季 彬，祁宏山，王治業(yè)*，杜軍國，曾 楊，陳 娟，祝 英

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

微生物促生劑發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)飼料蛋白研究

季 彬，祁宏山，王治業(yè)*，杜軍國，曾 楊，陳 娟，祝 英

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

以玉米皮為基本碳源，通過單因素和正交試驗(yàn)，以產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母和白地霉聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料進(jìn)行了研究。以提高真蛋白含量為主要目的，優(yōu)化得到最佳的發(fā)酵條件為菌液接種量7%，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1:1.8（g:mL），發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時(shí)間80 h。在此條件下，真蛋白含量可達(dá)15.6%，是發(fā)酵前的1.94倍。

玉米皮；固態(tài)發(fā)酵；飼料蛋白

我國優(yōu)質(zhì)飼料資源短缺，一直以來都制約著畜牧業(yè)的長效發(fā)展[1-3]。玉米皮是玉米籽粒的表皮部分，也稱作玉米纖維或玉米渣，是玉米加工淀粉后的副產(chǎn)物，通常在濕法[4]加工淀粉的過程中被分離出來。玉米皮富含淀粉和纖維素[5]，還有少量的植物蛋白，傳統(tǒng)的使用方法是直接用來飼喂牛羊，但因其適口性差，牛羊等采食率低，飼喂效果不好。利用微生物發(fā)酵[6-7]的方法，可將玉米皮中的淀粉、纖維類物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為牛羊易采食的單細(xì)胞蛋白。目前，相關(guān)研究[8-9]多采用將不同飼料化菌株分別接入玉米皮，然后再利用固態(tài)混合發(fā)酵的方式生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料，但這種方法在工業(yè)化生產(chǎn)中一是由于不同菌株間可能存在的競爭、協(xié)同關(guān)系，菌株間的配比往往不能反映飼料化過程中各菌株間真實(shí)的相互關(guān)系，增蛋白效果有限；二是多次接種增加了工作量，也增加了雜菌污染的機(jī)會(huì)。針對(duì)于此，本試驗(yàn)采用將飼料化菌株經(jīng)細(xì)胞固定化后接種至玉米皮糖化醪中反復(fù)培養(yǎng)，待其菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后再將菌液一次性接入玉米皮后固態(tài)發(fā)酵。由于菌液中各菌株的配比已經(jīng)玉米皮水解液的反復(fù)優(yōu)化，呈穩(wěn)定的狀態(tài)，在接入玉米皮后可在較短時(shí)間內(nèi)迅速進(jìn)入飼料化發(fā)酵，其最佳的菌株配比也更能高產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

白地霉（GeotrichumcandidumLink）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心提供。

1.1.2 材料

聚乙烯醇復(fù)合凝膠[10]：蘭州凱奇生物工程有限責(zé)任公司提供。

玉米皮：甘肅張掖昆侖生化有限責(zé)任公司提供。將玉米皮粉碎后過40目篩，加入相當(dāng)于干料總量1%的營養(yǎng)鹽液（0.05%硫酸銨，0.027%磷酸二氫鉀，硫酸鎂0.02%，水1000mL），含水量控制在60%左右，于121℃滅菌處理25min。

1.1.3 培養(yǎng)基

白地霉培養(yǎng)基：馬鈴薯200g去皮，切成小塊，加水煮沸20min后用紗布過濾，濾液加葡萄糖20g，定容至1000mL，pH值自然，冷卻后待用。固體培養(yǎng)基加瓊脂16 g。

酵母種子培養(yǎng)基：蛋白胨8 g，牛肉膏5 g，酵母粉3 g，葡萄糖10 g，七水硫酸鎂0.5 g，水1 000 mL。

固定化細(xì)胞培養(yǎng)基[11]：白地霉菌液體培養(yǎng)基與玉米糖化醪1∶1混合，其中玉米糖化醪的制作方法：將玉米粉碎并過40目篩，與水以1:4.5的比例混合并加熱，待溫度為40℃，開始加入所需酶量一半的淀粉酶（淀粉酶按12 U/g玉米粉稱?。?0 min，后繼續(xù)加熱至90℃，加入剩余的淀粉酶，并加熱至沸25 min，后開始冷卻，待溫度為62～64℃時(shí)加入糖化酶（糖化酶按200 U/g玉米粉稱?。⒈?0 min后降溫至28～30℃。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MJ-160型霉菌培養(yǎng)箱：上海恒躍醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 酵母菌共固定化方法

將待固定的酵母菌種分別經(jīng)種子培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)后，待菌懸液中酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.2×108CFU/mL以上時(shí)，將產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母菌懸液以1:1的體積比混合，然后以2:8的體積比與聚乙烯醇凝膠混合，攪拌均勻后置于低溫冷凍箱中固化48 h，解凍后切成4 cm×4 cm×4 cm的切塊備用。

1.3.3 共固定化細(xì)胞增殖培養(yǎng)[12]

將備用的固定化細(xì)胞切塊加入固定化增殖培養(yǎng)基中，在28℃條件下增殖18 h，增殖罐攪拌轉(zhuǎn)速為90 r/min。

將固定化酵母增殖液與白地霉菌培養(yǎng)液以1∶1的比例混合[13]后，接種在蒸煮好的玉米皮中，在一定培養(yǎng)條件下發(fā)酵。

1.3.4 玉米皮固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)[14-16]

①單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)以玉米皮為基本碳源，添加營養(yǎng)鹽液后控制料水比，經(jīng)蒸煮滅菌處理后接種培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件為玉米皮200 g，料水比1∶2（g∶mL），接種量10%，30℃培養(yǎng)72 h，考察不同接種量（5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%）、基質(zhì)料水比（1∶1.0、1∶1.4、1∶1.8、1∶2.2、1∶2.6、1∶3.0（g∶mL））、發(fā)酵溫度（25℃、28℃、31℃、34℃、37℃）和培養(yǎng)時(shí)間（48 h、64 h、72h、80h、90h）對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白量的影響。

②正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取接種量、培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素，取3水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)，發(fā)酵終了時(shí)測定真蛋白含量，并且利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 玉米皮發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for corn bran culture conditions optimization

1.3.5 真蛋白含量測定[17]

用電子天平精確稱取發(fā)酵后產(chǎn)物0.5 g放置于100 mL燒杯中，加入30 mL蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻，再煮沸依次加入10%硫酸銅水溶液20 mL和2.5%氫氧化鈉溶液20 mL，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌幾分鐘。放置2 h，沉淀物用濾紙過濾，并用70℃以上熱蒸餾水反復(fù)洗滌沉淀，直至濾液無沉淀為止（用氯化鋇試驗(yàn)檢驗(yàn)）。最后將濾紙和沉淀物包好，65～70℃烘箱干燥。用凱氏定氮法測定樣品中真蛋白含量，同時(shí)作空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料水比對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

固態(tài)發(fā)酵不同于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵中合理控制發(fā)酵基質(zhì)中水分的含量，有利于微生物進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、生長、細(xì)胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)交換。料水比對(duì)真蛋白含量的影響見圖1。

圖1 料水比對(duì)玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on true protein content from corn bean

由圖1可以看出，真蛋白含量隨料水比的增加呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)料水比為1∶1.8（g∶mL）時(shí)，飼料化發(fā)酵后玉米皮真蛋白含量達(dá)最大值，為14.3%。原因可能是低水分發(fā)酵時(shí)，底物中的營養(yǎng)物沒有足夠的自由水將其擴(kuò)散到底物表面，菌株生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)供給不足，真蛋白增量不足；高水分發(fā)酵時(shí)，底物顆粒間沒有足夠的孔隙率，供氧不足，菌株生長受限，真蛋白增量有限。因此選擇料水比為1∶1.8（g∶mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 接種量對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

接種量對(duì)真蛋白含量的影響見圖2。由圖2可知，真蛋白含量隨接種量的增加呈先快速后緩慢增大的趨勢，當(dāng)接種量為7.5%時(shí)，飼料化發(fā)酵后玉米皮中真蛋白含量可達(dá)9.7%，之后隨著接種量的增加，真蛋白含量增量較小，考慮到菌液生產(chǎn)成本，控制接種量在7.5%較為合適。接種量大可以縮短發(fā)酵過程中菌株細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值的時(shí)間，提早形成發(fā)酵終產(chǎn)物。這是因?yàn)榉N子液中含有胞外水解酶類，接種量大，酶量也多，有利于對(duì)固態(tài)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的分解和利用，同時(shí)菌體量多，占有絕對(duì)生長優(yōu)勢，可以相對(duì)減少雜菌污染和生長的機(jī)會(huì)。但接種量過大，也會(huì)造成菌體前期生長過速，后期由于基質(zhì)中菌體代謝產(chǎn)物堆積和營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，導(dǎo)致菌體早衰，從而影響產(chǎn)物的合成。因此，選擇接種量為7.5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 接種量對(duì)玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.2 Effects of inoculum on true protein content from corn bran

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

溫度對(duì)發(fā)酵的影響及其調(diào)節(jié)控制是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一，其主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成和培養(yǎng)基質(zhì)物理性質(zhì)的改變等方面。據(jù)此，控制適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度，使生產(chǎn)菌種處于產(chǎn)物合成最佳的溫度下生長，才能得到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的效果。發(fā)酵溫度對(duì)真蛋白含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.3 Effects of the fermentation temperature on true protein content from corn bran

由圖3可知，真蛋白含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)混合菌液在31℃發(fā)酵玉米皮時(shí)，發(fā)酵后得成熟物料中真蛋白含量最高為14.5%，之后，隨著溫度的上升，真蛋白含量有所下降。因此，選擇發(fā)酵溫度為31℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響

真蛋白含量是評(píng)價(jià)玉米皮飼料化發(fā)酵效果的重要指標(biāo)，而微生物的生長要經(jīng)過停滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期四個(gè)階段，微生物發(fā)酵產(chǎn)物的總量隨著微生物的生長階段的改變而改變。發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米皮產(chǎn)真蛋白含量的影響Fig.4 Effects of the fermentation time on true protein content from corn bran

由圖4可知，真蛋白含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈先增大后減小的趨勢，玉米皮飼料化發(fā)酵80 h時(shí)，真蛋白含量可達(dá)峰值為14.8%，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長有所減低，分析認(rèn)為是由于微生物自身分解代謝所致。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為80 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取接種量、培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4因素，分別設(shè)3個(gè)水平，用正交表L9（34）設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究各因素對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵的影響，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 玉米皮發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for corn bran fermentation conditions optimization

由表2可知，直觀分析得出最佳水平組合為A1B2C2D2，即菌種接種量7%，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1∶1.8（g∶mL），發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時(shí)間80 h。在此條件下，真蛋白含量為15.6%，是發(fā)酵前的1.94倍。4種因素對(duì)真蛋白產(chǎn)量影響依次為培養(yǎng)基料水比＞發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，即培養(yǎng)基含水量和發(fā)酵溫度是影響玉米皮飼料化發(fā)酵的主要因素，其他影響較小。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result

由方差分析（表3）可知，培養(yǎng)基料水比、發(fā)酵時(shí)間F比＞F0.05（2,2），故其對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白十分顯著（P＜0.05）；接種量、發(fā)酵溫度F比＜F0.05（2,2），故其對(duì)玉米皮飼料化發(fā)酵產(chǎn)真蛋白的影響不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中玉米皮經(jīng)蒸煮滅菌處理后，接種經(jīng)細(xì)胞固定化后制得的產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母、白地霉菌液優(yōu)化菌液，固態(tài)發(fā)酵后制取單細(xì)胞蛋白飼料。試驗(yàn)結(jié)果表明，將菌液接種量控制在7%，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比1∶1.8（g∶mL），發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵80 h時(shí)，真蛋白含量可達(dá)15.6%，是發(fā)酵前的1.94倍。本研究由于優(yōu)化了發(fā)酵菌液，發(fā)酵后玉米皮真蛋白含量要高于現(xiàn)有的研究水平，顯示了其優(yōu)越性，具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。

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Feed protein production from corn bran with microbial fermentation promoters

JI Bin,QI Hongshan,WANG Zhiye*,DU Junguo,ZENG yang,CHEN Juan,ZHU Yin(Institute of Biology,Gansu Provincial Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Usingcornbranasbasiccarbonsource,proteinfeedwasproducedwiththesolid-statefermentationofCandidautilis,Saccharomycescerevisiae andGeotrichum candidumby single-factor and orthogonal experiments.To improve pure protein content,the optimal fermentation conditions were as follows:solid-liquid ratio of solid-state fermentation medium 1:1.8(g:ml),inoculum 7%,fermentation temperature 31℃and time 80 h.Under the above conditions,the true protein content in the final product achieved 15.6%,which was 1.94 times of before fermentation.

corn bran;solid-state fermentation;feed protein

S816.6

0254-5071（2017）01-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.022

2016-05-04

甘肅省科學(xué)院青年基金（2013QN-07）；國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD14B10-4）；國家星火項(xiàng)目（2012GA860003）

季彬（1983-），男，助理研究員，本科，主要從事農(nóng)業(yè)廢棄物高值化利用研究工作。

*通訊作者：王治業(yè)（1976-），男，研究員，碩士，主要從事生物資源高值化及清潔生產(chǎn)方面的研究工作。