黃博聞+劉茜+郜華僑+張陽(yáng)+劉金蘭

摘要：從患有腐皮病的錦鯉（Cryprinus carpio）肝、腎、脾、血液里分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)該菌進(jìn)行純化培養(yǎng)并經(jīng)人工感染試驗(yàn)，確定該菌為病原菌。經(jīng)16S rRNA序列分析，鑒定該病原菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。用不同濃度福爾馬林和不同溫度滅活蠟樣芽孢桿菌，篩選其滅活效果并制得滅活疫苗。將滅活疫苗免疫健康錦鯉后測(cè)定其抗體效價(jià)變化及免疫保護(hù)率。結(jié)果表明，0.2%的福爾馬林溶液在28 ℃下滅活24 h及4 ℃滅活36 h為蠟樣芽胞桿菌的適宜滅活條件。首次免疫后第20天，免疫Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組血清抗蠟樣芽孢桿菌的抗體效價(jià)達(dá)到高峰，分別為1∶128、1∶64、1∶64、1∶32；第30天同樣劑量加強(qiáng)免疫后，各免疫組血清抗體效價(jià)達(dá)到更高水平，分別為1∶256、1∶256、1∶128、1∶64；免疫后第50天時(shí)攻毒，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組免疫保護(hù)率分別為66%、66%、55%、44%。

關(guān)鍵詞：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；錦鯉（Cryprinus carpio）；滅活疫苗；抗體效價(jià)；免疫保護(hù)力

中圖分類號(hào)：S942.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5320-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.038

Abstract： A dominant bacteria strain was isolated from the liver，kidney，spleen and blood of diseased Cryprinus carpio and confirmed as pathogenic bacteria strain by purified culture and artificial infection. It was identified as Bacillus cereusr by 16SrRNA sequence analysis. The optimal inactivated condition for preparing the inactivated vaccine of Bacillus cereusr was determined through treated with different concentrations of formalin and temperature on bacteria. The antibody titers of serum and relative percentage of survival（RPS） were determined after immune healthy Cryprinus carpi. The results showed that the optimal inactivation conditions of Bacillus cereusr were 28 ℃ for 24 h or 4 ℃ for 36 h with the concentration of 0.2% formalin. On the 20th day after the first immunization the serum antibody titer of Cryprinus carpi against Bacillus cereus reached the peak and that of immunized groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ were 1∶128，1∶64，1∶64 and 1∶32，respectively. The antibody titers of all immunized groups reached a higher level when got second immunization with the same dose as the first immunization and that of groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳwere 1∶256，1∶256，1∶128 and 1∶64 on the 30th day after the first immunization，respectively. The RPS of immunized groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ were 66%，66%，55% and 44% on the 50th day after the first immunization，respectively.

Key words：Bacillus cereus； Cryprinus carpio； inactivated vaccine； antibody titres； relative percent survival（RPS）

錦鯉（Cyprinus carpio）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinid）鯉屬（Cryprinus），為大型觀賞魚類。近年來(lái)錦鯉養(yǎng)殖密度越來(lái)越大，加上水質(zhì)不易調(diào)控，導(dǎo)致錦鯉腐皮病發(fā)病率居高不下[1]，不僅影響了錦鯉的觀賞價(jià)值，還易引起錦鯉大量死亡。目前從魚類腐皮病上已分離到的致病菌有點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas punctata Sub. punctata）、殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）和維氏氣單胞菌（A.veronii）[2-5]，對(duì)這些病原菌的抑制或殺滅多是采用抗生素類藥物[6，7]，但長(zhǎng)期使用抗生素類藥物導(dǎo)致病原菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，同時(shí)對(duì)養(yǎng)殖水體也造成一定的污染。已有研究表明水產(chǎn)疫苗對(duì)魚類具有良好的免疫保護(hù)效果，同時(shí)可增強(qiáng)魚體抗應(yīng)激能力，且符合友好環(huán)境的要求[8]。目前水產(chǎn)動(dòng)物疫苗研制集中于大規(guī)模養(yǎng)殖的食用魚疾病[2-5]，多采用注射免疫途徑，給苗不便成為制約水產(chǎn)疫苗推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素[8]。而錦鯉養(yǎng)殖具有養(yǎng)殖水體小、養(yǎng)殖數(shù)量少、易于操作和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)為疫苗的實(shí)施提供了可行性。本試驗(yàn)旨在通過(guò)研制錦鯉腐皮病安全有效的滅活疫苗并用于臨床預(yù)防，為錦鯉腐皮病防控提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與鑒定

1.1.1 病原菌分離 患病錦鯉取自北京市某錦鯉養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)15.2～18.5 cm，體重105.7～130.6 g。臨床癥狀主要表現(xiàn)為病魚軀干部和鰭基部等部位伴有充血、出血、鱗片脫落、肌肉外露等潰瘍?cè)?。在超凈工作臺(tái)解剖有典型病癥的患病錦鯉，取病魚的肝、脾、腎、血液組織劃線接種于普通固體培養(yǎng)基上，28 ℃于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落重復(fù)劃線于普通固體培養(yǎng)基上，獲得的純化菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 人工感染 將分離到的細(xì)菌接種于普通固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用0.8%無(wú)菌生理鹽水洗脫平板菌苔，制成濃度為1×108 CFU/mL的菌懸液備用。試驗(yàn)魚由天津市鯉魚良種場(chǎng)提供，養(yǎng)殖于圓形水泥池（直徑為1.2 m、高1.0 m），池水預(yù)消毒曝氣5 d。將20尾健康錦鯉（體重101.3～122.1 g，體長(zhǎng)13.5～16.7 cm）分兩組，每組10尾，暫養(yǎng)5 d后一組腹腔注射0.2 mL/尾菌懸液（1×108 CFU/mL），另一組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水（0.2 mL/尾）。飼養(yǎng)過(guò)程中24 h氣泵增氧，三日換水量為1/3，正常投喂配合飼料，記錄魚體發(fā)病及死亡情況。取感染致死的錦鯉內(nèi)臟組織和血液進(jìn)行細(xì)菌再分離。

1.1.3 病原菌鑒定 16S rRNA序列分析：使用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取細(xì)菌DNA，作為PCR反應(yīng)模板備用。引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）（北京生工生物工程有限公司合成）。將引物稀釋至5 μmol/L，-20 ℃存儲(chǔ)備用。PCR反應(yīng)體系25 μL：正反引物各1 μL，模板2 μL， MgCl2 2 μL，dNTP 0.5 μL，PCR buffer 2.5 μL，Taq聚合酶0.3 μL，用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性50 s；50 ℃退火50 s；72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將序列與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)分析，用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 疫苗的制備

1.2.1 疫苗制備及條件的確定 用無(wú)菌蒸餾水將福爾馬林配制成梯度濃度0.2%、0.4%、1.0%、2.0%、3.0%，分別與濃度為2×109 CFU/mL的菌懸液等體積混合，每梯度設(shè)3個(gè)平行。將混合液置于28 ℃恒溫?fù)u床（80 r/min）滅活48 h；用同樣方法配制福爾馬林和細(xì)菌混合液置于4 ℃滅活。以上滅活過(guò)程中每12 h取0.2 mL菌液均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察并記錄是否有菌長(zhǎng)出。將濃度為1×109 CFU/mL的菌懸液分別置于60 ℃與72 ℃恒溫水浴鍋熱滅活12 h，每隔2 h取樣檢測(cè)細(xì)菌滅活情況。

將最佳滅活條件滅活的菌液4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌3次，并重懸菌體，使?jié)舛燃s為1×109 CFU/mL與4×109 CFU/mL，4 ℃儲(chǔ)存待用。

1.2.2 疫苗的安全性檢測(cè) 將待用疫苗涂布于普通固體培養(yǎng)基上，每組3個(gè)平行，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察有無(wú)菌長(zhǎng)出。用待用疫苗腹腔注射10尾健康錦鯉，每尾0.2 mL，持續(xù)10 d觀察魚的攝食情況、發(fā)病癥狀及死亡情況并記錄。

1.3 錦鯉的免疫

試驗(yàn)錦鯉來(lái)自天津市鯉魚良種培育場(chǎng)，魚體體長(zhǎng)12.8～17.7 cm，體重100.5～123.3 g，試驗(yàn)在該場(chǎng)水泥池中進(jìn)行，正常飼喂配合飼料，24 h氣泵增氧，三日換水量為1/3。試驗(yàn)分為免疫組與對(duì)照組，免疫組設(shè)四個(gè)處理水平，記為Ⅰ組（28 ℃條件下濃度為4×109 CFU/mL滅活疫苗組）、Ⅱ組（28 ℃條件下濃度為1×109 CFU/mL滅活疫苗組）、Ⅲ組（4 ℃條件下濃度為4×109 CFU/mL滅活疫苗組）、Ⅳ組（4 ℃條件下濃度為1×109 CFU/mL滅活疫苗組），每處理水平設(shè)3個(gè)平行，每平行各10尾錦鯉。每尾錦鯉腹腔注射0.2 mL疫苗。對(duì)照組注射0.8%無(wú)菌生理鹽水，每尾0.2 mL。第一次免疫30 d后，采用相同的方法與劑量加強(qiáng)免疫。

1.4 抗體效價(jià)測(cè)定

采用96孔血凝板法測(cè)定血清抗體效價(jià)。首次免疫后每隔5 d從免疫組各處理水平與對(duì)照組中隨機(jī)取5尾魚，尾部靜脈取血；加強(qiáng)免疫后每隔10 d采用相同方法采血。血樣室溫靜置2 h，然后放置于4 ℃冰箱5 h，4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min，收集上層血清。以濃度為4×109 CFU/mL的蠟樣芽孢桿菌菌懸液為抗原檢測(cè)血清抗體效價(jià)。

1.5 免疫保護(hù)率測(cè)定

首次免疫60 d后，隨機(jī)從免疫組與對(duì)照組中各取10尾試驗(yàn)魚，分別向腹腔注射0.2 mL的1×108 CFU/mL蠟樣芽孢桿菌活菌，連續(xù)觀察10 d，記錄各組死亡情況，解剖檢查并記錄死亡魚體表及各組織器官病變情況。按下列公式計(jì)算免疫保護(hù)率（RPS）：

免疫保護(hù)率=（對(duì)照組死亡率-試驗(yàn)組死亡率）/對(duì)照組死亡率×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

從患病錦鯉體表病灶處及實(shí)質(zhì)器官中分離獲得一株疑似致病菌，命名為J1。普通固體培養(yǎng)基上菌落為圓形、中央隆起、邊緣波狀、白色。細(xì)菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性，長(zhǎng)桿狀，有芽孢。

通過(guò)對(duì)分離菌株J1的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小約為1 500 bp的片段，測(cè)序后得到長(zhǎng)度為1 300 bp 16S rRNA基因序列（圖1）。將獲得的J1測(cè)序序列在NCBI上進(jìn)行同源性比較，使用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，J1菌株與蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）聚為一類（圖2）。

2.2 人工感染試驗(yàn)

攻毒錦鯉10尾，9尾發(fā)病，主要癥狀為體表黏液減少、局部充血、潰爛，發(fā)病癥狀與自然死亡錦鯉相同，第九天死亡率達(dá)90%，對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)臨床病癥及死亡，由此判斷蠟樣芽孢桿菌為錦鯉腐皮病的致病菌。

2.3 細(xì)菌滅活及疫苗制備

在4 ℃條件下，當(dāng)福爾馬林終濃度為0.1%時(shí)，需48 h完全滅活，其他濃度組在36 h內(nèi)完全滅活；在28 ℃條件下，病原菌在各濃度梯度福爾馬林溶液里36 h內(nèi)即完全滅活，福爾馬林終濃度越高，滅活所需時(shí)間越短（表1）。而在60 ℃與72 ℃條件下，滅活24 h后均有細(xì)菌存活。綜合考慮福爾馬林濃度和滅活時(shí)間，選擇終濃度0.2%的福爾馬林4 ℃滅活36 h和28 ℃滅活24 h為蠟樣芽孢桿菌疫苗制備條件。

2.4 滅活疫苗安全性檢測(cè)

將試驗(yàn)疫苗涂布于普通固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d后平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，即判斷為病原菌完全滅活。將疫苗腹腔注射健康錦鯉（0.2 mL/尾），10 d后所有魚均存活，攝食良好，表明疫苗安全。

2.5 抗體效價(jià)與免疫保護(hù)率

以蠟樣芽孢桿菌為抗原檢測(cè)免疫錦鯉的血清抗體效價(jià)。結(jié)果（圖3）表明，錦鯉經(jīng)免疫后抗體效價(jià)水平有上升趨勢(shì)。在首次免疫5 d后可以檢測(cè)到抗體產(chǎn)生，20 d后達(dá)到高峰，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組抗體效價(jià)分別為1∶128、1∶64、1∶64、1∶32，之后各免疫組抗體效價(jià)水平開始緩慢下降，免疫后第30天時(shí)，各免疫組抗體效價(jià)水平回落至1∶16；第30天加強(qiáng)免疫后免疫組血清抗體效價(jià)水平快速提升，于50 d后達(dá)到最高值，分別為1∶256、1∶256、1∶128、1∶64，60 d時(shí)抗體效價(jià)水平仍維持在較高水平，對(duì)照組均不超過(guò)1∶4。

首次免疫后第60天腹腔注射1×108 CFU/mL蠟樣芽孢桿菌懸液攻毒錦鯉，對(duì)照組在攻毒第三天部分魚體表出現(xiàn)黏液減少、部分組織充血、出血；第六天時(shí)出現(xiàn)死亡，第九天時(shí)死亡率達(dá)到90%。而免疫組在攻毒后第八天開始死亡，10 d后無(wú)繼續(xù)死亡。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組免疫保護(hù)率分別為66%、66%、55%、44%（表2）。

3 小結(jié)與討論

蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于各種環(huán)境中，是一種具有發(fā)展前景的益生菌，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用[9，10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌可引起錦鯉腐皮病，駱?biāo)囄牡萚11]也從患有腐皮病綜合征的刺參上分離到該菌，通過(guò)人工回感試驗(yàn)證明其具有致病性。因此，蠟樣芽孢桿菌作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的安全性有待進(jìn)一步論證。

一般認(rèn)為，較溫和的滅活條件，如較低的溫度與較低的福爾馬林濃度或較短的福爾馬林作用時(shí)間，有利于抗原得到保護(hù)[12-14]。但在本試驗(yàn)中，4 ℃條件下使用終濃度為0.2%的福爾馬林滅活36 h，抗體效價(jià)水平明顯低于28 ℃條件下滅活的疫苗，這與楊先樂(lè)等[13]的報(bào)道相近。血清抗體效價(jià)和相對(duì)免疫保護(hù)力是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的重要參數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在適合條件下完全滅活的蠟樣芽孢桿菌疫苗免疫健康錦鯉后，血清抗體效價(jià)最高達(dá)1∶256，并能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)受免魚用蠟樣芽胞桿菌攻毒后，免疫保護(hù)率最高達(dá)66%，表明錦鯉對(duì)蠟樣芽孢桿菌滅活疫苗能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并可有效抵擋蠟樣芽孢桿菌的感染。該疫苗制備操作簡(jiǎn)單，滅活時(shí)間短，所需滅活劑濃度低，且在錦鯉上注射免疫易操作，筆者認(rèn)為該滅活疫苗對(duì)錦鯉腐皮病防控具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅 琳，馬志宏，李鐵梁.錦鯉體表潰爛病的實(shí)用防治方法[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2009（11）：53-54.

[2] 溫海深，劉振琦.鯽腐皮病病原菌的初步研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，10（1）：49-55.

[3] 曹紅梅，劉 力，沙 莎，等.大西洋鮭腐皮病研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（9）：192-193.

[4] 張偉妮，朱志華，陳志偉，等.日本鰻鱺腐皮病病原菌的分離及鑒定[J].淡水漁業(yè)，2010，40（2）：41-46.

[5] 張秋勝，陳昌福.異育銀鯽對(duì)嗜水氣單胞菌滅活菌苗的免疫應(yīng)答[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（3）：271-274.

[6] 姜 娜，馬志宏，李鐵梁，等.錦鯉潰瘍病病原菌的分離及16SrRNA鑒定[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012（2）：174-177.

[7] 毛海濤，王淑雯，周 穎，等.一株錦鯉致病菌的鑒定及生物學(xué)特性研究[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2015，42（1）：38-41.

[8] 王玉堂.疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的作用及應(yīng)用前景[J].中國(guó)水產(chǎn)，2013（3）：42-45.

[9] 張立娜，羅立新.一株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的蠟樣芽胞桿菌的鑒定及其抑菌物質(zhì)性質(zhì)[J].中國(guó)釀造，2012，31（2）：99-102.

[10] 于明超，李卓佳，文國(guó)樑.芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中的研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（11）：78-81.

[11] 駱?biāo)囄?，郝志凱，王印庚，等.一株引起刺參“腐皮綜合征”的蠟樣芽孢桿菌[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2009，36（2）：60-63.

[12] 楊先樂(lè)，左文功.草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的研究—最佳滅活方法的探討[J].魚病簡(jiǎn)訊，1989（2）：11-15.

[13] 楊先樂(lè)，周建光，艾曉輝，等.中華鱉嗜水氣單胞茵滅活方法的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，17（4）：389-394.

[14] 陳月英，錢 冬，沈智華.養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性敗血癥的菌苗制備技術(shù)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996，20（2）：125-131.