趙麗敏, 陳麗妮, 趙書林*

(1. 安陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心， 河南 安陽 455000；2. 廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 教育部藥用資源化學(xué)與藥物分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 桂林 541004)

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基于石墨烯量子點(diǎn)的熒光探針應(yīng)用于抗壞血酸檢測的研究

趙麗敏1, 陳麗妮2, 趙書林2*

(1. 安陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心， 河南 安陽 455000；
2. 廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 教育部藥用資源化學(xué)與藥物分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 桂林 541004)

基于石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)的熒光性能建立了一種非標(biāo)記熒光方法，用于靈敏和選擇性測定抗壞血酸(AA)。GQDs溶液在紫外光激發(fā)下發(fā)出很強(qiáng)的藍(lán)色熒光，當(dāng)向溶液中加入AA后，GQDs溶液的熒光被猝滅。猝滅機(jī)理可能為在弱酸性介質(zhì)中，AA與GQDs發(fā)生氧化還原反應(yīng)，AA轉(zhuǎn)移電子給GQDs。熒光猝滅強(qiáng)度與AA濃度在5.0×10-6～7.5×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限低至1.0×10-6mol/L。該體系成本低、操作簡單，并且在多種可能干擾的物質(zhì)存在下對(duì)AA表現(xiàn)出很高的選擇性。本方法應(yīng)用于生物樣品中AA的檢測，回收率在95.2%～115.3%之間。

石墨烯量子點(diǎn)； 熒光探針； 非標(biāo)記方法； 抗壞血酸

1 引 言

石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)是最近發(fā)現(xiàn)的粒徑小于100 nm具有0維結(jié)構(gòu)的石墨烯納米片[1-3]。與石墨烯類似，GQDs也有大的表面積和π-π共軛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。作為一種新的碳納米熒光材料，GQDs由于其優(yōu)越的光穩(wěn)定性、優(yōu)良的光學(xué)和電化學(xué)性能、高的熒光活性、抗光漂白能力和低細(xì)胞毒性[4-8]，已經(jīng)在化學(xué)、材料、物理學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域引起較大關(guān)注并成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，目前已用于氯離子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三價(jià)鐵離子[12]、過氧化氫[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白G[16]、生物巰基化合物[17-18]、脫氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的檢測，以及用于藥物釋放[21]和生物成像[22-24]等領(lǐng)域。

抗壞血酸(AA)是一種重要的抗氧化劑，在人體平衡氧化壓力中起重要作用。AA在人體液中存在的濃度相對(duì)較高，例如，人血液中AA的濃度為6～15 μg/mL[25]。AA是治療壞血病、藥物中毒、肝臟疾病、過敏反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，并能幫助促進(jìn)健康細(xì)胞的發(fā)展、鈣的吸收和正常組織的生長。在制造果汁和飲料時(shí)，AA也作為一種抗氧化劑使用。因此，AA的檢測對(duì)制藥、臨床和食品工業(yè)均具有重要意義[26]。目前檢測AA的方法主要有電化學(xué)方法[27]、化學(xué)發(fā)光法[28]、高效液相色譜法[29]、分光光度法[30]、毛細(xì)管電泳法[31]和熒光分析法[32]等。電化學(xué)方法由于靈敏度高，是檢測AA的主要方法。但是，與AA具有相似還原性質(zhì)的分子如尿酸(UA)和多巴胺(DA)對(duì)該方法造成的干擾較大，而且AA的氧化產(chǎn)物會(huì)吸附在電極表面，影響體系的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。熒光分析法具有簡單、方便和快速等優(yōu)點(diǎn)。 因此，本工作以GQDs作為熒光探針，建立了基于GQDs的熒光猝滅檢測AA的新方法。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1儀器與試劑

LS-55型發(fā)光光度計(jì)(Perkin-Elmer，USA)；Cary 60型紫外可見分光光度計(jì)(Agilent Technologies, USA)；PHSJ-4A型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XW-80A型漩渦振蕩混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)等；SZCL-3B數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；78-1磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)；BS 110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；FL3-P-TCSPC時(shí)間分辨熒光儀(HORIBA JOBIN JVON，F(xiàn)rance)；JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(JEOL)；Multimode 8原子力顯微鏡(Bruker，USA)。

抗壞血酸(AA)、人血清白蛋白(HSA)購于美國Sigma-Aldrich公司；多巴胺(DA)購于Alfa Aesar公司；D-色氨酸(D-Trp)、DL-蘇氨酸(DL-Thr)、L-α-丙氨酸(L-α-Ala)、L-組氨酸(L-His)、D-絲氨酸(D-Ser)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-苯丙氨酸(L-Phe)由中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司提供；尿酸(UA)購于上海生工生物有限公司；半乳糖(Gal)、果糖(Fru)、甘露糖(Man)購于比利時(shí)Acros Organics公司；檸檬酸購于廣州化學(xué)試劑廠。

實(shí)驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ·cm的超純水。

實(shí)驗(yàn)所用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液(1.0×10-2mol/L，pH 4.0～7.5)：稱取0.78 g NaH2PO4·2H2O，溶于450 mL超純水中，定容至500 mL，用H3PO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值。

2.2人血清樣品的預(yù)處理

人血清樣品取自桂林市第五人民醫(yī)院。取200 μL人血清，置于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈，漩渦震蕩混合5 min，在高速冷凍離心機(jī)上以1.2×104r/min的速度離心20 min，取上層清液，用氮?dú)獯蹈?，殘留物? 000 μL超純水溶解，試液置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3GQDs的合成

GQDs的合成方法參照文獻(xiàn)[33]。稱取2.0 g檸檬酸加入試管中，加熱至200 ℃，當(dāng)檸檬酸全部融化后開始計(jì)時(shí)。20 min后，溶液顏色變?yōu)殚偌t色。在磁力攪拌作用下，將橘紅色液體用滴管逐滴加入100 mL 含10 mg NaOH的溶液中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，得到GQDs水溶液，濃度為14 mg/mL，于4 ℃下避光保存。

2.4實(shí)驗(yàn)方法

在一系列0.6 mL的離心管中，依次加入10 μL 1.4 mg/mL GQDs、10 μL不同濃度的AA以及80 μL pH=4.5的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后，在37 ℃下孵育4 h。冷卻后，采用LS-55型發(fā)光光度計(jì)(Perkin-Elmer，USA)記錄樣品在453 nm處的熒光強(qiáng)度，設(shè)置電壓為750 V，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為15 nm，掃描速度為1 000 nm/min，激發(fā)波長為367 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1GQDs的表征

所合成的GQDs的透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡圖像、紅外光譜、紫外吸收光譜和熒光光譜均參見文獻(xiàn)[34]。本實(shí)驗(yàn)合成的GQDs的粒徑為17～21 nm，平均厚度為1.5 nm。GQDs表面存在羧基和羥基，這些官能團(tuán)賦予了GQDs優(yōu)良的水溶性。GQDs在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，在360 nm處有一吸收峰，并且在365 nm紫外燈照射下可觀察到藍(lán)色熒光。GQDs具有對(duì)稱的激發(fā)和發(fā)射光譜，其最大激發(fā)波長為367 nm，最大發(fā)射峰波長為453 nm。

3.2熒光猝滅機(jī)理

GQDs的熒光猝滅機(jī)理如圖1所示。GQDs本身在激發(fā)光照射下發(fā)出藍(lán)色熒光。已有研究證明，氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)能被AA還原[35]。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)合成的GQDs表面帶有—COOH，與GO具有相似的表面基團(tuán)，因此加入AA后，AA與GQDs發(fā)生氧化還原反應(yīng)，AA被氧化為脫氫抗壞血酸(dehydro-AA)并轉(zhuǎn)移電子給GQDs，GQDs的熒光被猝滅。

圖1 基于GQDs的熒光傳感體系檢測AA的原理圖

3.2.1 紫外吸收光譜

猝滅機(jī)理也可通過紫外光譜來證明。如圖2所示，加入AA后，GQDs在360 nm處的特征峰消失，說明GQDs與AA反應(yīng)生成了其他物質(zhì)。

圖2 AA加入前后的GQDs的紫外-可見吸收光譜

Fig.2 UV-Vis absorption spectra of GQDs in the absence and presence of AA

3.2.2 熒光壽命

為了進(jìn)一步證實(shí)AA對(duì)GQDs的猝滅機(jī)理，實(shí)驗(yàn)測定了體系的熒光壽命。圖3是AA加入前后GQDs的熒光衰減曲線。

圖3 AA加入前后的GQDs的熒光衰減動(dòng)力學(xué)曲線

Fig.3 Fluorescence decay curves of GQDs in the absence and presence of AA

表1是GQDs猝滅前后的熒光壽命值。從表中可以看到，AA加入前后，體系的熒光壽命發(fā)生了明顯變化，說明猝滅過程是動(dòng)態(tài)猝滅[36-37]。動(dòng)態(tài)猝滅是碰撞過程，因此AA猝滅GQDs的熒光機(jī)理可解釋如下：

GQDs-+AA+(還原態(tài)的電子轉(zhuǎn)移)[38]

激發(fā)態(tài)分子*GQDs遇到AA，兩者相互作用導(dǎo)致電子和能量的轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致*GQDs的熒光猝滅。

表1 GQDs猝滅前后的熒光壽命

3.3可行性驗(yàn)證

為了考察本方案的可行性，我們對(duì)GQDs與AA反應(yīng)前后的樣品溶液進(jìn)行了熒光光譜掃描，如圖4所示。AA加入后，GQDs 在453 nm的熒光強(qiáng)度降低，熒光被猝滅了79.6%，說明該方法能用于AA的檢測。

圖4 AA加入前后的GQDs熒光光譜

Fig.4 Fluorescence spectra of GQDs in the absence and presence of AA

3.4AA與GQDs作用時(shí)間的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了AA加入后，GQDs溶液的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖5所示。從圖中可見，體系的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長而逐漸下降，在大約4 h以后，熒光強(qiáng)度降低速度減慢，之后熒光強(qiáng)度變化不大。為了保證測定的靈敏度同時(shí)縮短分析時(shí)間，實(shí)驗(yàn)選擇4 h作為AA與GQDs的作用時(shí)間。

圖5 體系熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線

Fig.5 Time-dependent fluorescence response of the proposed method

3.5pH值的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)以磷酸鹽為緩沖液，考察其pH值對(duì)AA猝滅GQDs熒光的影響，結(jié)果如圖6所示。GQDs本身的熒光會(huì)受pH的影響。當(dāng)pH在4.0～7.5之間時(shí)，GQDs的熒光隨pH的升高而增強(qiáng)，但體系在pH=4.5時(shí)有最高的信噪比。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH=4.5的磷酸鹽緩沖液作為AA與GQDs的反應(yīng)緩沖液。

圖6 pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

Fig.6 Fluorescence response of the proposed method at different pH values

3.6線性范圍和檢出限

在上述優(yōu)化的條件下，實(shí)驗(yàn)對(duì)一系列不同濃度的AA進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，隨著AA濃度的增大，體系在453 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，并且熒光強(qiáng)度值的比值F0/F(F0為GQDs的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入AA之后體系的熒光強(qiáng)度)與AA的濃度在5.0×10-6～7.5×10-5mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為F0/F=0.0537C+ 0.7467，R=0.997 1(C為AA的濃度，單位10-6mol/L)，檢測限(3σ，σ=S0/S，S0為空白溶液多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)為1.0×10-6mol/L。我們將本方法與其他檢測AA的方法做了對(duì)比，見表2。從表2中可以看出，該方法與其他方法相比具有較高的靈敏度。

圖7 (a)檢測體系在不同濃度AA存在下的熒光光譜；(b)熒光強(qiáng)度比值對(duì)AA濃度之間的線性曲線。

Fig.7 (a) Fluorescence emission spectra of the sensing system after addition of various amounts of AA (a-j: 0, 5.0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 500×10-6mol/L). (b) Relationship between the florescence quenching and the concentration of AA.

表2 檢測AA的方法對(duì)照

為了考察該方法的精密度，實(shí)驗(yàn)將7.5×10-5mol/L AA與GQDs反應(yīng)進(jìn)行了11次平行測定，得到熒光強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%。

3.7特異性考察

為了考察所建立方法的特異性，實(shí)驗(yàn)選用幾種糖類以及HSA、尿素(Urea)和幾種氨基酸作為對(duì)照樣品進(jìn)行分析。GQDs的濃度為0.14 mg/mL，AA的濃度為7.5×10-5mol/L，其他作為干擾物質(zhì)的濃度均為7.5×10-5mol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出，只有AA的加入能引起信號(hào)的明顯變化，其他物質(zhì)均不存在干擾，特別是DA、UA這兩種與AA有相似電化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，也不存在干擾。因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中，AA與GQDs的反應(yīng)介質(zhì)為pH=4.5的磷酸鹽緩沖液，在這個(gè)pH值下，DA、UA均不干擾AA的測定。

圖8 干擾存在下的信號(hào)響應(yīng)圖

3.8實(shí)際樣品分析

為了考察本研究所建立的方法是否可用于實(shí)際樣品的檢測，實(shí)驗(yàn)對(duì)人血清樣品進(jìn)行了分析。

表3 人血清樣品中AA的測定

從醫(yī)院取的血清樣品按照2.2節(jié)方法進(jìn)行處理，在稀釋50倍后的血清中進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表中可以看到，人血清中AA的加標(biāo)回收率在95.2%～115.3%范圍內(nèi)。

4 結(jié) 論

建立了一種基于GQDs熒光猝滅檢測AA的新方法，該方法操作簡便，靈敏度高，檢出限低至1.0×10-6mol/L，特異性強(qiáng)，一些糖類和氨基酸的存在均不干擾AA的測定，甚至是與AA有相似電化學(xué)性質(zhì)的DA、UA的存在對(duì)AA的檢測也沒有影響。本實(shí)驗(yàn)用到的所有原料都價(jià)廉易得且不需要任何修飾過程，GQDs相對(duì)于其他量子點(diǎn)的合成更簡單而且具有低毒性，有望應(yīng)用于生物體內(nèi)生物活性物質(zhì)的檢測。

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趙麗敏(1987-)，女，河南安陽人，助理工程師，2014年于廣西師范大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事新型碳納米發(fā)光材料、化學(xué)與生物傳感器、石油化工等方面的研究。

E-mail: lynuzhaolimin_ok@126.com趙書林(1957-)，男，湖南慈利人，博士，教授，2006年于四川大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事納米材料、化學(xué)與生物傳感器、微流控芯片分析、毛細(xì)管電泳分析、單細(xì)胞分析及藥物活性成分的篩選等方面的研究。

E-mail: zhaoshulin001@163.com

Detection of Ascorbic Acid by Fluorescence Probe Based on Graphene Quantum Dots

ZHAO Li-min1, CHEN Li-ni2, ZHAO Shu-lin2*

(1.QualityandTechnicalSupervision,InspectionandTestingCenter，Anyang455000,China;
2.KeyLaboratoryforTheChemistryandMolecularEngineeringofMedicinalResourcesofEducationMinistry,
CollegeofChemistryandPharmacy,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China)
*CorrespondingAuthor,E-mail:zhaoshulin001@163.com

A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantum dots (GQDs) was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid (AA). The initial strong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition of AA. The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDsviathe redox reaction of AA and GQDs in weak acid solution. The quenching efficiency was linearly proportional to the concentration of AA within the range of 5.0×10-6-7.5×10-5mol/L with a low detection limit down to 1.0×10-6mol/L. The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experimental operations, and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species. Additionally, this method was successfully applied to the determination of AA in biological samples with satisfactory recoveries (95.2%-115.3%).

graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid

2016-06-23；

2016-09-23

國家自然科學(xué)基金(21305020,21175030)； 廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFBA118041)資助項(xiàng)目 Supported by Natural Science Foundation of China(21305020,21175030); Natural Science Foundation of Guangxi Province of China(2014GXNSFBA118041)

1000-7032(2017)01-0124-08

O482.31

A

10.3788/fgxb20173801.0124