MB436431±023089±02122000<0001337±013083±01116118<0001335±021086±01518192<0001MB468369±016099±01717714<0001265±026089±01310798<0001265±013087±02115532<0001BT549412±014059±01227763<0001372±019069±02222798<0001317±012064±01718118<0001SUM159356±015079±02124976<0001266±021089±01110080<0001258±018098±01911193<0001

注：Cyclin=細胞周期蛋白，PCNA=增殖細胞核抗原

Table6Comparisonoftheexpressionlevelsofapoptosis-relatedgenesbetweenvariouspaclitaxel-resistantbreastcancercelllineswithNC-shRNAtransfectionandthosewithshRNAtransfection

乳腺癌細胞株p53NC?shRNA shRNA t值 P值c?mycNC?shRNA shRNA t值 P值Bcl?2NC?shRNA shRNA t值 P值c?erb?2NC?shRNA shRNA t值 P值HMEC105±012324±01116879<0001113±015264±0149925<0001115±017427±01420001<0001125±016298±01312063<0001MCF7121±013289±01417087<0001159±017367±01516359<0001152±021356±02314000<0001119±015374±02422251<0001MB415115±021315±01513725<0001108±011295±01417413<0001108±011255±0129987<0001105±011275±01311153<0001MB436109±015376±01221800<0001116±014356±01620996<0001119±014277±01514842<0001119±014296±01516047<0001MB468117±016418±02126067<0001121±015328±01116348<0001109±015368±01121147<0001107±013358±01121902<0001BT549107±015389±01818927<0001117±016289±01315343<0001117±019285±01313254<0001118±014286±01316343<0001SUM159125±019513±02325677<0001115±021411±02120758<0001118±013417±01928169<0001119±017417±02424118<0001

Table7Comparisonofmigratoryabilitybetweenvariouspaclitaxel-rersistantbreastcancerlineswithNC-shRNAtransfectionandthosewithshRNAtransfection

乳腺癌細胞株Cullin1NC?shRNA shRNA t值 P值Bcl?6NC?shRNA shRNA t值 P值KLF?6NC?shRNA shRNA t值 P值ALDH活性NC?shRNA shRNA t值 P值HMEC103±012053±004132270032115±016047±01468930002064±014123±01568740002123±015059±01447310009MCF7114±008042±00713943<0001124±012082±01739450017062±009134±01871290002134±018063±01753930006MB415109±007036±01312772<0001119±017066±01538180019056±012119±01350440007127±016075±01538580018MB436117±009067±00654770005113±019057±01640070016052±016127±01963010003125±004057±01675870002MB468106±014052±01961410004125±013061±01753770006063±017116±01336010023129±013062±01356290005BT549118±017043±01650950007115±012053±01951610007033±012125±01679670001107±014036±01264370003SUM159107±006069±00638520018112±008067±00537810019058±007127±01868430002125±013046±00577340002

注：ALDH=醛脫氫酶

3 討論

IRAK家族是絲氨酸/蘇氨酸激酶，在TLR、IL-1R介導的信號通路或炎性反應中發(fā)揮重要的正向或負向調(diào)節(jié)作用[4]。在哺乳動物中，IRAK包括4個成員，即IRAK1、IRAK2、IRAK3(IRAKM)、IRAK4，其中IRAK1、IRAK2和IRAK4在固有免疫細胞中普遍表達，而IRAK3主要在單核/巨噬細胞中表達，IRAK參與機體的免疫反應依賴于髓樣分化因子88(Myd88)和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)信號通路，Myd88介導除TLR3之外的所有上游TLRs信號，TRIF介導TLR3和部分TLR4信號，增加或減少固有免疫細胞分泌細胞因子，幫助機體有效清除外源性病原體或內(nèi)源性病變細胞，如癌細胞等。目前研究結(jié)果表明，IRAK1、IRAK2、IRAK4發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，IRAK3發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用[5]。

IRAK1是IRAK激酶家族成員，在固有免疫系統(tǒng)中具有重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)4種剪接異構(gòu)體IRAK1a、IRAK1b、IRAK1s和IRAK1c，除IRAK1c外均具有激酶活性，可在細胞質(zhì)和細胞核中充當激酶和接頭蛋白的作用，參與調(diào)控TLR/IL-1R信號級聯(lián)反應，調(diào)節(jié)TNF-α、Ⅰ型IFN及AP-1等炎性因子的表達[6]。

在人類癌癥中，IL-1信號通路和TLR-Myd88的作用機制已被詳細闡述，但IRAK1在癌癥中的具體功能有待進一步研究[7]。三陰乳腺癌患者癌組織IRAK1表達水平較高，與三陰乳腺癌的轉(zhuǎn)移特性密切相關，IRAK1的特異性抑制劑可選擇性抑制p38/MAPK信號通路，降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表達，誘導乳腺癌細胞大量凋亡，在臨床上可用于三陰乳腺癌的治療[7]。

20世紀70年代乳腺癌的治療以環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等非蒽環(huán)類為主，80年代則以阿霉素、表阿霉素為代表的蒽環(huán)類聯(lián)合化療藥物為主，90年代紫杉類藥物的問世被稱為腫瘤化療的重大突破，其代表藥物是紫杉醇和多西紫杉醇[8]。研究結(jié)果表明，紫杉醇是乳腺癌化療中最有活性的藥物之一，因其獨特的作用機制和良好的耐受性，紫杉醇又被廣泛用于與蒽環(huán)類、吉西他濱、鉑類、Herceptin聯(lián)合應用[9]。

三陰乳腺癌占乳腺癌的15%～20%，易復發(fā)、轉(zhuǎn)移，預后差，化療只對少部分患者有效，一旦癌細胞獲得耐受性，患者極易復發(fā)并發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移，與其他類型乳腺癌相比，三陰乳腺癌患者存活率極低，病死率極高[10]。目前，治療三陰乳腺癌的方法有限。因此，研發(fā)新型的治療策略對治療三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移后復發(fā)和化療耐受性具有極其重要的意義。

炎性因子和趨化因子參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的很多階段，如癌癥起始、轉(zhuǎn)移和化療耐受性，包括核因子(NF)-κB、JAK/STAT和IFN等。在三陰乳腺癌中，NF-κB信號通路通過自分泌和旁分泌通路活化普遍存在，促進下游炎性因子的分泌如IL-6、IL-8和CXCLs的表達，促進下游抗凋亡基因的表達，最終導致癌細胞惡性增長和轉(zhuǎn)移、癌癥干細胞富集和化療耐受性[11]。

已有研究報道，抑制IRAK1、IRAK4的藥物可用于治療骨髓增生異常綜合征和急性淋巴性白血病，效果顯著[12]，但IRAK1在三陰乳腺癌中的作用及其與紫杉醇耐受性的關系還未得到明確闡述。

紫杉醇被廣泛應用于術(shù)后輔助治療乳腺癌，其化學結(jié)構(gòu)獨特、抗腫瘤譜廣，活性高且單藥緩解率可達40%～68%，療效確切，可耐受毒性反應。紫杉類藥物是通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定，抑制細胞有絲分裂，對腫瘤細胞產(chǎn)生抑制和殺傷作用，是目前治療乳腺癌最有效的藥物之一，可顯著改善早期乳腺癌患者的無病生存期和總生存期。1994年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準紫杉醇用于治療復發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌，2000年批準用于早期乳腺癌術(shù)后的輔助治療[13]?；熕幬镆种颇[瘤細胞增殖的機制有：直接殺傷腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞分化，誘導腫瘤細胞凋亡。在G2/M期，紫杉醇通過促進微管聚集、阻止微管解聚，從而抑制細胞分裂。但是紫杉醇治療乳腺癌尤其是三陰乳腺癌，會導致骨髓抑制和紫杉醇耐受性[14]。

乳腺癌紫杉醇耐受與IRAK1密切相關，涉及的下游信號通路主要包括NF-κB和p38-Mcl-1信號通路，前者主要負責富集癌癥干細胞，后者主要負責紫杉醇耐受，增加乳腺癌細胞存活率。p38/JNK信號通路可磷酸化并穩(wěn)定Mcl-1，促進癌細胞抗凋亡的效果[15]。因此，在三陰乳腺癌治療領域，與單獨抑制NF-κB信號通路相比，抑制IRAK1可同時抑制NF-κB和p38/JNK信號通路，具有更好的臨床治療效果。磷酸化的IRAK1與三陰乳腺癌化療后復發(fā)有關，而使用IKKβ/RelA抑制劑抑制NF-κB信號通路來治療三陰乳腺癌，毒副作用大。因此，IRAK1抑制劑是治療三陰乳腺癌的最佳選擇，可通過誘導癌細胞大量凋亡阻斷乳腺癌紫杉醇耐受[7]。本研究結(jié)果表明，各類型乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1相對表達水平均高于不耐受患者，三陰乳腺癌紫杉醇耐受患者IRAK1相對表達水平均高于其他類型乳腺癌紫杉醇耐受患者。

三陰乳腺癌患者服用紫杉醇后，可激活STAT3、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路，血清中IL-6和IL-8水平升高，誘發(fā)一系列炎性反應。本研究結(jié)果表明，除以上信號通路外，紫杉醇還可激活IRAK1信號通路，IRAK1可顯著增加NF-κB信號通路相關的炎性因子如IL-6、IL-8和CXCL-1的表達，促進三陰乳腺癌細胞生長、轉(zhuǎn)移、耐受性和癌癥干細胞的表型。乳腺癌細胞增殖相關基因主要包括Cyclin D1、PCNA、Cyclin A。本研究顯示，經(jīng)抑制IRAK1表達的序列shRNA轉(zhuǎn)染后，紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株Cyclin D1、PCNA、Cyclin A相對表達水平降低。

ALDH可用于區(qū)分正常乳腺細胞和癌細胞，其活性可使用ALDEFLUOR試劑來檢測，ALDEFLUOR陽性的細胞與癌癥干細胞的行為相同，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16]。紫杉醇處理乳腺癌細胞株后，ALDH活性增強，但當IRAK1被shRNA下調(diào)后，這種現(xiàn)象顯著減弱。本研究結(jié)果表明，經(jīng)抑制IRAK1表達的序列shRNA轉(zhuǎn)染后，紫杉醇耐受的各乳腺癌細胞株ALDH活性下降。

Cullin 1是E3泛素連接酶SCF復合物的主要支架之一，該家族高度保守，主要包括Cullin 1、Cullin 2、Cullin 3、Cullin 4A、Cullin 4B、Cullin 5和Cullin 7，與多種細胞的遷移有關，如胚胎滋養(yǎng)層細胞、肝癌細胞、鱗狀細胞癌細胞、腎上腺皮質(zhì)腺瘤細胞、兒童成神經(jīng)管細胞瘤細胞、惡性胸膜間質(zhì)瘤細胞等[17]。本研究顯示，采用shRNA抑制IRAK1后，Cullin 1表達水平下降，紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株的遷移能力顯著降低。

研究報道Bcl-6可促進乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，是乳腺癌細胞遷移能力的標志物[18]，KLF6可抑制細胞增殖和遷移[19]。本研究結(jié)果表明，在紫杉醇耐受的乳腺癌細胞株中抑制IRAK1，可顯著降低Bcl-6的表達，促進KLF6的表達，最終抑制乳腺癌細胞的遷移。

綜上所述，IRAK1在紫杉醇耐受的乳腺癌細胞，尤其是三陰乳腺癌細胞中發(fā)揮重要作用，抑制IRAK1表達可顯著降低乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，誘導癌細胞凋亡。IRAK1在固有免疫系統(tǒng)中位于TLR信號通路下游，主要通過TRIF和Myd88調(diào)控下游的NF-κB和p38-Mcl-1信號通路，抑制IRAK1可同時降低NF-κB和p38-Mcl-1兩個信號通路的活性，這可能是IRAK1抑制劑降低乳腺癌耐受紫杉醇能力，降低癌細胞增殖和遷移能力，促進癌細胞凋亡的機制。因此，IRAK1抑制劑可用于乳腺癌尤其是三陰乳腺癌的治療，對改善乳腺癌患者預后具有重要意義。

作者貢獻：施華球進行課題設計與實施、資料收集整理、成文并對文章負責；謝瑞蓮進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Mechanisms of Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 1 in the Treatment for Breast Cancer Patients with Resistance to Paclitaxel

SHIHua-qiu*,XIERui-lian

DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China

*Correspondingauthor：SHIHua-qiu,Associateprofessor;E-mail：249870475@qq.com

Objective To investigate the mechanisms of interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAK1) in the treatment for breast cancer patients with resistance to paclitaxel.Methods From May 2013 to September 2015,the Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,collected breast tissues of 16 control female(breast fibrous tumor) and those of patients with differential subtypes of breast cancer,including 38 Basal-like breast cancer,25 Luminal-A breast cancer,31 Luminal-B breast cancer,31 HER2 overexpressed breast cancer,and 58 TNBC breast cancer.The relative expression level of IRAK1 mRNA in controls and different breast cancer patients were measured by real-time PCR.The level of inflammatory cytokines such as IL-6,IL-8,CXCL-1 were detected by ELISA.Breast cancer cell lines(HMEC,MCF7,MB415,MB436,MB468,BT549 and SUM159) were cultured.Through low concentration gradient increment combined with large dose intermittent shock,breast cancer cell lines obtained resistance to paclitaxel.The relative expression level of IRAK1 mRNA of various breast cancer cell lines with resistance to paclitaxel and without paclitaxel treatment were measured by real-time PCR.When breast cancer cell lines with resistance to paclitaxel were transfected by shRNA or blank sequence NC-shRNA,real-time PCR was performed to detect the relative expression level of proliferation-associated genes such as Cyclin D1,PCNA and Cyclin A,that of apoptosis-related genes such as p53,c-myc,Bcl-2 and c-erb-2,and that of migration-related genes such as Cullin 1,Bcl-6 and KLF6.ALDEFLUOR testing was used to detect the activity of aldehyde dehydrogenase(ALDH).Results The relative expression level of IRAK1 mRNA in various subtypes of paclitaxel-resistant breast cancer patients was much higher than that of the non-resistant patients(P<0.05).The relative expression level of IRAK1 mRNA in paclitaxel-resistant TNBC was higher than that of other subtypes of paclitaxel-resistant patients(P<0.05).The differences in the expression levels of IL-6,IL-8 and CXCL-1 between the controls and the various paclitaxel-resistant breast cancer patients showed statistical significance(P<0.05).The relative expression level of IRAK1 mRNA in various subtypes of paclitaxel-resistant breast cancer cell lines was higher than that of the cell lines without paclitaxel treatment(P<0.05).Compared with the paclitaxel-resistant breast cancer cell lines with NC-shRNA transfection,the various paclitaxel-resistant breast cancer cell lines with shRNA tranfection had lower Cyclin D1,PCNA,Cyclin A,Cullin 1 and Bcl-6 relative expression levels and lower ALDH activity,but higher p53,c-myc,Bcl-2,c-erb-2 and KLF6 relative expression levels(P<0.05).Conclusion IRAK1 plays an essential role in paclitaxel-resistance breast cancer cells especially in TNBC.When the expression of IRAK1 was inhibited,the proliferation and migratory ability could be remarkably decreased inducing abundant breast cancer cell apoptosis,so IRAK1 inhibitors could be used in breast cancer therapy especially in TNBC.

Breast neoplasms；Drug resistance,neoplasm；Interleukin-1 receptor-associated kinases；Cell proliferation；Apoptosis

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.02.009

2016-06-17；

2016-11-15)

341000江西省贛州市，贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科

*通信作者：施華球，副教授；E-mail：249870475@qq.com