楊盛茹，鄒 建，丁長河*，劉洪斌，張 煌

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品工程學院，河南鄭州450046；2.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州450001；3.中國動物疫病預防控制中心，北京100125）

稀酸預處理玉米芯酶解工藝響應面優(yōu)化研究

楊盛茹1，鄒 建1，丁長河2*，劉洪斌3，張 煌1

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品工程學院，河南鄭州450046；2.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州450001；3.中國動物疫病預防控制中心，北京100125）

木質(zhì)纖維原料還原糖（葡萄糖、木糖）轉(zhuǎn)化是燃料乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一，該文以玉米芯為原料，采用稀硫酸處理、酶水解以提高還原糖轉(zhuǎn)化量。以還原糖轉(zhuǎn)化量為考核指標，采用單因素試驗及響應面試驗設計優(yōu)化稀酸處理玉米芯酶解條件，擬合硫酸體積分數(shù)、加酶量、酶解時間3個因素對還原糖轉(zhuǎn)化量的回歸模型。結(jié)果表明，最佳酶解工藝為121℃條件下預處理60 min，硫酸體積分數(shù)0.8%，料液比1∶15（g∶mL），加酶量7%（纖維素酶∶半纖維素酶1∶1），酶解時間70.9 h。在此最佳條件下，采用高效液相色譜（HPLC）法測定酶解液中還原糖轉(zhuǎn)化量為462.62 mg/g，其中木糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化量分別為330.02 mg/g、132.60 mg/g，還原糖轉(zhuǎn)化率可達46.3%。

玉米芯；稀酸預處理；酶解；響應面試驗；高效液相色譜

能源、環(huán)境危機是21世紀制約人類社會、經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。當前，燃料乙醇是除生物柴油外規(guī)模化使用的生物能源品[1]。木質(zhì)纖維生物質(zhì)是當前生產(chǎn)生物燃料乙醇的重要原料，其資源廣泛且價格低廉[2-3]。

我國的玉米播種面積位居世界第二[4]，據(jù)國家統(tǒng)計局發(fā)布的公告顯示，2015年我國玉米播種面積381.166 km2，總產(chǎn)量22 458.0萬t[5]，而玉米芯產(chǎn)量據(jù)估算可達約7 487.04萬t[6-7]。有專家學者研究以玉米芯為原料制備還原糖，但是轉(zhuǎn)化率有待提高，如羅鵬等[8-9]研究用超臨界二氧化碳及超聲預處理后再用稀酸水解，得出還原糖產(chǎn)率為39.5%；SIDIRAS D等[10]以硫酸作為催化劑在140℃條件下進行有機溶劑處理，得到質(zhì)量分數(shù)為27%的可溶性糖。

木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)乙醇要經(jīng)過預處理、酶解糖化、發(fā)酵等過程，其中高效的預處理是燃料乙醇生產(chǎn)的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，稀酸法由于水解濃度低、應用過程較簡單、適用于規(guī)?；笊a(chǎn)，一直備受關(guān)注[11-14]。利用酶水解產(chǎn)生的還原性糖，具有糖產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少等特性，但是酶解過程本身復雜，且影響因素較多，只有在合適的條件下才能發(fā)揮出最佳活性[15]。響應面法在篩選培養(yǎng)基及優(yōu)化等方面應用較多[16]，但在優(yōu)化預處理、酶解過程中應用較少。

本研究以玉米芯為原料，用稀硫酸預處理、纖維素酶和半纖維素酶水解，并用單因素及響應曲面試驗對還原糖（葡萄糖、木糖）轉(zhuǎn)化工藝條件進行優(yōu)化。對于木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性還原糖的測定方法有多種，其中高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法快捷方便、準確性高，因此試驗中選用此法進行還原糖定量分析[17]。本研究旨在探索高效轉(zhuǎn)化玉米芯還原糖的工藝，為玉米芯的有效利用提供科學依據(jù)，進而為生物轉(zhuǎn)化玉米芯制取乙醇的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯（鄭州市上街區(qū)），自然晾曬干燥，粉碎過篩（直徑4 mm）后保存；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司；纖維素酶和半纖維素酶（酶活均為10 000 U/g）：肇東日程酶制劑有限公司；木糖、葡萄糖（均為色譜純）：上海銳谷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters2695高效液相色譜：美國Waters公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；YX280B手提式不銹鋼蒸汽鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 還原糖含量測定

采用高效液相色譜法測定還原糖含量。色譜條件為：Waters Carbohydrate High Performance色譜柱（4.6 mm× 250mm,4μm）；流速1.0mL/min；柱溫35℃；進樣量10μL；流動相乙腈:水（75:25,V/V）；氮氣壓力25psi；檢測器溫度80℃。

木質(zhì)纖維原料經(jīng)處理后轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的還原糖主要是木糖、葡萄糖[18]，分別以葡萄糖、木糖為標準品，二者的保留時間分別為8.406 min、6.280 min，分別以葡萄糖、木糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制葡萄糖、木糖標準曲線，分別得葡萄糖標準曲線回歸方程為：y＝3×106x-2×106，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.993；木糖標準曲線回歸方程為：y＝2×106x-3×106，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.998。利用葡萄糖、木糖標準曲線回歸方程計算樣品中還原糖含量，還原糖轉(zhuǎn)化量計算公式如下：

式中：YRS為還原糖轉(zhuǎn)化量，mg/g；CRS為還原糖含量，mg/L；V為樣品體積，L；m為玉米芯質(zhì)量，g。

還原糖轉(zhuǎn)化率即玉米芯中還原糖的轉(zhuǎn)化比率，其計算公式為：

1.3.2 玉米芯酶解條件優(yōu)化單因素試驗

玉米芯4.00 g，加入一定硫酸溶液60 mL，混合均勻后于90℃浸泡4 h，于121℃預處理一定時間后加入酶[纖維素酶∶半纖維素酶（1∶1）]（調(diào)pH為4.5），在130 r/min、45℃條件下水解一定時間后以5 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾后于4℃保存用于HPLC分析。以還原糖轉(zhuǎn)化量為評價指標，考察不同硫酸體積分數(shù)（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、不同料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21（g∶mL））、不同預處理時間（0、15 min、30 min、45 min、60min、75min）、不同酶解時間（0、24h、36h、48h、60h、72h、84 h），不同加酶量（0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）對玉米芯酶解效果的影響。

1.3.3 響應面法優(yōu)化玉米芯酶解條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應面軟件Design Expert 7.0對玉米芯酸法預處理、酶解條件進行3因素3水平的中心組合設計（central composite design，CDD），以還原糖轉(zhuǎn)化量（Y）作為響應值對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。CDD試驗的因素與水平見表1。

表1 CCD試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of CCD experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 硫酸體積分數(shù)對玉米芯還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖1 硫酸體積分數(shù)對木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.1 Effect of acid concentration on the conversion amount of xylose(a)and glucose(b)

由圖1可知，經(jīng)稀硫酸處理后酶解液中木糖轉(zhuǎn)化量遠高于葡萄糖，同時分析得出硫酸體積分數(shù)逐漸增大，還原糖（木糖、葡萄糖）轉(zhuǎn)化量曲線類似于拋物線即先增加后減少，這是因為在處理時硫酸體積分數(shù)過小無法充分破壞玉米芯纖維結(jié)構(gòu)致使降解不徹底，而過大時轉(zhuǎn)化的還原糖由于進一步降解而減少。在硫酸體積分數(shù)為0.8%時木糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化量均達到最大，分別為303.28 mg/g和117.04 mg/g。因此，確定硫酸體積分數(shù)為0.8%。

2.1.2 預處理時間對還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖2 預處理時間對木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.2 Effect of pretreatment time on the conversion amount of xylose(a)and glucose(b)

由圖2可知，在試驗0～60 min范圍時，隨著預處理時間延長，葡萄糖轉(zhuǎn)化量和木糖轉(zhuǎn)化量均增加，且預處理時間為60 min時，木糖轉(zhuǎn)化量最大為289.56 mg/g，而葡萄糖轉(zhuǎn)化量在預處理時間＞60 min之后略有增加。綜合酶解液中還原糖轉(zhuǎn)化量及時間成本，選擇預處理時間為60 min。

2.1.3 料液比對還原糖轉(zhuǎn)化量影響

由圖3可知，料液比在1∶9～1∶21（g∶mL）時，酶解液中木糖、葡萄糖的轉(zhuǎn)化量均隨料液比的變化而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；木糖轉(zhuǎn)化量在料液比1∶15（g∶mL）時最大為289.56 mg/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化量在料液比1∶18（g:mL）時最大為109.52 mg/g。綜合考慮酶解液中還原糖轉(zhuǎn)化量，確定料液比為1∶15（g∶mL）。

圖3 料液比對木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

2.1.4 加酶量對還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖4 加酶量對木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

由圖4可知，在沒有纖維酶類的條件下水解仍檢測出木糖和葡萄糖，說明稀酸的浸泡、高溫作用等這些過程已經(jīng)有還原糖轉(zhuǎn)化，還原糖轉(zhuǎn)化量為235.56 mg/g（木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化量分別是124.56 mg/g、34.25 mg/g）；加酶量1%～6%時，隨加酶量的增加，酶解液中木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化量均逐漸增大，且變化較明顯；在加酶量＞6%時，木糖、葡萄糖轉(zhuǎn)化量增加逐漸平緩。綜合成本確定加酶量為6%。

2.1.5 酶解時間對還原糖轉(zhuǎn)化量影響

圖5 酶解時間對木糖(a)及葡萄糖(b)轉(zhuǎn)化量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

由圖5可知，在前72 h內(nèi)隨酶解時間的延長，酶解液中葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量均呈逐漸增加趨勢，二者比較分析出木糖轉(zhuǎn)化增加率比葡萄糖增加率高。酶解時間＞72 h后，由于時間過長發(fā)生副反應導致糖破壞致使木糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)化量均降低。因此，確定酶解時間為72 h。

2.2 響應面法優(yōu)化玉米芯酶解條件

通過單因素試驗，選擇對還原糖轉(zhuǎn)化量影響較大的硫酸體積分數(shù)（A）、加酶量（B）、酶解時間（C）三個因素為自變量，還原糖轉(zhuǎn)化量（Y）為響應值，采用CCD試驗設計試驗設計結(jié)果與分析見表2，利用Design Expert 7.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析得方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型P值＜0.000 1，F(xiàn)值=90.53，影響極顯著，所得模型合適。失擬項的P值=0.8514＞0.05，F(xiàn)值=0.04，影響不顯著，決定系數(shù)R2＝0.993 9，擬合度＞90%，擬合度較好，可用此模型對影響還原糖轉(zhuǎn)化量的試驗因子做出分析。B、A2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），AB、AC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。因此各試驗因子對響應值還原糖轉(zhuǎn)化量的影響并不能以簡單的線性關(guān)系表示，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合可得二次回歸方程：

Y=443.97+6.92A+20.33B-6.45C-49.85A2+0.88B2-26.98C2-13.78AB+13.22AC-1.19BC

表2 CCD試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of CCD experiments

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

同時利用Design Expert 7.0軟件，分別做出加酶量、硫酸體積分數(shù)、酶解時間交互作用對還原糖轉(zhuǎn)化量影響的響應面圖見圖6。從圖6中可直觀地看出各因素間的相互作用、最佳參數(shù)。加酶量及因素交互作用對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響，曲線越陡影響越明顯越大，對應于還原糖轉(zhuǎn)化量的變化越大。對試驗因子影響及交互作用分析得出加酶量這一因素對響應值還原糖轉(zhuǎn)化量的影響最明顯最大，加酶量和硫酸體積分數(shù)交互作用、酶解時間和硫酸體積分數(shù)交互作用顯著，同方差分析結(jié)果一致。

圖6 加酶量、硫酸體積分數(shù)及酶解時間交互作用對還原糖轉(zhuǎn)化量影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between enzyme addition,sulfate concentration and enzymolysis time on the conversion amount of reducing sugar

經(jīng)回歸模型預測玉米芯預處理、酶解轉(zhuǎn)化還原糖最佳工藝條件為硫酸體積分數(shù)0.76%、加酶量6.99%、酶解時間70.87 h，還原糖轉(zhuǎn)化量理論值465.76 mg/g。對最佳工藝條件修正并驗證，得出在硫酸體積分數(shù)0.8%、加酶量7%、酶解70.9 h條件下，還原糖轉(zhuǎn)化量可達462.62 mg/g，其中木糖轉(zhuǎn)化量為330.02 mg/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化量為132.60 mg/g，與預測值擬合度較好，證明此模型預測作用很好工藝參數(shù)合理可行。

3 結(jié)論

原料預處理可以破壞纖維的致密結(jié)構(gòu)，使纖維素、木質(zhì)素、半纖維素有效分離，可酶解性大大提高[11]。試驗研究稀酸浸泡、纖維素酶和半纖維素酶水解轉(zhuǎn)化玉米芯還原糖，并用響應曲面法對其工藝參數(shù)優(yōu)化，得出最佳條件為：硫酸體積分數(shù)0.8%、90℃浸泡4h、料液比1∶15（g∶mL），在121℃條件下預處理60 min，加酶量（纖維素酶∶半纖維素酶1∶1）7%條件下酶解70.9h，還原糖轉(zhuǎn)化量可達462.62mg/g，其中木糖轉(zhuǎn)化量為330.02mg/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化量為132.60mg/g，還原糖轉(zhuǎn)化率可達46.3%。該試驗為進一步研究玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇提供理論依據(jù)。

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Optimization of enzymolysis process of corncobs with dilute acid pretreatment by response surface methodology

YANG Shengru1,ZOU Jian1,DING Changhe2*,LIU Hongbin3,ZHANG Huang1(1.College of Food Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China;2.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;3.China Animal Disease Control Center,Beijing 100125,China)

The conversion of lignocellulosic biomass to reducing sugar(glucose and xylose)was one of key processes in the fuel ethanol production. To increase the concentration of glucose and xylose,corncobs was pretreated with dilute acid firstly and hydrolyzed with cellulase and hemicellulase. The enzymatic hydrolysis conditions of corncob were optimized by single factor and response surface experiments using reducing sugar conversion amount as evaluation index,and the regression model according to the significances and interaction effects of acid concentration,enzyme addition and hydrolysis time on the sugar conversion amount was fitted.The results indicated that the optimum conditions was determined as follows:sulfuric acid concentration 0.8%,solid-liquid ratio 1:15(g:ml),121℃for 60 min,enzyme addition 7.0%(cellulose:hemicellulase 1:1)for 70.9 h.Under the condition,the reducing sugar conversion amount determined by HPLC reached 462.62 mg/g and conversion rate was up to 46.3%,including xylose 330.02 mg/g and glucose 132.60 mg/g.

corncob;dilute acid pretreatment;enzymolysis;response surface experiment;HPLC

TS261.9

0254-5071（2017）01-0111-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.023

2016-10-24

河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃項目（101HASYTIT035）；河南省科技攻關(guān)項目（142102110178）；河南省重點科技攻關(guān)項目（162102210107）

楊盛茹（1988-），女，碩士，研究方向為生物質(zhì)乙醇發(fā)酵。

*通訊作者：丁長河（1968-），男，副教授，博士，研究方向為生物質(zhì)乙醇發(fā)酵。