廖 鳳，古文鵬，徐 聞，伏曉慶

云南省非O1/ O139群霍亂弧菌分子特征分析

廖 鳳1，古文鵬2，徐 聞2，伏曉慶2

目的 非O1/O139群霍亂弧菌能夠引起人類(lèi)急性腹瀉性疾病，但與O1群和O139群相比，人們往往容易忽視其危害性。因此，我們對(duì)分離于云南省的31株非O1/O139群霍亂弧菌開(kāi)展了分子特征分析。方法 采用紙片法(K-B)開(kāi)展抗生素敏感試驗(yàn)；多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增檢測(cè)毒力基因；同時(shí)，我們對(duì)菌株進(jìn)行了脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)序列分析(MLST)分子分型研究。結(jié)果 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，67.74%的菌株對(duì)利福平耐藥，對(duì)萘啶酸和復(fù)方新諾明的耐藥率為29.03%，所有的菌株對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感；PCR結(jié)果顯示，所有菌株的ompW基因?yàn)殛?yáng)性，87.10%的菌株hly基因?yàn)殛?yáng)性，25.81%的菌株rstREl tor為陽(yáng)性，16.13%的菌株rstRClassical和tcpAEl tor為陽(yáng)性，而CT、rfbO1和rfbO139基因全為陰性；PFGE結(jié)果顯示，31株非O1/O139群霍亂弧菌呈現(xiàn)出高度的離散趨勢(shì)，幾乎沒(méi)有相同帶型的菌株出現(xiàn)；在MLST結(jié)果分析中，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)gyrB新的等位基因，mdh基因發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新的等位基因，metE基因發(fā)現(xiàn)了6個(gè)新的等位基因，pntA中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的等位基因，purM中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新等位基因，pyrC中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新等位基因。經(jīng)過(guò)排列組合后，共發(fā)現(xiàn)了17個(gè)新的霍亂弧菌ST型別(ST273-ST289)。結(jié)論 非O1/O139群霍亂弧菌呈現(xiàn)出高度的多樣性特征，同時(shí)，云南省的非O1/O139群霍亂弧菌具有一定的地域特點(diǎn)，豐富了現(xiàn)有的霍亂弧菌分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)。

非O1/O139群霍亂弧菌；脈沖場(chǎng)凝膠電泳；多位點(diǎn)序列分析

云南省地處祖國(guó)的西南邊陲，與緬甸、越南等國(guó)家接壤，具有較長(zhǎng)的邊境線，是我國(guó)西南地區(qū)重要的橋頭堡。各國(guó)之間人員流動(dòng)來(lái)往頻繁，加之特殊的亞熱帶氣候，使之成為傳染病高發(fā)地區(qū)之一。自1986年至今，云南省的霍亂疫情時(shí)有發(fā)生，特別是近年來(lái)以輸入性和散發(fā)性病例為主要特征[1]。

非O1/O139群霍亂弧菌是指除了O1和O139群霍亂弧菌以外的其他血清群的霍亂弧菌[2-3]。非O1/O139群霍亂弧菌廣泛存在于外環(huán)境中，能夠引起人類(lèi)急性腹瀉，其臨床表現(xiàn)為輕癥胃腸炎或是腹瀉。到目前為止，在一些經(jīng)濟(jì)及衛(wèi)生條件比較落后的地方，幾乎每年都有非O1/O139群霍亂弧菌散發(fā)和局部暴發(fā)的報(bào)道[4]。部分地區(qū)，非O1/O139群霍亂弧菌的發(fā)病率已遠(yuǎn)高于O1和O139群[5]。而云南省因地處祖國(guó)的內(nèi)陸區(qū)域，加上人們的飲食習(xí)慣與沿海地區(qū)有較大差異，所以通過(guò)監(jiān)測(cè)分離得到的非O1/O139群霍亂弧菌較少。然而對(duì)于此類(lèi)菌株的分析和研究工作又格外重要。因此，我們對(duì)既往從云南省分離得到的31株非O1/O139群霍亂弧菌開(kāi)展了菌株的分子特征分析。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 31株非O1/O139群霍亂弧菌來(lái)源于自1986年至2016年間通過(guò)霍亂監(jiān)測(cè)分離得到的菌株，其中12株分離于1986年、1株分離于1989年、1株分離于1991年、1995年2株、1996年2株、1998年8株，2001年4株和2016年1株。從病人身上分離得到的菌株為5株、水中分離得到為9株，其余均為從外環(huán)境分離得到。

1.2 藥敏試驗(yàn) 采用K-B藥敏紙片法進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的微生物敏感試驗(yàn)執(zhí)行。采用ATCC25922大腸埃希氏菌為質(zhì)控菌株，選取10種抗生素作為研究對(duì)象。分別為：氨芐西林(AMP)，阿莫西林/克拉維酸(AMC)，頭孢噻吩(CFT)，頭孢噻肟(CTX)，GEN(慶大霉素)，萘啶酸(NAL)，環(huán)丙沙星(CIP)，四環(huán)素(TET)，利福平(RFA)和磺胺甲基異惡唑/甲氧芐啶(SMZ)。

1.3 PCR檢測(cè)毒力基因 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Tiangen, Beijing)提取霍亂菌株的核酸，按照說(shuō)明書(shū)的操作程序進(jìn)行。擴(kuò)增O1群和O139血清型菌株的rfb基因和霍亂弧菌屬ompW基因，給予菌株的確認(rèn)。采用SYBR premix(TaKaRa, Japan)預(yù)混液進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，在退火階段檢測(cè)熒光。擴(kuò)增毒力基因ctxAB(CT)、hly、rstR(Classical/Eltor)、tcpA(Classical/Eltor)，按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行檢測(cè)[1]，引物序列及擴(kuò)增程序見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]，擴(kuò)增采用Taq premix預(yù)混液(TaKaRa, Japan)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 PFGE 按照PulseNet公布的霍亂弧菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作過(guò)程進(jìn)行試驗(yàn)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[1]。采用CHEF-Mapper電泳儀(Bio-Rad)進(jìn)行電泳，參數(shù)設(shè)置為1～20 s，13 h；20～25 s，6 h。每塊膠的酶的用量為NotI 40 U，酶切溫度為37 ℃，酶切4 h。采用Gelred核酸染料進(jìn)行染色，采用凝膠成像儀(Bio-Rad, Gel DocXR)讀取圖像結(jié)果。采用BioNumberics V5.10軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，應(yīng)用非加權(quán)組平均法(UPGMA)，聚類(lèi)相似性系數(shù)(距離)采用基于條帶比較的Dice。

1.5 MLST 按照http://pubmlst.org/vcholerae公布的霍亂弧菌adk,gyrB,metE,mdh,pntA,purM和pyrC管家基因合成引物，采用Taq premix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明碩擎公司進(jìn)行序列測(cè)定。DNA序列結(jié)果采用DNAStar軟件進(jìn)行拼接，MEGA4.0軟件進(jìn)行結(jié)果的比較，同時(shí)在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找每個(gè)基因?qū)?yīng)的等位基因號(hào)。如果出現(xiàn)新的等位基因序列，則將序列提交給數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)，由數(shù)據(jù)庫(kù)給予新的等位基因號(hào)和ST型別。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，67.74%的菌株對(duì)利福平耐藥，對(duì)萘啶酸和復(fù)方新諾明的耐藥率為29.03%，5株從病人中分離得到的菌株對(duì)氨芐西林和阿莫西林耐藥；所有的菌株對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感，見(jiàn)表1。

2.2 PCR結(jié)果 所有菌株的霍亂弧菌屬ompW基因?yàn)殛?yáng)性，rfbO1和rfbO139基因全為陰性，因此確認(rèn)所有菌株均為非O1/O139群霍亂弧菌。在31個(gè)菌株中，87.10%的菌株hly基因?yàn)殛?yáng)性，25.81%的菌株rstREl tor為陽(yáng)性，16.13%的菌株rstRClassical和tcpAEl tor為陽(yáng)性，霍亂弧菌腸毒素(ctxAB)基因均為陰性。

2.3 PFGE結(jié)果 31株非O1/O139群霍亂弧菌呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性帶型分布特點(diǎn)，幾乎沒(méi)有相同的帶型菌株出現(xiàn)，見(jiàn)圖1所示。帶型分布與菌株的分離時(shí)間、來(lái)源等無(wú)關(guān)聯(lián)。

表1 云南省非O1/O139群霍亂弧菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果
Tab.1 Antibiotics resistant results of non O1/O139V.choleraein Yunnan Province

AntibioticsSensitive/NumberPercent(%)Medium/NumberPercent(%)Resistant/NumberPercent(%)AMP2683.8700.00516.13AMC2683.8700.00516.13CFT3096.7700.0013.23CTX3096.7700.0013.23GEN3110000.0000.00NAL2270.9700.00929.03CIP3110000.0000.00TBT2683.87412.9013.23RFA1032.2600.002167.74SMZ2270.9700.00929.03

圖1 云南省31株非O1/O139群霍亂弧菌PFGE聚類(lèi)圖Fig.1 PFGE results of 31 non-O1/O139 V. cholerae in Yunnan Province

2.4 MLST結(jié)果 在MLST結(jié)果分析中，我們發(fā)現(xiàn)了1個(gè)gyrB的新等位基因(87)，mdh基因發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新的等位基因(78-81)，metE基因發(fā)現(xiàn)了6個(gè)新的等位基因(161-165)，pntA中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的等位基因(94，95)，purM中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新等位基因(66-68)，pyrC中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新等位基因(123-126)。所有基因新發(fā)現(xiàn)的等位基因均由MLST公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)，并將序列提交到數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中。經(jīng)過(guò)7個(gè)管家基因的排列組合后，我們新發(fā)現(xiàn)了17個(gè)新的霍亂弧菌ST型別，被命名為ST273-ST289。所有菌株的MLST最小生成樹(shù)見(jiàn)圖2所示，除了ST8、ST85和ST87之外，其余所有ST型別均為本次研究首次發(fā)現(xiàn)。

圖2 云南省31株非O1/O139群霍亂弧菌MST圖Fig.2 MLST results of 31 non-O1/O139 V. cholerae in Yunnan Province

3 討 論

非O1/O139群霍亂弧菌是指除O1群和O139群霍亂弧菌以外的其他霍亂弧菌的總稱(chēng)。通常O1群和O139群霍亂弧菌致病菌株攜帶ctxAB、toxR、tcpA以及致病性毒力島等毒力基因，其中以ctxAB霍亂腸毒素為主要致病因素[6]。研究中，從云南省分離得到的所有31株非O1/O139霍亂弧菌的ctxAB基因均為陰性，不攜帶霍亂腸毒素，但有5株是分離于病人中的菌株，表明傳統(tǒng)認(rèn)為的非致病性菌株也能引起人類(lèi)的腹瀉性疾病。在31個(gè)菌株中，87.10%的菌株hly基因?yàn)殛?yáng)性，而且部分菌株具有tcpA毒力基因，所以在霍亂監(jiān)測(cè)體系中，非O1/O139群霍亂弧菌是一類(lèi)不容忽視的重要病原體。

既往的研究結(jié)果顯示，非O1/O139群霍亂弧菌是一類(lèi)高度多態(tài)性的菌株[7]。以PFGE為主要分型方法的報(bào)道顯示，這些菌株帶型分布廣泛，無(wú)論是環(huán)境分離株還是從病人中分離的菌株帶型呈現(xiàn)高度的多態(tài)性特征[8-9]。本次研究中也能反映出上述研究結(jié)論，在PFGE分型結(jié)果中，即使菌株分離于同一年份或是來(lái)源途徑相同，也幾乎沒(méi)有相同帶型的菌株出現(xiàn)。另一方面，從MLST分型結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)除了adk基因之外，其余所有的6個(gè)管家基因都有新的等位基因出現(xiàn)。我們將所有新發(fā)現(xiàn)等位基因序列提交數(shù)據(jù)庫(kù)，并得到了數(shù)據(jù)庫(kù)的確認(rèn)和新等位基因的命名，其中以metE基因發(fā)現(xiàn)的新等位基因個(gè)數(shù)最多，gyrB的等位基因新發(fā)現(xiàn)數(shù)最少，通過(guò)排列組合后，新發(fā)現(xiàn)了17個(gè)新的霍亂弧菌ST型別。由此可以看出，云南省非O1/O139霍亂弧菌具有自身的地域特點(diǎn)。研究組還對(duì)71株云南省分離的O1/O139群霍亂弧菌開(kāi)展了同樣的MLST分型研究，結(jié)果卻顯示所有菌株均為ST69型，這與非O1/O139菌株形成了鮮明的對(duì)比，分型結(jié)果提示致病性的O1/O139群霍亂弧菌在進(jìn)化過(guò)程中形成了較少的克隆群，與人類(lèi)的霍亂發(fā)生密切相關(guān)，而非O1/O139群則呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。同時(shí)MLST分型結(jié)果也提示目前基于7個(gè)管家基因的多位點(diǎn)序列分析對(duì)于非O1/O139群菌株可能更加適用。

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Molecular characteristics of non-O1/O139Vibriocholeraein Yunnan Province

LIAO Feng1, GU Wen-peng2, XU Wen2, FU Xiao-qing2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople'sHospitalofYunnanProvince,Kunming650022,China;2.YunnanProvincialCentersforDiseasesControlandPrevention,Kunming650022,China)

Non-O1/O139 group ofVibriocholeraecan cause human acute diarrhea disease, while compared with the O1 and O139 groups; it often ignore the risk of the disease for human being. Therefore, we analyzed the molecular characteristics of 31V.choleraeisolated from Yunnan Province. We used the agar disc diffusion method (K-B) to carry out the antibiotic sensitivity test; polymerase chain reaction (PCR) amplification for the detection of virulence gene; at the same time, all of strains were performed for pulse field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). The drug sensitivity test showed that 67.74% strains were resistant to rifampin, 29.03% resistant to nalidixic acid and cotrimoxazole, all of the isolates were sensitive to gentamicin and ciprofloxacin; PCR results showed that all strains had theompWgene, 87.10% strains hadhlygene, 25.81% strains hadrstREl tor, 16.13% strains hadrstRClassicalandtcpAEl tor, whileCTrfbO1andrfbO139gene were negative; PFGE results showed that 31 strains had a trend of discrete height, the same PFGE identity pattern was not nearly found; for the analysis of MLST, we found the one new alleles ofgyrB, four new alleles ofmdhgene, six new alleles ofmetEgene, two new alleles ofpntA, three new alleles ofpurMand four new alleles ofpyrCgene. After permutation and combination, we found 17 new ST types forV.cholerae(ST273-ST289). Non-O1/O139 groupV.choleraeshowed a high degree of diversity, while the non-O1/O139 group ofV.choleraein Yunnan Province has a certain geographical features, which enriched the existing molecular typing system ofV.cholerae.

non-O1/O139Vibrocholerae; pulsed field gel electrophoresis; multi locus sequence typing

Fu Xiao-qing, Email: yncdcfxq@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.010

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(No.2012ZX10004212)資助

伏曉慶，Email: yncdcfxq@163.com

1.云南省第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，昆明 650022； 2.云南省疾病預(yù)防控制中心，急性傳染病防制所，昆明 650022

R378.3

A

1002-2694(2017)01-0053-04

2016-07-20 編輯：梁小潔

Supported by the National Sci-Tech Key Project (No.2012ZX10004-212)