溫小玲孫新園歐陽健明

帶正電荷蛋白在納米/微米草酸鈣晶體上的吸附特性及其與帶負電荷蛋白吸附的比較

溫小玲孫新園歐陽健明＊

(暨南大學生物礦化與結石病防治研究所，暨南大學化學系，廣州510632)

研究尺寸分別為100nm和3μm的一水草酸鈣(COM)和二水草酸鈣(COD)晶體對帶正電荷的蛋白溶菌酶(LSZ)的吸附差異，并與帶負電荷的蛋白牛血清白蛋白(BSA)的吸附進行了比較。LSZ在納米/微米COM和COD晶體上的吸附都很好的擬合了Langmuir模型，屬于單分子層吸附。納米/微米COM和COD對LSZ的最大吸附量順序為COD-100nm＞COM-100nm＞COD-3μm＞COM-3μm；晶體的比表面積越大，曲率越小，晶體表面所帶電荷越負，晶體結晶水越多，均導致LSZ吸附量越大。體系離子強度和pH值亦影響LSZ的吸附。隨著NaCl濃度增加，LSZ的吸附量減小，說明Na+離子能與帶正電荷的蛋白LSZ競爭晶體表面的吸附位點，導致晶體表面吸附LSZ的位點減少。晶體對LSZ的最大吸附量都出現(xiàn)在LSZ的等電點附近(pH=10.7)；在pH= 5～8(生理條件)時，LSZ的吸附量隨pH值的增大而增大。本文結果提示，通過減小尿液的pH值或者適當增大尿液的離子強度，可以減小LSZ在尿微晶上的吸附量，有可能達到抑制草酸鈣結石的效果。

草酸鈣；帶正電荷的蛋白；溶菌酶；競爭吸附；離子強度；pH值

0 引言

尿液中蛋白質可以影響草酸鈣(CaOx)結石的形成[1-2]，但之前的報道大多研究的是帶負電荷的蛋白質[3-4]，關于帶正電荷的蛋白質對CaOx晶體生長影響的研究還很少[5]。然而，對結石基質中的有機成分分析表明，大多數(shù)蛋白質在生理條件下(pH=5～8)是帶正電荷的[6-7]。在尿液中帶正電荷的蛋白包括組織蛋白酶G(cathepsin G)、嗜酸性細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein)和髓過氧化物酶前體(myeloperoxidase precursor)等[7]，這些帶正電荷的蛋白富含堿性氨基酸側鏈如L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸等。溶菌酶(LSZ)是帶正電荷蛋白的代表物質，在腎結石中普遍存在。人體腎發(fā)生損傷時會導致LSZ濃度增加，LSZ在腎病患者尿液中的濃度(0.45～11.6mg·L-1)比正常人(0.08～0.13mg·L-1)高[8]。Farmanesh等[9]研究了LSZ對一水草酸鈣(COM)結晶的影響，發(fā)現(xiàn)LSZ能促進COM晶體的生長，而且在較大的濃度范圍(0～100μg·mL-1)內，LSZ都是作為COM晶體的生長促進劑。相比之下，帶負電荷的牛血清白蛋白(BSA)是COM晶體的生長抑制劑[4]，我們猜測蛋白質作為COM晶體生長促進劑或抑制劑與蛋白質本身的荷電情況有關。

前文[5,10]我們比較研究了不同尺寸(50nm、100nm、1μm、3μm和10μm)的COM和二水草酸鈣(COD)晶體對陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)的吸附差異。由于表面活性劑所帶電荷不同，所以表面活性劑與晶體之間存在的相互作用也不同。CTAB分子主要依靠靜電作用吸附到COM和COD晶體表面[5]；而NP-40主要依靠氫鍵作用和配位作用吸附到COM和COD晶體表面[10]。CTAB和NP-40的吸附使得晶體的ζ電位絕對值增大，有利于抑制晶體的聚集。而且由于NP-40與晶體之間的作用力比CTAB的弱，導致NP-40的吸附量比CTAB少，所以NP-40對溶液中COD的穩(wěn)定作用較差，會有部分的COD轉化為COM晶體。

上述表面活性劑是小分子，這些小分子和尿微晶之間的相互作用可能與大分子不同，因為大分子可以通過多個位點與草酸鈣晶體結合，并參與尿石形成，包括晶體成核、生長和聚集[11]。成核促進劑可以產生大量小晶體消除尿液的過飽和，而且小晶體在參與結石形成之前可以被沖出腎臟，但這種保護機制只有當抑制劑能抑制小晶體粘附到腎上皮細胞的情況下才能發(fā)揮作用[12]。LSZ帶正電荷，而細胞膜帶負電荷，細胞膜與LSZ分子之間存在靜電相互作用，這可能導致吸附了LSZ的晶體更容易粘附到腎上皮細胞表面而滯留在腎臟中?；诖?，本文研究了LSZ與不同尺寸COM、COD晶體之間的吸附特性和相互作用，并與帶負電荷的蛋白BSA進行比較，期望通過控制尿液條件來達到抑制草酸鈣腎結石的目的。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

溶菌酶(LSZ,Amesco,北京夢怡美生物公司)，PBS磷酸鹽緩沖溶液(北京索萊寶科技有限公司)，其它常規(guī)試劑為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

Varian Cary 500型紫外可見分光光度計(美國Varian公司)。Zetasizer Nano-ZS型納米粒度儀(英國Malvem公司)。數(shù)字酸度計(PHS-3C,鄭州寶晶電子科技有限公司)。

1.2 納米/微米COM、COD晶體的合成方法

參照前文[13]合成尺寸分別約為100nm和3μm的COM、COD晶體，并分別用COM-100nm,COD-100nm,COM-3μm,COD-3μm表示。XRD和FTIR表明所合成的晶體為純的目標產物。

1.3 LSZ標準曲線測定

參照文獻[14]進行，取一組比色管，分別加入0.4, 0.8,1.2,1.6,2,2.4,3,4和5mL 1mg·mL-1的LSZ標準溶液，用PBS緩沖溶液(pH=7.3±0.1)定容至10mL，以PBS溶液為參比于280nm處測定LSZ溶液的吸光值(A)。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到LSZ標準曲線，其線性方程為：y=1.9344x+0.0043；R2=0.9998。

1.4 LSZ吸附等溫線測定

在文獻[15]的基礎上進行。稱取50mg COM或COD晶體各9份于25mL燒杯中，分別加入預先配置好的濃度(C0)為0,2,4,6,8,10,12,15,20mg· mL-1的LSZ標準溶液10mL，超聲10min至完全分散，密封后放入37℃恒溫干燥箱中，吸附24h后取出離心；取上清液適量，測定剩余LSZ濃度(Ceq)和懸浮液的ζ電位。根據(jù)公式計算出晶體對LSZ的吸附量Qe。以C0為橫坐標，Qe為縱坐標繪制吸附等溫線。為了消除比表面積的影響，根據(jù)公式得到比表面積歸一化的吸附量，即每單位面積上吸附的LSZ質量。

1.5 pH值對體系ζ電位的影響

參照文獻[16-17]的方法測量不同pH值下LSZ的ζ電位。取8個小燒杯，各加入0.5mg·mL-1LSZ溶液10mL，用10μL微量注射器滴加濃度為0.25mol· L-1的HCl或NaOH調節(jié)其pH值分別至4,5,6,7, 8,9,10和11，然后取約1mL懸浮液加入電位池中，測量對應的ζ電位。COM和COD晶體的等電點記為PZCCaOx，LSZ的等電點記為PILSZ。

ζ電位的獲得是通過測定體系的電泳遷移率，運用Smoluchowski方程計算出來，Smoluchowski方程如下：其中ζ是ζ電位，UE是電泳遷移率，ε是介電常數(shù)，η是粘度。

1.6 pH值對吸附的影響

稱取50mg COM或COD晶體各8份于16個25mL燒杯中，分別加入初始濃度(C0)為1mg·mL-1LSZ標準溶液10mL。超聲10min至完全分散后，調節(jié)pH值分別至4,5,6,7,8,9,10和11。密封后放入37℃恒溫干燥箱中，吸附24h后，取出離心，取上清液適量測定剩余LSZ濃度(Ceq)，計算出晶體對LSZ的吸附量(Qe)。以pH值為橫坐標，Qe為縱坐標繪制吸附曲線。

1.7 離子強度對吸附的影響

參照文獻[18]進行。準確稱取6份各100mg LSZ固體，加入預先配制的用pH=7.3的PBS緩沖溶液溶解的不同濃度的NaCl溶液(濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、1000mmol·L-1)，定容至100mL，備用。取12個小燒杯，其中6份各加入50mg的COM，另6份各加入50mg的COD晶體，再加入10mL上述配制好的LSZ溶液，超聲5min至完全分散，密封后，放入37℃水浴鍋中吸附24h，離心，測量上清液剩余LSZ濃度(Ceq)，同時測量懸浮液的ζ電位。根據(jù)公式計算出晶體對LSZ的吸附量(Qe)。以NaCl濃度的對數(shù)值(lgCNaCl)為橫坐標，Qe為縱坐標繪制吸附曲線。

2 結果與討論

2.1 吸附等溫線

LSZ在納米/微米COM和COD晶體上的吸附等溫線如圖1A所示。LSZ的最大吸附量(每克晶體吸附的LSZ質量)順序為COD-100nm＞COM-100nm＞＞COD-3μm＞COM-3μm，即在納米晶體上的吸附量遠大于微米晶體(表1)，說明LSZ的吸附量與晶體的比表面積呈正相關，因為納米晶體的比表面積遠大于微米晶體(表1)。

圖1 LSZ在納米/微米COM和COD的吸附等溫線Fig.1Adsorption isotherms of LSZ on nano/micron COM and COD

表1 納米/微米COM、COD的性質及其對蛋白質的最大吸附量Table 1Properties of nano/micron COM,COD and the maximum adsorption quantity to proteins

比表面積歸一化后的吸附量如圖1B所示。將表面積歸一化，LSZ的最大吸附量(每平方米晶體表面吸附的LSZ質量)順序變?yōu)镃OD-3μm＞COM-3μm＞COM-100nm≈COD-100nm，即微米晶體的吸附量遠大于納米晶體。這是因為微米晶體具有較高的電荷密度，其表面ζ電位更負(表1)，因此，單位面積上可以吸附更多帶正電的LSZ分子；表面曲率也是一個重要的影響因素，隨著晶體尺寸的減小，粒子的曲率增加，使得LSZ分子與晶體之間的接觸位點減少[19]，即納米晶體與LSZ分子之間存在更少的接觸位點；加上納米晶體的聚集比微米晶體嚴重[17]，晶體的聚集減少了其用于吸附的暴露表面，因此比表面積歸一化后，納米晶體吸附量小于微米晶體。

由圖1A可以看出，無論是納米晶體還是微米晶體，COD對LSZ的吸附大于同尺寸的COM。這是因為納米COD的比表面積大于COM(表1)，使LSZ傾向于吸附COD上；而微米晶體的比表面積相近，LSZ傾向于吸附到ζ電位更負和親水性更好的COD上。

比表面積歸一化后，納米COM的吸附量與納米COD晶體相近(圖1B)，這是因為COM晶體接近中性(表1)，導致覆蓋在晶體表面的蛋白層密度更高[20]，即LSZ傾向于吸附到納米COM上；而親水性使LSZ傾向于吸附到COD上，兩種因素對LSZ的吸附作用剛好相反，使LSZ在納米COM、COD上的吸附沒有出現(xiàn)明顯差異；對于微米晶體，COD的ζ電位更負(表1)，且親水性更好，所以微米COD的吸附大于微米COM。

前文[17]我們研究了帶負電荷的蛋白牛血清白蛋白(BSA)，與本文的帶正電荷的蛋白LSZ相比(表1)，對于納米晶體，LSZ的吸附量比BSA??；而對于微米晶體，LSZ的吸附量比BSA的稍大。前者是因為納米晶體的曲率比微米晶體大，而LSZ是內部結構穩(wěn)定的蛋白(硬蛋白)，使得LSZ分子與納米晶體之間的接觸位點較少。而BSA是具有低內聚力的蛋白(軟性蛋白)，可以通過改變其構象適應晶體表面，使得BSA分子能很好的吸附在納米晶體表面。而對于微米晶體，晶體曲率的影響較小，主要是晶體與蛋白質之間相互作用的影響；由于LSZ吸附由靜電力驅動，而BSA吸附由氫鍵驅動[17]，靜電作用比氫鍵作用強，所以LSZ的吸附量會稍大于BSA。這與文獻[21]的結果一致，他們用電泳法證明BSA和LSZ均能結合到微米COM晶體上，且LSZ的吸附量稍大于BSA。

2.2 吸附等溫線擬合

吸附模型最常用的是Langmuir模型和Freundlich模型，因此我們選擇這兩種模型處理實驗數(shù)據(jù)。Langmuir模型等溫吸附方程為模型等溫吸附方程為lgCe+lgKf，其中Qe為平衡時的吸附量，Ce為平衡時的溶液濃度，Q0為飽和吸附量，b是Langmuir等溫吸附方程式常數(shù)，Kf為吸附系數(shù)，n為常數(shù)[22]。根據(jù)吸附等溫線方程，對吸附實驗結果分別進行擬合，結果如圖2所示，可以看出，4個晶體均很好地擬合了Langmuir模型(圖2a,2c)，而與Freundlich模型(圖2b,2d)差異較大，說明LSZ在納米/微米COM和COD晶體上的吸附屬于單分子層吸附，LSZ的這種吸附等溫線擬合結果與BSA的結果一致[17]，推測蛋白質在COM和COD晶體上吸附均為單分子層吸附。

圖2 納米/微米COM和COD晶體對LSZ吸附等溫線的擬合結果Fig.2Fitting results of adsorption isotherms of LSZ on nano/micron COM and COD

尿液中的蛋白質吸附在尿微晶表面后，可以封閉尿微晶表面的生長位點，改變晶體表面電荷密度，從而改變尿微晶的生長和聚集過程，影響CaOx結石的形成。Wesson等[23]研究了凝血酶原片段1(PTF1)、骨橋蛋白(OPN)和腎鈣素(NC)這3種蛋白對CaOx晶體生長的影響，結果表明這些蛋白都能促進COD的形成，從而減小晶體與細胞的粘附；Grover等[24]比較了TH蛋白、人血清白蛋白(HSA)、α1-微球蛋白和PTF1對草酸鈣晶體聚集的影響，表明這4種蛋白都能抑制草酸鈣晶體的聚集，且PTF1抑制草酸鈣的聚集的能力最強，能顯著抑制草酸鈣晶體的沉積。這些結果表明，上述蛋白質可以抑制草酸鈣腎結石的形成。

2.3 吸附LSZ后ζ電位變化

圖3為納米/微米COM和COD吸附LSZ后的ζ電位變化，各晶體的ζ電位絕對值順序為：COD-100nm＞COM-100nm＞COD-3μm＞COM-3μm，與吸附量順序(圖1A)一致，這進一步驗證了晶體對于LSZ的吸附，因為吸附的LSZ分子越多，晶體表面的正電荷越大，對應的ζ電位越正。由于微米晶體自身的ζ電位較負(表1)，且吸附量較少，所以在吸附LSZ后仍為負值或帶少量的正電荷。LSZ分子比BSA小[25]，使得單位面積的晶體表面吸附更多的LSZ分子，所以LSZ的吸附能明顯改變晶體的ζ電位，甚至使帶負電荷的晶體變成帶正電荷的。這與Kandori等的研究一致[26]，他們研究不同蛋白質在鈣羥基磷灰石上的吸附，雖然LSZ的吸附量比BSA小，但是吸附LSZ后晶體的ζ電位變化值卻比BSA大。

圖3 納米/微米COM和COD晶體吸附LSZ后的ζ電位Fig.3ζ potential of nano/micron COM and COD after LSZ adsorption

吸附的LSZ晶體表面的ζ電位變正，而吸附BSA后晶體表面的ζ電位變負[17]。這是因為LSZ是帶正電荷的蛋白，等電點(pI)大于10.5[27]，所以在pH=7.3(人體pH值)的PBS溶液中帶正電荷；而BSA是帶負電荷的蛋白，等電點為4.8，所以在pH=7.3的PBS溶液中帶負電荷。

2.4 離子強度對吸附量和ζ電位的影響

圖4 離子強度對LSZ吸附量及體系ζ電位的影響Fig.4Effect of ionic strength on LSZ adsorption quantity and ζ potential of the system

圖4為離子強度對LSZ吸附量及體系ζ電位的影響。LSZ在納米/微米COM、COD晶體表面的吸附量隨NaCl濃度的增加而減小(圖4a)，但對應的體系ζ電位隨NaCl濃度的增加而變正(圖4b)，說明Na+吸附到了納米/微米COM、COD晶體表面，使得晶體表面ζ電位變正，由于靜電斥力導致其對帶正電荷的蛋白LSZ的吸附量減少。

離子強度影響LSZ在草酸鈣晶體表面吸附的模型如圖5所示。沒有加NaCl時(圖5a)，LSZ帶正電的基團與CaOx晶體表面帶負電的位點結合，通過靜電引力吸附到晶體表面。加入NaCl后，Na+離子和LSZ形成競爭吸附(圖5b)，晶體表面的部分吸附位點被Na+占據(jù)(圖5c)，導致LSZ的吸附量隨NaCl濃度的增加而減小。這與文獻[28]報道的一致：當Na+離子濃度足夠大時，它可以取代特定的被吸附物質。

2.5 pH值對吸附的影響

在pH=4～11范圍內納米/微米COM、COD對LSZ的吸附量(Qe)如圖6所示。4種晶體對LSZ的最大吸附量都出現(xiàn)在LSZ的等電點附近(pH=10.7)。這是因為在等電點附近LSZ分子顯中性，吸附在晶體表面的LSZ分子之間的靜電斥力最小，吸附層的LSZ分子最緊湊排列，所以吸附量達到最大。當pH＜10.7時，LSZ的吸附量隨pH值的增大而增大。

在pH＜PZCCaOx時，隨著pH值的增大，LSZ和晶體的ζ電位絕對值均減小，使得晶體與LSZ之間的靜電斥力和LSZ分子之間的橫向靜電排斥作用減小，所以吸附量隨pH值的增大而增大；而在pH＞pILSZ(10.7)時，隨著pH值的增大，LSZ和晶體的ζ電位絕對值增大，使得晶體與LSZ之間的靜電斥力和LSZ分子之間的橫向靜電排斥作用增大，所以吸附量隨pH值的增大而減小。

在PZCCaOx＜pH＜pILSZ時，LSZ分子的ζ電位絕對值隨pH值的增大而減小，導致LSZ分子之間的靜電排斥作用減小，所以吸附量隨pH值的增大而增大。這與BSA吸附的結果不同[17]，這是因為在pIBSA＜pH＜PZCCaOx時，BSA分子的ζ電位絕對值隨pH值的增大而增大，使得BSA-CaOx之間的靜電作用和BSA-BSA之間的橫向靜電排斥作用增大，吸附量隨pH值的增大而減小。

圖5 離子強度影響LSZ在草酸鈣晶體表面吸附的模型圖Fig.5Model of LSZ adsorption on nano/micron COM and COD affected by ionic strength

以COM-3μm晶體為例(表2)，用ζ電位數(shù)據(jù)來表征LSZ與COM、COD晶體之間的相互作用，其他晶體情況與此晶體類似。在pH=4或pH=11時，COM-3μm和LSZ帶相同電荷，靜電斥力作用使得吸附量下降。而在pH值為9和10時，COM-3μm帶負電荷，LSZ帶正電荷，晶體與蛋白之間存在靜電引力作用，吸附量上升。由于在pH值為10時，LSZ的ζ電位(+2.20mV)小于其在pH值為9時的ζ電位(+4.49mV)，因此，pH=10時，LSZ分子之間的橫向靜電斥力較小，吸附量則較大。

由圖6可知，在生理條件下(pH=5～8)，LSZ的吸附量隨pH值的增大而增大，相比之下，BSA的吸附量隨pH值的增大而減小[17]。推測人體尿液pH值升高時，會增大LSZ在尿微晶上的吸附，并減小BSA在尿微晶上的吸附，從而增加草酸鈣結石形成的風險。

圖6 pH值對LSZ在納米/微米COM、COD表面吸附量的影響及不同pH值下晶體和LSZ的ζ電位Fig.6Change of LSZ adsorption quantity and ζ potential of nano/micron COM and COD crystals with equilibrium pH value

表2 不同pH值下COM-3μm、LSZ的ζ電位及對應的LSZ吸附量Table 2ζ potential of COM-3μm and LSZ at different pH values and corresponding adsorption quantities of LSZ

3 結論

納米/微米COM、COD晶體對帶正電荷的蛋白LSZ的吸附等溫線很好的擬合了Langmuir模型，表明LSZ是單分子層吸附。LSZ的吸附量與晶體的性質密切相關，當晶體的比表面積越大，曲率越小，晶體表面所帶電荷越負，晶體親水性越好時，其對LSZ吸附量越大；當晶面電荷接近中性時，吸附量也會增大。LSZ的吸附量還與體系的條件有關，體系離子濃度增加會導致LSZ的吸附量減?。划旙w系pH值在LSZ的等電點附近時，吸附量最大。通過減小溶液的pH值或增大溶液離子強度可以減少LSZ在納米/微米COM和COD晶體上的吸附，有可能達到抑制草酸鈣結石形成的效果。

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Adsorption Properties of Cationic Protein on Nano/Micron Calcium Oxalate Crystals and a Comparison with Anionic Protein Adsorption

WEN Xiao-LingSUN Xin-YuanOUYANG Jian-Ming＊
(Institute of Biomineralization and Lithiasis Research,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

The adsorption difference of cationic protein lysozyme(LSZ)on calcium oxalate monohydrate(COM) and calcium oxalate dihydrate(COD)crystals with a size of 100nm and 3μm,respectively,were investigated and compared with that of anionic protein bovine serum albumin(BSA).All of the adsorption isotherms were fitted better with Langmuir model,indicating a monolayer adsorption of LSZ on nano/micron COD and COM surface.The maximum adsorption quality of LSZ follows the order:COD-100nm＞COM-100nm＞COD-3μm＞COM-3μm.That is,the greater the specific surface area is,the smaller the crystal curvature would be,so the greater of LSZ adsorption amount was generated;and the more negative charges and the more crystal water on crystal surface also result in the greater of LSZ adsorption.The ionic strength and pH value of system can also affect LSZ adsorption.With the concentration of NaCl increases,the adsorption quantity of LSZ reduced,it indicated that Na+ions and cationic LSZ form a competitive adsorption,which reducing the adsorption sites of LSZ.The maximum adsorption of LSZ appears at the isoelectric point of LSZ(pH=10.7).In pH=5～8(physical condition),LSZ adsorption quantity increases with the increase of pH value.The results suggest that the adsorption quality of LSZ on nano/micron COM and COD crystals can be reduced by reducing the pH value orincreasing the ionic strength of urine appropriately,and thus the formation of CaOx urinary stones maybe inhibited.

calcium oxalate;cationic protein;lysozyme;competitive adsorption;ionic strength;pH value

R69;R329;O614.23+1

A

1001-4861(2017)01-0049-08

10.11862/CJIC.2017.013

2016-05-14。收修改稿日期：2016-11-11。

國家自然科學基金（No.21371077）資助項目。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：toyjm@jnu.edu.cn