李嬋君，王毅紅，王彥超，董素靜，段鹿梅

（鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，鄭州 450006）

QuEChERS前處理聯(lián)合UPLC–MS／MS法檢測(cè)花生中22種農(nóng)藥殘留

李嬋君，王毅紅，王彥超，董素靜，段鹿梅

（鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，鄭州 450006）

建立了QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）前處理聯(lián)合UPLC–MS／MS法檢測(cè)花生中22種農(nóng)藥殘留的方法。樣品用10 mL乙腈提取，以多壁碳納米管、N-丙基乙二胺為吸附劑，對(duì)2 mL提取液進(jìn)行凈化，凈化液稀釋至2倍體積，以MRM掃描方式、正負(fù)離子模式同時(shí)分析。22種農(nóng)藥在10，20，50 μg／kg 3個(gè)添加水平下，平均回收率為70.6%～121.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%（n=6）；多菌靈、抗蚜威、撲草凈在0.05～10μg／L，啶蟲(chóng)脒、氟蟲(chóng)腈砜、苯醚甲環(huán)唑、噠螨靈、嘧霉胺、嘧菌酯在0.5～20 μg／L，烯酰嗎啉、噻蟲(chóng)嗪、氟啶脲、滅幼脲、吡蟲(chóng)啉、甲維鹽、除蟲(chóng)脲、氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈亞砜、咪鮮胺、二甲戊靈在0.5～50 μg／L之間，阿維菌素在0.5～100 μg／L范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.995 0。22種農(nóng)藥的定量限在2 μg／kg以下，遠(yuǎn)低于各待測(cè)農(nóng)藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRL)。該法適于花生中農(nóng)藥殘留的同時(shí)快速檢測(cè)。

QuEChERS；超高液相串聯(lián)質(zhì)譜法；花生；農(nóng)藥殘留

花生是我國(guó)重要的糧油作物之一，我國(guó)是世界上花生總產(chǎn)量和花生油總產(chǎn)量最大的國(guó)家，同時(shí)，我國(guó)也是世界第一花生出口大國(guó)。隨著國(guó)際花生貿(mào)易的發(fā)展，工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家越來(lái)越將農(nóng)藥殘留作為限制花生出口的技術(shù)性貿(mào)易壁壘，同時(shí)更加嚴(yán)格地規(guī)定了對(duì)進(jìn)口花生的檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)，這些規(guī)定對(duì)我國(guó)花生出口產(chǎn)生了較大壓力，也對(duì)我國(guó)花生中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。

花生中含有大量油脂，同時(shí)富含高蛋白和色素，這些物質(zhì)如果在樣品前處理過(guò)程中不能去除完全，將給后續(xù)的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)造成很多困難［1–2］。我國(guó)尚未對(duì)花生中的農(nóng)藥多殘留分析形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［3–4］，花生中的農(nóng)藥多殘留分析要參考多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)項(xiàng)目，這些不同的標(biāo)準(zhǔn)不僅前處理方法不盡相同，而且檢測(cè)所需的分析儀器也不同，涉及到的樣品前處理和分析方法有分散固相萃?。?］、基質(zhì)固相分散輔助加速溶劑萃取、凝膠滲透色譜、液相色譜、氣相色譜以及色譜–質(zhì)譜聯(lián)用等［5–10］。另外，傳統(tǒng)的分析方法操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，很難滿(mǎn)足對(duì)農(nóng)藥多殘留高效快速篩查與分析的需求。

近年來(lái)，以石墨稀為結(jié)構(gòu)單元的碳納米管的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用飛速發(fā)展，得到了各國(guó)研究者的高度關(guān)注。因其直徑為納米級(jí)，比表面積大，擴(kuò)散距離短，對(duì)多種有機(jī)化合物具有良好的吸附性，只需使用少量的吸附劑即可在較短的平衡時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)萃取分離，因此碳納米管被廣泛用于各種藥物分析中［11–18］。另外，碳納米管還可以與傳統(tǒng)的固相萃取凈化材料如石墨化碳黑（GCB）、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅膠(C18)等混合使用，實(shí)現(xiàn)更顯著的凈化效果。

筆者用10 mL乙腈提取花生樣品，以多壁碳納米管、PSA為吸附劑對(duì)2 mL提取液進(jìn)行凈化，凈化液稀釋至2倍體積，使用Waters Xevo TQ–S液質(zhì)聯(lián)用儀，6 min內(nèi)完成22種農(nóng)藥上機(jī)分析。采用基質(zhì)加標(biāo)法進(jìn)行定量，該方法消除花生基質(zhì)干擾的效果好，分析快速高效，靈敏度高，為花生樣品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters Xevo TQ–S型，美國(guó)Waters公司；

渦旋混合器：Hedolph Multi Reax型，德國(guó)海爾道夫公司；

高速冷凍離心機(jī)：SIGMA 3K15型，德國(guó)Sigma公司；

純水機(jī)：Milli-Q Advantage A10型，法國(guó)Millipore公司；

震蕩器：SHA–C型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

無(wú)水硫酸鎂：分析純，使用前于650℃下灼燒4 h，天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng)；

氯化鈉：分析純，使用前于650℃下灼燒2 h，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)Merck公司；

甲酸：色譜純，美國(guó)Tedia公司；

多壁碳納米管（MWCNTs）：直徑大于50 nm，長(zhǎng)度為10～20 μm，純度為98%，比表面積為40 m2／g，南京先豐科技有限公司；

GCB，PSA，C18：美國(guó)Agilent公司；

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：分別為烯酰嗎啉、噻蟲(chóng)嗪、氟啶脲、滅幼脲、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、多菌靈、甲維鹽、阿維菌素、除蟲(chóng)脲、氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈砜、苯醚甲環(huán)唑、噠螨靈、嘧霉胺、抗蚜威、咪鮮胺、嘧菌酯、二甲戊靈、撲草凈，質(zhì)量濃度均為1 000 mg／L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科學(xué)監(jiān)測(cè)所；

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：100 mg／mL，準(zhǔn)確吸取1 mL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，噻蟲(chóng)嗪、多菌靈、吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、烯酰嗎啉、除蟲(chóng)脲、滅幼脲、甲維鹽、氟啶脲、阿維菌素、噠螨靈用甲醇定容，抗蚜威、嘧霉胺、嘧菌酯、撲草凈、咪鮮胺、氟蟲(chóng)腈、苯醚甲環(huán)唑、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜、二甲戊靈用丙酮定容，于–18℃冰箱中密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?，根?jù)需要用溶液稀釋成相應(yīng)濃度的單標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別移取一定量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于–18℃冰箱中密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?，根?jù)需要用乙腈稀釋為系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；

花生樣品：采樣于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市等流通環(huán)節(jié)，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后備用；

實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水，用Millipore純水機(jī)制得。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜

色譜柱：ACQUITY–UPLC–BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm，美國(guó)Waters公司）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為5 mmol／L乙酸銨–0.02%甲酸水溶液，流量為0.3 mL／min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：正離子模式為3.0 kV，負(fù)離子模式為2.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1 000 L／h；錐孔氣流量：50 L／h；載氣：氮?dú)?；碰撞氣體：氬氣。

22種農(nóng)藥的總離子流圖見(jiàn)圖1，質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

圖1 22種農(nóng)藥的總離子流圖

表2 22種農(nóng)藥的質(zhì)譜采集參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱(chēng)取勻漿后的5.0 g樣品于帶蓋的聚丙稀離心管中，加入超純水5 mL，渦旋使水充分浸潤(rùn)樣品，靜置20 min，加入乙腈溶液10 mL，振蕩15 min，再加入1 g NaCl和4 g無(wú)水MgSO4，振蕩30 s，以5 000 r／min冷凍離心5 min。吸取離心后所得上層清液2.0 mL于預(yù)先加入300 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA和10 mg MWCNTs的離心管中，立即渦旋30 s，然后以8 000 r／min冷凍離心5 min。吸取上清液0.50 mL，加入0.50 mL超純水，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，以UPLC–MSMS法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

試驗(yàn)考察22種農(nóng)藥在乙腈–水、甲醇–水流動(dòng)相體系中的分離度、色譜峰形及響應(yīng)值，結(jié)果表明絕大多數(shù)化合物在乙腈–水體系中獲得較好的色譜峰。與甲醇相比，乙腈黏度較小，系統(tǒng)壓力較低，所以選擇乙腈–水體系作為流動(dòng)相。在水溶液中加入乙酸銨，分別用2 mmol／L乙酸銨–0.02%甲酸、5 mmol／L乙酸銨–0.02%甲酸、2 mmol／L乙酸銨–0.1%甲酸、5 mmol／L乙酸銨–0.1%甲酸為流動(dòng)相分析化合物，發(fā)現(xiàn)隨著甲酸比例減少、乙酸銨濃度的增加，大部分化合物的離子化效率、目標(biāo)物的響應(yīng)值都有提高，特別是多菌靈的色譜峰形有明顯改善，因此選擇5 mmol／L乙酸銨–0.02%甲酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相。

2.2 樣品浸泡對(duì)回收率的影響

花生樣品中含有較多的油脂，加入乙腈提取時(shí)，樣品不易分散開(kāi)，影響目標(biāo)物的提取效率。試驗(yàn)考察了不加水與加水浸泡提取對(duì)樣品中目標(biāo)物回收率的影響，當(dāng)加水量與樣品量比例為1∶1(質(zhì)量比)時(shí)，實(shí)現(xiàn)樣品的完全浸潤(rùn)并分散。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與樣品前處理過(guò)程加水提取相比，在不加水提取時(shí)，大部分目標(biāo)物回收率無(wú)顯著差別，而多菌靈、吡蟲(chóng)啉回收率有較大變化，回收率從不加水時(shí)的30%，70%分別提高到加水后的約80%，100%。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，樣品前處理過(guò)程選擇按樣品比例1∶1加水的提取方式。

2.3 吸附劑組合用量的優(yōu)化

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）方法的原理是利用凈化劑與樣品基質(zhì)中干擾物質(zhì)的相互作用吸附雜質(zhì)，從而凈化基質(zhì)。傳統(tǒng)QuEChERS方法使用較多的凈化劑材料有PSA，C18，GCB等。本實(shí)驗(yàn)采用多壁碳納米管MWCNTs和傳統(tǒng)凈化材料組合：MWCNTs／PSA／MgSO4，C18／PSA／MgSO4，GCB／PSA／MgSO4，比較其凈化效果，稱(chēng)取5 g空白花生樣品并添加0.5 μg／mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.2 mL，按照1.3方法提取。提取液分別用以上3組吸附劑組合進(jìn)行凈化處理。從凈化后定容溶液的混濁度來(lái)看，MWCNTs／PSA／MgSO4組合凈化后的提取液最為澄清，凈化效果最好；其次為C18／PSA／MgSO4組合；GCB／PSA／MgSO4組合凈化后的提取液最為混濁，脂肪含量較多，凈化效果最差。使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液制備工作曲線(xiàn)進(jìn)行校正，得到不同吸附劑處理樣品處理后各目標(biāo)物的加標(biāo)回收率，結(jié)果表明MWCNTs／PSA／MgSO4組合的回收率與C18／PSA／MgSO4組合的回收率相差不大，但明顯優(yōu)于GCB／PSA／MgSO4組合的回收率。綜合不同類(lèi)型吸附劑組合的凈化效果和加標(biāo)回收率，最終選擇MWCNTs／PSA／MgSO4作為前處理過(guò)程的凈化吸附劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)和定量限

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。根據(jù)各化合物不同的靈敏度選定合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度范圍，分別對(duì)各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行UPLC–MSMS分析，以各組分色譜峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(c，ng／mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，22種分析物在不同的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995 0，化合物定量限(LOQ，S／N=10)在0.01～2.0 μg／kg之間，滿(mǎn)足歐盟和日本等規(guī)定的最大殘留限量要求，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，繪制了花生基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，對(duì)22種農(nóng)藥在花生樣品中的加標(biāo)回收率進(jìn)行考察。在10，20，50 μg／kg 3個(gè)加標(biāo)濃度水平下，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，22種農(nóng)藥的平均回收率在70.6%～121.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%～9.3%（n=6）?；厥章屎途芏染鶟M(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表3 22種農(nóng)藥的線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件建立了QuEChERS前處理方法聯(lián)合液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速檢測(cè)花生中22種農(nóng)藥殘留的方法。采用乙腈提取，以PSA，MWCNTs作為吸附對(duì)樣品進(jìn)行凈化，定容后進(jìn)行UPLC–MS／MS檢測(cè)。此方法簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，節(jié)約了分析時(shí)間，有機(jī)溶劑用量少，具有較好的準(zhǔn)確度、較高的靈敏度與回收率，能有效凈化花生中的雜質(zhì)，定量限能滿(mǎn)足目前國(guó)內(nèi)外花生中相應(yīng)藥物殘留檢測(cè)的要求，實(shí)現(xiàn)了對(duì)花生中農(nóng)藥多殘留的同時(shí)分析，是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的樣品前處理與分析技術(shù)。

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表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

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Determination of 22 Pesticide Residues in Peanut by QuEChERS–UPLC–MS／MS

Li Chanjun, Wang Yihong, Wang Yanchao, Dong Sujing, Duan Lumei
(Zhengzhou Testing Center for Quality of Agricultural Products, Zhengzhou 450006, China)

QuEChERS–UPLC–MS／MS was proposed for determination of 22 pesticide residues in peanut. The sample was extracted with 10 mL acetonitrile. 2 mL of the supernatant was taken and cleaned up with multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) and PSA. After being diluted to 2 times volume, the purifed solution was determined by UPLC–MS／MS under the mode of MRM. ESI was adopted in MS operated in the positive negative ion switch mode. Recovery rates at the three concentrations of 10，20，50 μg／kg ranged from 70.6% to 121.2% with RSDs less than 10%(n=6). Linear relationships between values of peak area and mass concentration were found in the range of 0.05–10 μg／L for carbendazim, pirimicarb and prometryne, 0.5–20 μg／L for acetamiprid, fpronil-sulfone, difenocoazole，pyridaben, pyrimethanil and azoxystrobin, 0.5–50 μg／L for dimethomorph, thiamethoxam, chlorfuazuron, chlorbenzuron, imidacloprid, emamectin benzoate, difubenzuron, fpronil, fpronil-desulfnyl, fpronil-sulfde, prochloraz and pendimethalin, and 0.5–100 μg／L for abamectin, with the linear relative coeffcients (r2) more than 0.995 0. The LOQs of 22 pesticide residues were less than 2 μg／kg, which were signifcantly lower than the respective MRLs. This method can be used in the determination of 22 pesticide residues in peanut.

QuEChERS; UPLC–MS／MS; peanut; pesticide residues

O657.7

：A

：1008–6145(2017)01–0033–05

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.008

聯(lián)系人：李嬋君；E-mail: chanjunli@163.com

2016–11–24