杜娟+時(shí)文靜

摘要：以香菇、金針菇及黑木耳3種常見食用菌為主要原料，研究了食用菌多糖的提取條件和測定方法。采用熱水浸提、乙醇沉淀的方法提取多糖，然后運(yùn)用苯酚-硫酸法測多糖含量。分別從液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)，得出3種食用菌多糖提取的最優(yōu)組合。結(jié)果表明，影響香菇和金針菇多糖提取的主次因素是一致的，依次為浸提溫度、乙醇濃度、液料比；而對于黑木耳，液料比是最顯著的影響因素，其次為乙醇濃度、浸提溫度。最終測定的多糖含量香菇最高，為3.51%；其次為黑木耳，為3.50%；最低是金針菇，為2.94%。

關(guān)鍵詞：香菇；金針菇；黑木耳；多糖；提?。槐椒?硫酸法

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0347-03

食用菌中的多糖類物質(zhì)是增強(qiáng)免疫活性和抗衰老的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗輻射和降血壓等功能[1]。從食用菌中提取的多糖可作為配料添加到食藥保健品中，不僅沒有毒副作用，而且還能提供功效高、質(zhì)量好的產(chǎn)品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，食用菌中顯著增強(qiáng)癌癥患者抵抗力的生理活性物質(zhì)即為食用菌多糖[2]。香菇、金針菇、黑木耳都是日常生活中常見的食用菌，均含有十分豐富的多糖物質(zhì)。香菇多糖是一種天然人體免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)、抗病毒、抗感染以及延緩衰老等作用；金針菇多糖不僅能有效提高人體免疫力，而且還有抗感染、抗氧化、保肝保濕、輔助改善記憶和緩解體力疲勞等保健作用[3]；木耳多糖同樣是一類重要的活性物質(zhì)，在抗腫瘤、抗凝血、抗病毒等方面均有一定的生物活性。本研究主要以香菇、金針菇、黑木耳為原料，利用水提醇沉法提取多糖，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，分別從液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定最佳提取條件。最后運(yùn)用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并驗(yàn)證此方法的可行性。

1材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮香菇、金針菇、黑木耳購于丹尼斯超市。S2F-06A粗脂肪測定儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；7720N可見分光光度計(jì)，濟(jì)南海能儀器股份有限公司生產(chǎn)。

1.2食用菌多糖的提取方法

將購買的新鮮香菇、金針菇、黑木耳洗凈，然后放入烘箱中60 ℃烘干，待完全干燥后取出，于組織搗碎機(jī)中粉碎，過60目篩，置于干燥器中待用。

分別稱取干燥后的香菇、金針菇、黑木耳子實(shí)體粉末 10.00 g，用脂肪抽提器石油醚回流抽提除去脂肪，殘?jiān)鼡]干溶劑后，加入95%乙醇90 ℃回流提取2次，每次1.5 h，離心，揮干溶劑。將殘?jiān)謩e用300 mL（料液比1 ∶[KG-3]30）蒸餾水浸泡，水浴溫度95 ℃，浸提2 h，提取2次。合并提取液并將其濃縮至30 mL左右，用氯仿萃取3次，以除去蛋白質(zhì)。過濾后，向?yàn)V液中加入3倍體積的95%乙醇醇析，靜置過夜，多糖沉淀，過濾。濾餅分別用無水乙醇10 mL洗2次、用乙醚 10 mL 洗2次，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，即得粗多糖樣品。

1.3食用菌多糖提取的因素研究

1.3.1單因素試驗(yàn)選擇不同液料比，分別為20、25、30、35、40 mL/g，進(jìn)行多糖提取，比較液料比對多糖提取率的影響；控制浸提溫度分別為80、85、90、95、100 ℃進(jìn)行多糖提取，比較溫度對多糖提取率的影響；選擇浸提時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h進(jìn)行提取，比較時(shí)間對多糖提取率的影響；選擇乙醇濃度分別為75%、80%、85%、90%、95%進(jìn)行醇析沉淀，比較乙醇濃度對多糖提取率的影響。

1.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從液料比、浸提溫度、乙醇濃度這3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而進(jìn)一步確定最優(yōu)的提取條件。

1.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取在105 ℃下干燥至恒質(zhì)量的分析純葡萄糖對照品100 mg（稱準(zhǔn)至0.000 2 g），加水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再取25 mL 1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定容至 500 mL，使得溶液濃度為50 μg/mL。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL于7支具塞試管中，各用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻，于沸水浴中加熱10 min，冷卻，于490 nm波長測定吸光度，以吸光度（D）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.4.3換算因子的測定[4]準(zhǔn)確稱取60 ℃干燥至恒質(zhì)量的香菇、金針菇、黑木耳粗多糖各0.1 g，加入適量水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，作為多糖儲備液。準(zhǔn)確吸取上述溶液1.0 mL，按“1.4.2”節(jié)操作方法測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出粗多糖溶液中葡萄糖的濃度（C0）。按下式計(jì)算出換算因子：

[JZ（]f=m/（C0D0）。[JZ）][JY]（1）

式中：m為粗多糖質(zhì)量（μg）；C0為粗多糖液中葡萄糖的濃度；D0為粗多糖的稀釋倍數(shù)。

1.4.4樣品溶液的制備精確稱取香菇、金針菇、黑木耳粗多糖樣品粉末各0.1 g，置于燒瓶中，加95%乙醇100 mL，90 ℃ 提取1 h，過濾，濾餅用95%熱乙醇洗滌數(shù)次，然后將濾餅連同濾紙一起放入燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，100 ℃提取1 h，過濾，濾餅用熱蒸餾水洗滌數(shù)次，洗液并入濾液，冷卻后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，搖勻備用。

1.4.5多糖含量的測定準(zhǔn)確吸取上述樣品溶液1.0 mL于具塞試管中，按“1.4.2”節(jié)方法操作，測定樣液中葡萄糖的含量。平行測定3次，由回歸方程計(jì)算樣液中葡萄糖的含量，按下式計(jì)算樣品中多糖的含量：

[JZ（]多糖含量=（C·D·f/m）× 100%。[JZ）][JY]（2）

式中：C為樣品溶液中的葡萄糖濃度；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；f為換算因子；m為樣品的質(zhì)量（μg）。

1.4.6穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取3種樣品溶液適量，按“1.4.2”節(jié)方法，測其吸光度，每隔30 min測1次，連續(xù)測定6次，記錄結(jié)果。

1.4.7精密度試驗(yàn)分別取3種樣液適量，按“1.4.2”節(jié)方法，重復(fù)測定吸光度5次，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.8回收率試驗(yàn)取3種多糖樣品溶液1.0 mL于3支試管中，分別加入0.1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL），按“1.4.2”節(jié)方法，測其吸光度，重復(fù)操作3次，計(jì)算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1液料比對食用菌多糖提取率的影響不同液料比下所得提取率見圖1，在10～40 mL/g范圍內(nèi)，隨著液料比的增加，3種食用菌多糖的提取率均是先增后減，且在液料比為 30 mL/g 時(shí)，香菇多糖和金針菇多糖的提取率較高，而黑木耳多糖則是在35 mL/g左右。這主要是因?yàn)橐毫媳仍谝欢?程度上決定了多糖的提取率，當(dāng)其過低時(shí)會導(dǎo)致多糖提取不充分，而過高時(shí)又不易提取，因此選擇合適的液料比至關(guān)重要。

2.1.2浸提溫度對食用菌多糖提取率的影響不同浸提溫度下測定的多糖提取率見圖2，隨著溫度的上升，多糖的提取率也呈上升趨勢。這是由于浸提溫度較低時(shí)，溶質(zhì)的滲透能力和溶解能力也比較低，不利于多糖的浸出，從而導(dǎo)致多糖的提取率較低。但在90 ℃后變化很小，故90 ℃左右為較佳溫度。

2.1.4乙醇濃度對食用菌多糖提取率的影響不同乙醇濃度下所得多糖提取率見圖4，結(jié)果表明，多糖提取率隨著乙醇濃度的升高而上升，在95%的濃度下提取效果較好。這與乙醇沉淀多糖的原理是相通的，即通過降低水溶液的介電常數(shù)使多糖脫水從而產(chǎn)生沉淀來分離多糖，乙醇濃度越大，多糖的沉淀率越高。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1香菇多糖的提取從表2可以看出，處理組合A2B3D2提取率最高，為2.16%。通過極差分析，A、B、D 3個(gè)因素中浸提溫度為最主要因素，其次為乙醇濃度，最后是液料比[CM（25]，比較k值得最優(yōu)組合為A2B3D3，進(jìn)行試驗(yàn)得提取率為[CM）]

2.29%，高于A2B3D2條件下的提取率，故香菇多糖的最佳提取條件為A2B3D3，即液料比為30 mL/g，溫度為92 ℃，乙醇濃度為95%。

2.2.2金針菇多糖的提取從表2可以看出，處理組合A2B3D2，提取率最高，為3.03%。通過極差分析，3個(gè)因素對提取率的影響大小依次為浸提溫度、乙醇濃度、液料比，理論上最佳提取條件為A2B3D3，經(jīng)驗(yàn)證得，A2B3D3條件下的提取率為3.27%，高于3.03%，故金針菇多糖的最佳提取條件為A2B3D3，即液料比30 mL/g，溫度92 ℃，乙醇濃度95%。

2.2.3黑木耳多糖的提取從表2可以看出，處理組合A3B2D3提取率最高，為2.52%。通過極差分析，3個(gè)因素對提取率的影響為液料比>乙醇濃度>浸提溫度，最佳提取條件為A3B3D3，進(jìn)行試驗(yàn)得提取率2.49%，低于2.52%，表明A3B2D3組合才是木耳多糖的最佳提取條件，即液料比 32 mL/g，溫度90 ℃，乙醇濃度95%。

2.3食用菌多糖含量的測定

2.3.1[JP3]葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制求得回歸方程C=24.08×D+0.011，r=0.990。式中：C為葡萄糖濃度，D為測定的吸光度。

2.3.2換算因子的測定本試驗(yàn)中測得的換算因子為f香菇=3.427，f金針菇=3.046，f黑木耳=7.192。

2.3.3多糖含量的測定結(jié)果從表3可以看出，3種食用菌多糖含量的測定結(jié)果，香菇中多糖含量最高，其次為黑木耳，金針菇多糖含量最低。

3結(jié)論

影響香菇、金針菇多糖提取率的主次因素是一致的，依次為浸提溫度、乙醇濃度、液料比； 影響黑木耳多糖提取率的最顯著因素為液料比，然后依次為乙醇濃度、浸提溫度。正交試驗(yàn)結(jié)果，香菇、金針菇在液料比30 mL/g、浸提溫度90 ℃、乙醇濃度95%的條件下提取率較高，黑木耳多糖的最佳提取條件則是液料比32 mL/g、浸提溫度90 ℃、乙醇濃度95%。在對多糖含量的測定試驗(yàn)中，通過穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)及回收率試驗(yàn)，表明苯酚-硫酸法簡單易行，結(jié)果可靠，是較好的測定方法。3種多糖含量的測定結(jié)果由高到低依次順序?yàn)橄愎?、黑木耳、金針菇?/p>

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