饒桂維，李成平，王倩，活潑

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310015)

快速溶劑萃取–高效液相色譜法測定禽蛋中磺胺嘧啶*

饒桂維，李成平，王倩，活潑

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310015)

建立快速溶劑萃取–高效液相色譜法測定禽蛋中磺胺嘧啶殘留的方法。用單因素和正交試驗對禽蛋中磺胺嘧啶的萃取條件進行優(yōu)化，確定了最佳萃取條件：以甲醇為萃取劑，在130℃循環(huán)萃取4次，沖洗體積分數(shù)為80%，萃取時間為25 min。色譜柱為Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇–0.5%冰乙酸(25∶75)，流量為1.0 mL／min，檢測波長為265 nm?；前粪奏さ馁|量濃度在0.025～0.500 mg／mL范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)r=0.999 5，檢出限為0.5 μg／kg。加標回收率在83.0%～88.2%之間，測定結果的相對標準偏差為2.2%(n=9)。方法的精密度、準確度和基質效應均符合禽蛋樣品檢測要求，可用于禽蛋中磺胺嘧啶含量的測定。

磺胺嘧啶；禽蛋；快速溶劑萃取；高效液相色譜法

磺胺嘧啶(SD)別名磺胺噠嗪、地亞凈，化學名稱為N-2-嘧啶基-4-氨基苯磺酰胺，是目前養(yǎng)殖業(yè)中應用最廣、用量最大的抗菌藥物之一，多與甲氧芐啶聯(lián)用，通過雙重阻斷細菌的葉酸合成達到抑菌的作用［1–2］。在家禽業(yè)中常用于預防和治療白痢、球蟲病、盲腸炎、肝炎及其它細菌性疾病。目前市面上銷售的禽蛋有一部分來自家庭散養(yǎng)及小規(guī)模養(yǎng)殖場，因法律意識淡薄及監(jiān)管不到位，易造成禽蛋獸藥殘留超標。有研究發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物毒性較高，殘留半衰期長，對人體和環(huán)境危害顯著，能引起過敏反應、細菌耐藥性和泌尿系統(tǒng)損害、造血紊亂等副作用［3–4］，歐盟已將磺胺類藥物列為嚴限使用的藥物，并規(guī)定動物源食品中磺胺類藥物的殘留限量為0.1 μg／g［5］。

目前測定磺胺類藥物的方法主要有紫外可見光分光光度法［6］、免疫層析法［7］、電化學分析法［8］、高效液相色譜法［9］和液相色譜質譜聯(lián)用法［10］等。紫外可見光分光光度法簡單快速，但不適合多組分磺胺類藥物測定；免疫層析法操作簡單，成本低，但大多只能進行定性分析，而且反應時間長；電化學分析法儀器設備簡單、測定范圍寬，但測定干擾因素多，對結果影響大；色譜法是目前應用最廣泛的有機化合物測定方法，具有定性定量準確、靈敏度高及干擾少等優(yōu)點，液相色譜質譜聯(lián)用法除具有色譜法優(yōu)點外，還具有更低的檢測限及更強的抗干擾力，但因儀器昂貴，不適合推廣應用，因此筆者采用高效液相色譜法測定禽蛋中的磺胺嘧啶。

快速溶劑萃取(ASE)技術采用壓縮氣體如氮氣來維持系統(tǒng)的高壓防止溶劑汽化，進而克服常壓提取對溶劑溫度的限制。樣品的提取和分離自動完成，提取時間短，提取效率高，是一種在高溫高壓下高效萃取樣品中組分的新方法［11–12］。美國環(huán)境保護署(EPA)已將其收錄為樣品處理的標準方法之一，在環(huán)境、食品和藥物等領域用于樣品中殘留物的提取［13–16］。故筆者利用快速溶劑萃取法萃取禽蛋中的磺胺嘧啶，先通過單因素試驗對萃取時間、萃取溫度、沖洗體積和萃取循環(huán)次數(shù)等因素進行考察，再經(jīng)正交試驗確定最佳萃取參數(shù)。與常規(guī)液液萃取法相比，快速溶劑萃取法具有溶劑用量少，萃取效率高等優(yōu)勢，與固相萃取、分子印跡等處理方法相比，具有準確度、自動化程度高和處理成本較低等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

快速溶劑萃取儀：ASE–350型，美國賽默飛世爾科技公司；

高效液相色譜儀：FL2200型，浙江福立儀器有限公司；

冷凍干燥機：FD–1D–50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)器：RE–3000A型，上海亞榮公司；

電子分析天平：AB204–N型，瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；

高速萬能粉碎機：FW80型，天津泰斯特儀器有限公司；

數(shù)顯勻漿機：IKA T25 型，德國IKA公司；

低速離心機：TD4Z型，湖南凱達實驗發(fā)展有限公司。

磺胺嘧啶：中國藥品生物制品檢定所；

甲醇、乙酸：HPLC級；

雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋樣品：購自超市，洗凈去殼后，以10 000 r／min勻漿，冷凍干燥后，經(jīng)研缽研磨均勻，低溫下密封保存。

實驗所用其它試劑為分析純；

實驗用水為超純水。

1.2 提取方法

準確稱取1.0 g樣品，置于萃取池內，加適量硅藻土，設定提取時間為25 min、循環(huán)次數(shù)為4次、萃取溫度為130℃，沖洗體積分數(shù)為80%，以甲醇為提取劑，進行操作。提取完畢，將提取液轉移到10 mL離心管中，以20 000 r／min離心15 min，取上清液并在40℃水浴下氮吹至干，加入流動相溶解，定容至1 mL，過0.22 μm 尼龍濾膜后待測。若樣品中分析物濃度過高，則用甲醇進行適量稀釋。

1.3 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30℃；流動相：甲醇–0.5%冰乙酸溶液(25∶75)；流量：1 mL／min；檢測波長：265 nm；進樣體積：10 μL。

1.4 標準溶液的配制

(1)磺胺嘧啶標準儲備溶液。精確稱取干燥的磺胺嘧啶標準品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg／mL的標準儲備液，于–20℃下避光保存(2個月內使用)。

(2)磺胺嘧啶標準工作溶液。移取磺胺嘧啶標準儲備液適量，用甲醇配制成所需濃度的標準工作溶液，密封于4℃下避光保存?zhèn)溆?7天內使用)。

2 結果與討論

2.1 萃取單因素試驗考察

以甲醇為提取劑，以雞蛋空白基質為樣品，在進行加標回收率測定后，選取最高回收率的加標量加入樣品，對ASE沖洗體積分數(shù)、提取溫度、提取次數(shù)和提取時間進行單因素試驗，測定樣品回收率，從而確定后續(xù)正交試驗的參數(shù)范圍。

2.1.1 沖洗體積分數(shù)

ASE的不同沖洗體積分數(shù)對磺胺嘧啶萃取有一定影響。設定萃取時間為15 min，萃取溫度為60℃，循環(huán)次數(shù)為1次的條件下，研究不同沖洗體積分數(shù)對磺胺嘧啶萃取效果的影響。將雞蛋空白基質各加標100 mg，經(jīng)ASE萃取后按1.2方法制備成供試品溶液，在1.3色譜條件下進行測定，計算加標回收率，結果見表1。

表1 不同沖洗體積時的回收率 %

由表1可知，在沖洗體積分數(shù)達到80%時回收率最高；隨著沖洗體積分數(shù)的增加，回收率逐漸穩(wěn)定，可能是沖洗比較充分，管路已無樣品殘留。故沖洗體積分數(shù)確定為80%。

2.1.2 萃取溫度

以循環(huán)次數(shù)為1次，萃取時間為15 min，沖洗體積分數(shù)80%為固定條件，分別取雞蛋空白基質各加標100 mg，與等量硅藻土混勻，置于萃取池內，分別在60，80，100，120，140℃下萃取，通過測定萃取液中磺胺嘧啶的含量計算回收率，結果見表2。

表2 不同萃取溫度時的回收率

由表2可知，磺胺嘧啶的回收率隨萃取溫度的升高而增加，在120℃之后趨于平穩(wěn)，萃取溫度升高時回收率變化不大。由于萃取儀的操作溫度范圍為40～200℃，操作溫度過高易造成各項儀器誤差，因此萃取溫度選擇為120℃。

2.1.3 萃取時間

分別取雞蛋空白基質各加標100 mg，與等量硅藻土混勻，置于萃取池內，在萃取溫度120℃，萃取次數(shù)1次，沖洗體積分數(shù)80%的條件下，設定萃取時間為5，10，15，20，25 min分別進行萃取，測定磺胺嘧啶含量，計算回收率，試驗結果見表3。

表3 不同萃取時間時的回收率

由表3可知，當萃取時間為20 min時，磺胺嘧啶的回收率達到最大值(82.5%)，故萃取時間選擇為20 min。

2.1.4 萃取次數(shù)

在沖洗體積分數(shù)為80%，萃取時間為20 min，萃取溫度為120℃的條件下，分別取雞蛋空白基質各加標100 mg，與等量硅藻土混勻，置于萃取池內。分別萃取1，2，3，4，5次，測定萃取液中磺胺嘧啶的含量，試驗結果見表4。由表4可知，磺胺嘧啶的回收率隨著萃取次數(shù)的增加而增加，萃取3次以上時，趨勢平緩。最終選擇萃取次數(shù)為4次。

表4 不同萃取次數(shù)時的回收率

2.2 萃取正交試驗

在完成單因素試驗后，確定了萃取溫度、萃取時間、沖洗體積分數(shù)和循環(huán)次數(shù)各水平的正交試驗范圍，進行4因素3水平的正交試驗設計［17］，以獲得最佳的磺胺嘧啶ASE萃取條件，各因素水平見表5。

表5 各因素水平設定值

從沖洗體積分數(shù)、萃取時間、萃取次數(shù)、萃取溫度4個因素試驗結果中分別優(yōu)選出最優(yōu)的4個條件作為每個因素的3個水平，分別取雞蛋空白基質各加標100 mg，以磺胺嘧啶的回收率為考察指標進行考察，進行L9(34)的正交試驗，結果見表6。

表6 正交試驗結果

在正交試驗中，K1，K2，K3為各因素的3個水平得率的平均值，極差R表示同因素K最大值與最小值之差，極差的大小表明了因素對樣品中磺胺嘧啶萃取回收率影響的大小。對試驗數(shù)據(jù)進行分析后得出，影響磺胺嘧啶萃取回收率的順序為沖洗體積分數(shù)＞萃取溫度＞萃取時間＞萃取次數(shù)。萃取次數(shù)影響最不明顯，這可能與ASE萃取效率比較高有關系。根據(jù)3個因素K值的大小，得出采用快速溶劑萃取法對禽蛋類磺胺嘧啶的最優(yōu)萃取條件為A2B3C3D3。即沖洗體積分數(shù)為80%，萃取溫度為130℃，萃取時間為25 min，萃取次數(shù)為4次。

2.3 標準工作曲線、檢出限及定量限

利用磺胺嘧啶標準儲備液配制質量濃度分別為0.025，0.050，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500 mg／mL的系列標準工作溶液，在1.3條件下進行測定。以磺胺嘧啶的色譜峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，得到標準曲線方程為Y=43.065X–0.453 9，r2=0.999 5，線性范圍為0.025～0.500 mg／mL。

將0.025 mg／mL標準工作溶液不斷稀釋進樣分析，以3倍信噪比計算檢出限，得到磺胺嘧啶的檢出限為0.5 μg／kg；以10倍信噪比計算定量限，得方法的定量限為2.0 μg／kg。

2.4 精密度試驗

移取0.50 mg／mL的磺胺嘧啶標準工作溶液適量，在1.3色譜條件下平行測定6次，記錄色譜峰面積，結果見表7。由表7可知，色譜峰面積測定結果的相對標準偏差為1.20%，說明該方法具有良好的精密度。

表7 精密度試驗結果

2.5 回收試驗

以雞蛋空白基質作為空白樣品，進行加標回收試驗［18］。取9份樣品分別加入50，100，150 mg／kg 3個水平的磺胺嘧啶對照品，每個水平平行測定3次。按1.2方法進行提取，制備供試品溶液，按照1.3色譜條進行測定，計算加標回收率，結果見表8。由表8可知，采用3個水平、3次平行共計9次測定，平均加標回收率為83.0%～88.2%,平均回收率為85.5%，測定結果的相對偏差為2.2%，可見所建方法具有較高的精密度和準確度。

表8 加樣回收試驗結果

2.6 樣品測定

用本方法對市售的雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋各10份樣品進行檢測，其中1份樣品檢出磺胺嘧啶，含量為3.12 mg／kg，其它樣品均未檢出。對照品色譜圖、陽性樣品色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

3 結論

(1)經(jīng)過單因素和正交試驗確定，采用快速溶劑萃取法(ASE)萃取禽蛋中磺胺嘧啶的最佳萃取條件：沖洗體積分數(shù)為80%，萃取溫度為130℃，萃取時間為25 min，萃取次數(shù)為4次。在該最佳萃取條件下，禽蛋中磺胺嘧啶的回收率可達85.5%。ASE萃取法具有消耗溶劑少，萃取效率高等優(yōu)點，在食品中非法添加劑的萃取方面具有一定的優(yōu)勢［19–20］。

(2)采用快速溶劑萃取–高效液相色譜法測定禽蛋中磺胺嘧啶含量，方法操作簡便，準確度高，重現(xiàn)性好，專屬性強，可作為禽蛋中磺胺嘧啶含量的常規(guī)測定方法。

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Determination of Sulfadiazine in Eggs by Accelerated Solvent Extraction and High Performance Liquid Chromatography

Rao Guiwei， Li Chengping， Wang Qian， Huo Po
(College of Biology and Environmental Engineering， Zhejiang Shuren University， Hangzhou 310015， China)

A extraction and analytical method with accelerated solvent extraction (ASE) and high performance liquid chromatography was developed to determine sulfadiazine in eggs. Single factor and orthogonal experiment were adopted to optimize the extraction conditions. The results showed that the optimum conditions of extraction were as follows: methanol was as extraction solvent， 130℃for four times in 25 min and ring volume fraction of 80%. The separation of samples was carried on Hypersil ODS2 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) with mobile phase of methanol–0.5% acetic acid(25∶75) and detection wavelength of 265 nm. The mass concentration of sulfadiazine was linear with chromatographic peak area in the range of 0.025–0.500 mg／mL with correlation coeffcient of 0.999 5. The detection limit was 0.5 μg／kg. The spiked recoveries were in the range of 83.0%–88.2% with relative standard deviation of 2.2%(n=9). The precision，accuracy，mean recoveries and the matrix effect were satisfed with the requirements of eggs measurement. The method is suitable for the determination of sulfadiazine in eggs.

sulfadiazine; egg; accelerated solvent extraction; high performance liquid chromatography

O657.6

：A

：1008–6145(2017)01–0020–05

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.005

*浙江省教育廳研究項目(2014J80002)；浙江樹人大學校一級科研項目(2013A1103)

聯(lián)系人：活潑；E-mail：xka-8@163.com

2016–09–22