李響董波,2,3

(1.中國海洋大學海洋生命學院,青島266003;2.中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所,青島266003;3.青島海洋科學與技術國家實驗室,青島266100)

CRISPR/Cas9技術及其在海洋生物中的應用現(xiàn)狀與展望

李響1董波1,2,3

(1.中國海洋大學海洋生命學院,青島266003;2.中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所,青島266003;3.青島海洋科學與技術國家實驗室,青島266100)

CRISPR系統(tǒng)是細菌對抗噬菌體和外源質粒的一種獲得性免疫系統(tǒng),基于細菌Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)開發(fā)的CRISPR/Cas9技術體系是目前適用范圍最廣、效率最高的基因編輯工具。與鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALEN)技術相比,CRISPR/Cas9具有簡便、高效、廉價等優(yōu)點。目前CRISPR/Cas9技術已經(jīng)成功應用于大多數(shù)模式生物的基因編輯,但其在海洋生物中的應用才剛剛開始。文章將從CRISPR/Cas9技術入手,介紹其發(fā)展過程、作用機制、應用現(xiàn)狀,并分析其在海洋生物中的應用與前景展望,以期推動這一技術在更多海洋生物研究中得到應用,解決限制海洋生物功能基因驗證和深度開發(fā)海洋生物基因資源等方面的難題。

CRISPR/Cas9;基因編輯;海洋生物;功能驗證;基因資源

21世紀被稱為“海洋的世紀”,占地球表面積71%的海洋,孕育著數(shù)量龐大的海洋生物,截止2007年中國海域記錄的海洋生物種類為22629種[1],并不斷有新報道的海洋物種。這些海洋生物中一部分是人類重要的食物來源,如魚蝦貝藻等經(jīng)濟種類都是我國人民餐桌上的美味。另外,由于某些海洋生物為適應海洋環(huán)境所進化形成的獨特身體結構,使其成為生物學基礎研究的優(yōu)良模式生物。海膽是人類較早使用的模式生物,早在19世紀90年代,科學家就用海膽作為材料開展了受精生物學和發(fā)育生物學的研究,證明了動物胚胎發(fā)育存在調整型發(fā)育[2]。尾索動物海鞘由于其卵和幼體透明,結構簡單,基因組較小且為單拷貝,并且在進化上是最接近脊椎動物的無脊椎動物,也是人們較早利用開展進化發(fā)育生物學研究的模式動物[3]。鑒于海洋生物的經(jīng)濟和科研價值,對其基礎及應用研究也在不斷深入。

近十年來,隨著第二代高通量測序技術的發(fā)展,



玻璃海鞘(Ciona intestinalis)[4]、薩氏海鞘Ciona savignyi)[5]、海膽(Strongylocentrotus purpuratus)[6]、住囊蟲(Oikopleura dioica)[7]、佛羅里達文昌魚(Branchiostoma floridae)[8]、牡蠣(Crassostrea gigas)[9]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[10]、大黃魚(Larimichthys crocea)[11]、海帶(Saccharina japonica)[12]等大量海洋生物的基因組被測定,這為海洋生物學的研究者們提供了比以往更加豐富的遺傳基因資源。然而海洋生物普遍存在生長周期長,生活環(huán)境復雜的特點,大多難以在實驗室條件下長期養(yǎng)殖,僅僅依靠傳統(tǒng)的正向遺傳學方法進行研究費時費力,已經(jīng)明顯不能滿足現(xiàn)實的要求。面對這些龐大的數(shù)據(jù),海洋生物學家們需要有更強大的分子生物學工具,特別是基因編輯工具的支持,才能更為有效地利用海洋生物基因資源。CRISPR/Cas9技術是近三年來高速發(fā)展的一種基因編輯技術,2013年、2015年先后兩次被Science雜志評為當年的十大科學突破,2015年更是位居榜首。CRISPR技術自2013年首次應用于人類細胞后[13—15],已在多個物種中取得成功,成為眾多研究者操作基因組的不二選擇。本文將從CRISPR/Cas9技術入手,介紹其發(fā)展過程及其在海洋生物中的應用現(xiàn)狀和前景展望,以期推動這一技術在海洋生物研究中得到廣泛應用。

1 基因編輯技術的發(fā)展歷史與現(xiàn)狀

基因編輯技術是反向遺傳學的重要研究手段。在反向遺傳學的發(fā)展過程中,曾經(jīng)出現(xiàn)了大量的實用技術。早在1979年,Scherer和Davis就利用同源重組的方法編輯了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因,成功構建了刪除his3基因的菌株和在染色體XV中插入半乳糖誘導區(qū)的菌株[16]。1985年,Smithies等[17]又利用同源重組的方法編輯了人類細胞的基因。20世紀90年代中后期至21世紀初,又相繼誕生了RNA干擾[18]、基因敲降技術[19,20],大大加速了分子生物學的研究進程。人工核酸酶技術是最近幾年出現(xiàn)的一種全新的基因編輯技術。人工核酸酶是一類人工構建的能識別特定DNA序列并能在DNA分子上形成雙鏈切割(Double strandbreaks,DSB)的核酸酶。受損的DNA通過兩種修復機制,既非同源末端連接(Non-homologous endjointing,NHEJ)和同源重組(Homologousrecombination,HR)[21—23]進行修復。在哺乳動物細胞中非同源末端連接是一種重要的易錯修復機制,在修復過程中,DNA雙鏈受損部位會插入或缺失部分堿基,當這種插入或缺失處于基因開放閱讀框內,并且插入或缺失堿基數(shù)不為3或3的倍數(shù)時,就會造成開放閱讀框的移碼突變,使這個開放閱讀框的信息不能正確翻譯,從而起到基因敲除的作用[24]。而在釀酒酵母細胞中,同源重組則是一種占統(tǒng)治地位的修復機制,二倍體釀酒酵母通過另一條染色體作為提供正確片段的供體來修復受損的DNA,當人工核酸酶的切割發(fā)生在單倍體釀酒酵母中時,通過提供人工設計的供體,可實現(xiàn)對單倍體釀酒酵母的定點基因編輯[25]。人工核酸酶技術經(jīng)過近幾年的發(fā)展,形成了3種代表性的技術,即鋅指核酸酶技術(Zincfingernucleases,ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和CRISPR/Cas9技術。

鋅指核酸酶,是第一代人工核酸酶技術。鋅指蛋白,最早于1985年在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的轉錄因子TFIIIA中發(fā)現(xiàn)[26]。1988年Frankel和Pabo將鋅指蛋白定義為調節(jié)蛋白中的一些依賴鋅離子的DNA結合域,這些氨基酸序列富含Cys殘基,并通過與鋅離子的結合而形成穩(wěn)定的手指狀結構,故名鋅指蛋白[27]。通常,每個鋅指蛋白結構域可以識別3個堿基,將3—6個鋅指蛋白結構域相連即可識別連續(xù)的9—18個堿基[28]。約翰霍普金斯大學的Kim等[29]最先將鋅指蛋白結構域與限制性核酸內切酶FokⅠ的催化結構域融合,獲得了具有新識別特性的核酸內切酶。當2個FokⅠ結構域形成二聚體時,能實現(xiàn)對DNA的雙鏈切割,因此必須在靶點兩側設計2個串聯(lián)鋅指蛋白結構域才能實現(xiàn)對靶點的精確切割。構建鋅指核酸酶的主要方法有:Wright等[30]最早使用的模塊組裝法(Modularassembly, MA)、Sangamo公司的專利技術CompoZr方法以及“鋅指聯(lián)合會”提出的開源在線設計軟件ZiFiTTargete(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)等[31]。

類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN),屬于第二代人工核酸酶系統(tǒng),被Science評為2012年的十大科學突破。TALEN技術基于一類來自于植物病原黃單胞桿菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)的蛋白TALE蛋白家族,AvrBs3是該家族第一個被發(fā)現(xiàn)的成員[32]。TALE蛋白類似于真核生物的轉錄因子,可以識別特異的DNA序列進而調控宿主植物內源基因的表達[33]。TALE蛋白肽鏈中部是由1—33個長度約33—35個氨基酸殘基的重復單元和C端的長度為20個氨基酸殘基的半重復單元構成的DNA識別和結合結構域。重復單元中的+12和+13位置的氨基酸殘基是特異識別DNA堿基的關鍵位點,稱為重復可變雙殘基(Repeatvariablediresidue,RVD)。對應A、T、C、G四種堿基,最常見的RVD序列分別是NI(AsnIle)、NG(AsnGly)、HD(HisAsp)和NN(AsnAsn)。TALE相比鋅指蛋白最大的優(yōu)勢是DNA的堿基排列與重復單元有很好的一一對應關系,而不存在鋅指蛋白的上下文效應。TALEN技術的DNA切割結構域與ZFN相同,都是FokⅠ,因此TALEN的作用靶點同樣需要成對設計。Bogdanove和Voytas[34]提出了TALEN靶位點選擇的原則并建立了最早的TALEN網(wǎng)站(https:// talent.cac.cornell.edu/)。上文提到的ZiFiT網(wǎng)站也提供TALEN靶點的設計工具。TALEN技術應用的瓶頸在于重復序列的構建,應用中一般會選擇10bp以上的靶點序列,這就至少需要9.5個重復單元,每個重復單元33—35個氨基酸殘基,這個重復結構的對應的DNA序列總長將達到近1kb,利用常規(guī)方法構建這一重復序列是十分困難的。針對這一重復序列,研究者們提出了GoldenGate、連續(xù)克隆組裝、固相合成、長粘末端組裝、單元組裝法等不同的組裝策略[34]。

2013年出現(xiàn)的CRISPR/Cas9技術改造自細菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng),被稱為第三代人工核酸酶。相比ZFN和TALEN技術,CRISPR技術更加簡便,在應用中只用到Cas9蛋白和sgRNA兩個元件,針對不同的靶點序列只需改變sgRNA上約20nt的識別序列即可。同時,該技術低廉的價格和極高的突變效率,使其出現(xiàn)之后迅速在多種生物中得到成功應用,逐步取代了ZFN和TALEN兩種技術。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

CRISPR是Clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepeatsequences的縮寫,稱為成簇規(guī)律間斷短回文重復序列。Cas9則是CRISPRassociatedgene9的縮寫。CRISPR最早發(fā)現(xiàn)于1987年, Ishino等[35]在克隆大腸桿菌K12(Escherichia coli)的iap基因的時候發(fā)現(xiàn),在該基因3′非翻譯區(qū)中存在5個29個堿基對的重復序列,它們中間則是不重復的32個堿基對的間隔序列,但是文章中并沒有描述其具體功能。20世紀90年代,陸續(xù)在許多古生菌和細菌中發(fā)現(xiàn)了類似的間斷重復序列,但是這些序列始終沒有統(tǒng)一的名稱[36—39]。2000年Mojica等[40]依照這些序列的結構特點,將其命名為短規(guī)律間隔重復序列(ShotRegularlySpacedRepeats,SDSRs)。2002年,Jansen等[41]將這種重復序列命名為CRISPR (Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences),指出該基因座由重復的repeat序列和位于其repeat序列中間的spacer序列組成;同時,研究者還在該基因座附近確定了4種Cas基因(CRISPR-associatedgene)的ORF,并將其命名為Cas1-4,其中Cas3預測具有DNA解旋酶的功能,而Cas4預測具有核酸外切酶的功能,但是CRISPR和Cas基因的具體功能當時還未知。同年,Makarova等[42]提出這些ORF和CRISPR基因座可能構成了一種潛在的DNA修復系統(tǒng)。2005年,Haft等[43]通過生物信息學方法確定了45種Cas蛋白家族,其中有1種預測為HNH結構域核酸內切酶的蛋白Csn1即后來被廣泛應用的Cas9。Bolitin等[44]發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR基因座中的spacer區(qū)有很多序列來源于噬菌體,并且細菌抵抗噬菌體侵襲的能力與其spacer序列的數(shù)量相關。Mojica等[45]也發(fā)現(xiàn),在多種細菌中都有一部分spacer序列來源于細菌以外的病毒、質?；蚍侨旧w成分,在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)菌株SF370中,甚至有超過90%的Spacer序列來源于噬菌體,這些spacer序列的存在與細菌對抗噬菌體的能力密切相關。2006年,Makarova等[46]提出Cas蛋白和CRISPR基因介導細菌以類似真核細胞RNA干擾的方式對抗侵入的質粒和噬菌體。2007年,Barrangou等[47]發(fā)現(xiàn),細菌通過整合噬菌體基因組中的序列為自身新的spacer序列來獲得免疫該種噬菌體的能力,增添或刪除spacer序列將改變細菌對某些噬菌體的抗性。2008年,Brouns等[48]發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR基因座編碼的pre-RNA經(jīng)過Cas蛋白的加工后產(chǎn)生的小crRNA可以介導細菌對病毒的免疫反應。Koonin和Makarova[49]在2009年的綜述文章中總結了這一時期的工作,指出CRISPR系統(tǒng)是細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。2009年Hale等[50]研究發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)可以在RNA的指導下切割RNA。2010年,Garneau等[51]發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)通過切割入侵的噬菌體或質粒的DNA來實現(xiàn)對病原的免疫。2011年Deltcheva等[52]發(fā)現(xiàn)crRNA的成熟需要細菌體內一種被稱為tracrRNA的小RNA介導,并且需要Csn1蛋白(Cas9)和RNA酶III的參與。2011年,Sapranauskas等[53]證實Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)僅需要Cas9一種蛋白參與即可完成切割DNA的過程。2012年8月,Jinek等[54]發(fā)現(xiàn)Cas9是一種由tracrRNA和crRNA介導的DNA內切酶并提出了將CRISPR改造為基因編輯系統(tǒng)的設想。2013年1月,Cong等[13]和Mali等[15]在Science上同時發(fā)表各自的研究成果,首次在真核細胞中利用CRISPR技術實現(xiàn)了基因的定點突變。隨后,Jinek等[14]也在eLife上發(fā)表文章,驗證了其2012年的設想,利用CRISPR在人類細胞中實現(xiàn)了基因的定點敲除。一個屬于CRISPR的新時代就此拉開了帷幕(圖1)。

2.2 CRISPR系統(tǒng)的分類和作用機制

CRISPR基因座廣泛存在于古細菌和細菌中,接近90%的古細菌和超過40%的細菌基因組或質粒中含有至少1個CRISPR基因座[55]。根據(jù)構成CRISPR系統(tǒng)的原件不同和crRNA成熟方式的差異,細菌的CRISPR系統(tǒng)可分為三種類型,稱為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系統(tǒng)僅需要Cas9一種蛋白即可完成對外源DNA的雙鏈切割,因此最適合改造成人工核酸酶系統(tǒng)用于基因定點編輯[56,57]。典型的II型CRISPR基因座(CRISPRloucs)結構如下, 5′端是可轉錄為tracrRNA的區(qū)域,中間是包括Cas9在內的多種Cas蛋白的ORF區(qū)域,靠近3′端則是CRISPR重復間隔區(qū)域(CRISPRrepeat-spacer array)。整個CRISPR重復間隔區(qū)域由一段引導序列(Leadersequence)引導,其下游是間隔分布的重復序列(Repeat),以及位于重復序列之間的間隔序列(Spacer),間隔序列起源于曾經(jīng)侵入的噬菌體或質粒[56—59]。

圖1CRISPR技術的發(fā)現(xiàn)簡史(參考Hsu,et al.,2014)Fig.1MilestonestudiesinthediscoveryofCRISPR/Cas9techniqueforgenomeeditingandengineering

Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在細菌體內作用過程可以分為三個階段(圖2)。第一階段是間隔序列的攝取。當噬菌體首次入侵時,Cas蛋白識別噬菌體中的原型間隔序列臨近基序(ProtospacerAdjacentMotif Sequence,PAMSequence),并將噬菌體DNA裂解后的片段整合到宿主細菌的基因組的CRISPR基因座的間隔序列(Spacer)區(qū)域中。第二階段是crRNA和tracrRNA共同成熟及Cas9切割復合體的形成。在這一階段轉錄形成的前crRNA(Pre-crRNA)和未成熟的tracrRNA有部分片段以堿基互補的方式結合形成雙鏈RNA區(qū)域,同時Cas9蛋白會識別tracrRNA的莖環(huán)結構并與之結合,隨后RNA酶Ⅲ對雙鏈RNA區(qū)域進行切割,完成Pre-crRNA和tracrRNA的共同成熟,成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9形成穩(wěn)定的Cas9切割復合體。第三階段是Cas9切割復合體對外源DNA的切割。在這一階段,crRNA會識別外源DNA中的一條鏈,以堿基互補的方式與之結合,位于Cas9蛋白N端的RuvC核酸酶結構域和位于蛋白肽鏈中部的HNH核酸酶結構域分別結合DNA的雙鏈并完成對DNA的雙鏈切割(Doublestrand breaks,DSBs)形成平末端。被切割的DNA在細菌體內降解,完成細菌對噬菌體的免疫過程[52,54,58]。

2.3 CRISPR技術的應用

CRISPR在基因敲除中的應用通過將細菌CRISPR系統(tǒng)的元件導入真核細胞,可以在真核細胞的基因的特定位置上形成雙鏈切割,進而激活修復機制,實現(xiàn)基因的定點敲除。在細菌中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的必備元件包括crRNA、Cas9蛋白、tracrRNA三種成分,同時在crRNA的加工過程中還需要RNaseⅢ的參與[52]。而在真核細胞中,并不存在天然的pre-crRNA,只需導入成熟的crRNA即可,因此不需要RNA酶Ⅲ的參與。2013年,Cong等[13]的研究也證實了這一點,同時該研究還發(fā)現(xiàn)人工設計的crRNA的靶點在位于其PAM序列上游至少13個堿基以內的范圍內不能存在任何點突變,否則將造成crRNA無法識別靶點而使基因敲除失敗,該研究首次成功利用CRISPR技術敲除了人類細胞的基因。Jinek等[54]在研究細菌CRISPR系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)人工合成的引導RNA(guideRNA,gRNA某些研究中也稱為singleguideRNA,sgRNA)代替tracrRNA和crRNA可以取得類似的結果。Jinek等[14]隨后在其利用CRISPR敲除人類細胞基因的研究中,也采取了合成gRNA的策略。2013年,Mali等[15]在其研究中,利用人工設計的gRNA,取得了與Cong等相似的實驗結果。這些研究,為CRISPR系統(tǒng)在真核細胞中廣泛應用奠定了基礎?，F(xiàn)在對于真核生物,只需利用CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)等軟件(該軟件提供了超過200種生物的基因組信息,用于排除gRNA設計過程中潛在的脫靶位點)針對靶基因設計的特異性的gRNA,選擇合適的轉基因方法將gRNA(或表達gRNA的質粒)和表達重組Cas9蛋白的質粒(或mRNA)導入到細胞內即可實現(xiàn)對靶基因的定點敲除(圖3)。

斑馬魚(Danio rerio)是第一種成功利用CRISPR技術進行基因敲除的脊椎動物,2013年Hwang等[60]利用CRISPR技術嘗試敲除斑馬魚胚胎中的10個基因,其中8個獲得了較高的突變效率。目前利用CRISPR技術已經(jīng)在人類體外培養(yǎng)細胞[13—15]、小鼠細胞[13]、斑馬魚[60]、小鼠(Mus musculus)[61]、大鼠(Rattus norvegicus)[62]、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)[63]、果蠅(Drosophila melanogaster)[64]、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)[65]、水稻(Oryza sativa)[66]、小麥(Triticum aestivum)[66]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[67]、煙草(Nicotiana benthamiana)[67]、家蠶(Bombyx mori)[68]、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)[69]等多種物種中實現(xiàn)了基因定點敲除。

圖2細菌CRISPR基因座的作用機制Fig.2ThemechanismsofCRISPRlociinBacteria第1階段.噬菌體DNA序列插入CRISPR基因座(CRISPRlocus)的間隔序列(Spacer)中。第2階段.pre-crRNA和tracrRNA的共同成熟與Cas9復合體的形成。第3階段.Cas9切割復合體對侵入的噬菌體DNA進行切割。藍色虛框僅標明不同階段,不表示任何細胞結構(參考DoudnaandCharpentier,2014;Hsu,et al.,2014;Wiedenheft,et al.,2012;李君等,2013)Stage1.GenomeDNAofbacteriophageisinsertedintothespacersequenceoftheCRISPRloci.Stage2.pre-crRNAandtracrRNAcomaturationandCas9cleavagecomplexformation.Stage3.BacteriophageDNAiscutbyCas9cleavagecomplex.Bluedashgridlinesmark thedifferentworkingstages.Theydonotindicateanycellstructure

圖3CRISPR用于基因敲除的原理Fig.3TheproceduresandprincipleofCRISPRforgeneknockoutA.經(jīng)過共同成熟過程后形成的的crRNA:tracrRNA復合體示意圖。B.通過在crRNA和tracrRNA之間添加連接序列(圖中紫色部分)形成的引導RNA(guideRNA,gRNA)示意圖。C.利用CRISPR系統(tǒng)在真核細胞中進行基因敲除的一般方法示意圖。表達gRNA的質粒和表達Cas9的質粒通過轉染、電穿孔、顯微注射等轉基因方法進入細胞后,在細胞內經(jīng)過轉錄、翻譯等過程后形成gRNA和Cas9蛋白的復合體,識別特異的DNA序列并完成切割,隨后激活DNA修復機制,修復過程產(chǎn)生移碼突變,造成基因敲除的效果(參考Jinek,et al., 2013;Stolfi,et al.,2014)A.SchematicofcrRNA:tracrRNAcomplexafterco-maturation.B.SchematicofgRNAthatformedbyaddingalinker-sequence(thepurple part)betweencrRNAandtracrRNA.C.ProceduresofgeneknockoutviaCRISPRsystem.PlasmidsthatexpressgRNAandCas9 respectivelyenterthecellbytransfection,electroporationandmicroinjection.Cas9andgRNAformacomplexthatrecognizesandcutsthe specificDNAsequenceincell.DNAbreakswillinduceitsrepairmechanismatthesiteofdamage.Thus,DNAwillbeeditedthrough codingframeshiftinthisprocess

CRISPR在基因編輯中的應用Cas9在目標DNA上產(chǎn)生雙鏈切割(DSB)后,會激活機體的修復機制。針對不同的修復機制,有不同的方法實現(xiàn)基因編輯。如果DNA以非同源末端連接的方式進行修復,可以添加兩端為平末端的DNA供體,在修復過程中有一定幾率形成供體與破損末端的連接,從而實現(xiàn)基因編輯[70]。但是這種情況效率很低,不能保證插入的方向,而且非同源末端連接是一種易錯修復機制,修復過程中可能會產(chǎn)生堿基的插入或缺失。如果細胞以同源重組的方式修復,需要添加兩端含有與破損末端的同源序列的DNA供體,通過同源重組將供體與破損基因組整合,以實現(xiàn)定點編輯[70]。這種方式更為精確,但是某些物種因為同源重組不是主要的修復方式而造成無法使用這種方法(圖4)。在釀酒酵母中同源重組是最主要的修復方式,適合以這種方式進行基因編輯。Jakounas等[25]在釀酒酵母中的研究證明,通過一次轉入可以表達多個gRNA的質粒,可以在釀酒酵母中利用CRISPR系統(tǒng)一次編輯同一代謝通路中的多個基因。Chang等[71]在斑馬魚中借助mloxP重組系統(tǒng),成功在CRISPR系統(tǒng)產(chǎn)生的切口處插入了目的DNA片段。Li等[72]利用CRISPR技術建立了斑馬魚的基因敲入模型,成功標記了斑馬魚神經(jīng)元。Wagner等[73]利用CRISPR技術和同源重組的原理成功編輯了惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的基因組,使其破壞紅細胞的能力下降。

利用Cas9失活突變體dCas9的應用對Cas9蛋白結構的研究表明,Cas9有兩個重要的DNA切割結構域——RuvC核酸酶結構域和HNH結構域。位于N端的RuvC核酸酶結構域切割與gRNA序列相同的DNA鏈,而位于肽鏈中部的HNH結構域則切割與gRNA互補結合的DNA鏈的。如果將位于肽鏈第10位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?突變體D10A)將造成RuvC結構域失活,如果840位的組氨酸突變?yōu)楸彼?突變體H840A)將造成HNH結構域失活,這2種突變體將都只能進行單鏈切割。如果突變體同時具有上述2種突變D10A和H840A,則該突變體將喪失切割雙鏈的能力,而只保留結合gRNA并識別靶基因的能力,這種突變體被稱為dCas9[74,75]。

dCas9可用于調控基因的表達。Qi等[75]在基因編碼區(qū)的上游區(qū)域設計一系列sgRNA識別位點,利用dCas9蛋白與之結合,利用空間位阻阻斷目標基因的轉錄,實現(xiàn)基因敲降,這種技術被稱為CRISPRi。Perez-Pinera等[76]的研究發(fā)現(xiàn),將可以激活轉錄的VP64結構域與dCas9蛋白構建為融合蛋白, dCas9-VP64融合蛋白可在sgRNA的介導下結合在目標基因編碼區(qū)上游的調控區(qū)域,進而激活目標基因的轉錄,激活的強度與上游結合的sgRNA數(shù)量存在一定的相關性。Zalatan等[77]在利用dCas9調控基因表達方面則另辟蹊徑,在其研究中,dCas9本身并不偶聯(lián)任何激活或抑制基因轉錄的結構域,而是在sgRNA3′末端偶聯(lián)上重新設計的2種不同的RNA折疊區(qū)域,利用這段新的RNA折疊區(qū)域分別識別并結合轉錄激活結構域VP64和轉錄抑制結構域KRAB,從而激活或抑制釀酒酵母內相應基因的表達。

通過在dCas9蛋白上偶聯(lián)不同的接頭,還可以利用CRISPR系統(tǒng)對基因組進行一些特殊操作。如將熒光蛋白偶聯(lián)到dCas9上,可利用其來構建探針以識別特定的核酸序列。Ma等[78]在研究中成功使用了3種來自不同細菌的識別不同PAMsequence的dCas9蛋白來標記同一染色體的不同區(qū)域。又如,將乙酰轉移酶偶聯(lián)到dCas9上,可利用其進行表觀基因組編輯。Hilton等[79]將人類的乙酰轉移酶p300偶聯(lián)到dCas9上,通過加強靶基因組蛋白的乙?；瘉碓鰪娀虻谋磉_水平。

圖4不同DNA修復機制下的基因編輯方法(參考GillesandAverof,2014)Fig.4MethodsofgeneeditingunderthedifferentmechanismsofDNArepair

CRISPR在醫(yī)藥方面的應用CRISPR技術可用于快速的構建疾病的動物模型。利用傳統(tǒng)的方式構建疾病動物模型耗時較長,而利用CRISPR系統(tǒng),僅需一代時間,就能獲得轉基因小鼠[61]。麻省理工學院的Xue等[80]利用尾靜脈注射的方式,將CRISPR系統(tǒng)導入成年小鼠肝臟內,成功敲除了其P53和Pten這兩個重要的抑癌基因,使得成年小鼠肝臟發(fā)生了腫瘤。Platt等[81]則利用慢病毒載體將Cas9整合到小鼠的基因組上,再利用慢病毒將包含有P53、Lkb1、Kras基因靶點的sgRNA送入小鼠體內,成功誘發(fā)了小鼠的肺癌,建立了小鼠的肺癌模型。

CRISPR技術在醫(yī)藥方面的另一個重要應用是用于基因治療。許多人類遺傳病是單一基因的缺陷造成的,如在我國南方地區(qū)發(fā)病率較高的地中海貧血癥,是由于珠蛋白缺失或點突變造成的。2014年,Xie等[82]為利用CRISPR基因治療地中海貧血邁出了重要一步,在該項研究中,研究者們利用地中海貧血患者的皮膚細胞誘導產(chǎn)生iPSC,并利用CRISPR技術結合piggyBac轉座子修復了有缺陷的珠蛋白基因,隨后誘導iPSC分化形成可以穩(wěn)定表達正常珠蛋白的紅細胞。2015年4月,中山大學的黃軍就[83]課題組首次嘗試利用CRISPR技術修復了人類三核胚胎中的地中海貧血相關基因,獲得了一定的成功。運用CRISPR技術進行基因治療的另一個熱點是艾滋病。治療的思路源于世界上第一例被治愈的艾滋病患者“柏林病人”,該患者同時患有艾滋病和白血病,在其接受白血病治療過程中接受了骨髓移植,骨髓供體的造血干細胞恰好帶有一種罕見的被稱為delta32的突變,該突變可以使CCR5受體發(fā)生改變而使HIV不能進入T細胞中,患者因骨髓移植同時治愈了白血病和艾滋病。根據(jù)這一思路,可以提取患者自身的造血干細胞,使用CRISPR技術改變其CCR5受體,在重新移植進患者體內,使HIV不能侵襲改造過的T細胞,但是目前該方法還停留在基礎研究階段,未進行任何臨床試驗[84—86]。Hua等[87]選擇了一種直接利用CRISPR技術清除病毒的策略,他們針對HIV-1的LTRU3區(qū)域設計sgRNA,直接切除那些已經(jīng)整合到感染者基因組上的病毒DNA,從而抑制病毒復制,但該方法能否徹底清除數(shù)量眾多的被感染細胞中的病毒DNA還有待驗證。

3 CRISPR技術在海洋生物中應用的現(xiàn)狀

目前,CRISPR系統(tǒng)在海洋生物中應用的報道還比較少,最早公開的報道見于2014年,Sasaki等[88]首先在玻璃海鞘中利用CRISPR技術實現(xiàn)了基因定點敲除。在該研究中,作者針對玻璃海鞘的Hox3、Hox5、Hox12共選擇了8個長度為20個堿基的靶點,并構建了相應的sgRNA表達框架;隨后利用電穿孔方式將這些表達框架分別導入玻璃海鞘的受精卵中,一同導入的還有表達Cas9蛋白的mRNA;結果顯示,有6個sgRNA框架未能發(fā)揮作用,針對Hox3的1個sgRNA框架和Hox5的1個sgRNA框架使目標基因產(chǎn)生了突變。該研究還確定,導入的sgRNA表達框架質量必須大于1.5pg,表達Cas9蛋白mRNA的質量必須大于15pg,系統(tǒng)才能在玻璃海鞘受精卵中產(chǎn)生相應突變,突變率隨著注射量的增加而增加。同年Stolfi等[89]也成功的利用CRISPR系統(tǒng)在玻璃海鞘中實現(xiàn)了基因定點突變。Stolfi等[89]等選擇的靶基因是在發(fā)育過程中決定細胞命運的ebf基因,共構建了2個gRNA表達載體,利用電穿孔技術分別將這2個載體同Cas9蛋白表達質粒導入玻璃海鞘受精卵中,取得了較高的突變效率。同時針對gRNA表達載體在玻璃海鞘體內轉錄提前終止的問題,事先對載體上的部分序列進行了改造,以幫助這些質粒在細胞中順利轉錄。最近,該研究組發(fā)展了新簡化的Cas9構建方法,并構建了玻璃海鞘引導RNA數(shù)據(jù)庫,用于系統(tǒng)的玻璃海鞘功能基因的敲除[90]。Ikmi等[91]利用分別用CRISPR技術和TALEN技術對?？?Nematostella vectensis)的NvFP-7R進行了敲除, NvFP-7R是一種內源的紅色熒光蛋白,經(jīng)過基因敲除的?？荒馨l(fā)出紅色熒光,該研究還證明了NvFP-7R并不是?？l(fā)育所必須的。Perry和Henry[92]則嘗試利用CRISPR技術對大西洋角螺(Crepidula fornicata)的β-catenin基因進行編輯,成功在其CDS的3′端添加了一段編碼熒光蛋白mCherry的序列,在大西洋角螺幼蟲中可以檢測到具有紅色熒光信號的β-catenin蛋白。Square等[93]利用CRISPR技術對海七鰓鰻(Petromyzon marinus)進行研究,研究者將Cas9的mRNA和針對TYR基因設計的gRNA注射進受精卵中,成功對TYR基因進行了敲除。Lin和Su[94]利用顯微注射技術將表達Cas9蛋白的mRNA和針對spNodal基因設計的sgRNA注入到海膽的受精卵中,成功敲除了海膽的spNodal基因,在該研究中作者針對spNodal基因的2個外顯子分別設計了3種gRNA,在全部6種gRNA中有5種獲得了較好的敲除效果,產(chǎn)生了預期的放射狀表型。Martin等[95]用CRISPR技術在海洋甲殼端足類動物中成功實現(xiàn)了對HOX基因的定點敲除。Nymark等[96]將CRISPR技術的應用領域拓展到了海洋藻類中,他們利用CRISPR技術成功敲除了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的CpSRP54基因。

在海洋經(jīng)濟生物有關的研究中,目前僅見2篇相關報道。Edvardsen等[97]在研究大西洋鮭(Salmo salar)身體著色過程中的關鍵基因slc45a2和tyr過程中,利用CRISPR技術對其進行了敲除,針對每個基因分別設計的3種sgRNA均不同程度的導致了大西洋鮭的幼體體色變淺,證明了CRISPR系統(tǒng)確實可以在大西洋鮭體內發(fā)揮作用。最近,研究人員利用CRISPR/Cas9技術在脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)中成功實現(xiàn)了幾丁質酶基因EcChi4的敲除,并觀察了EcChi4敲除對脊尾白蝦生長發(fā)育的影響[98]。

4 CRISPR技術在海洋生物中的應用前景展望

現(xiàn)今制約CRISPR技術在海洋生物中開展的主要因素是多數(shù)海洋生物缺少成熟穩(wěn)定的轉基因技術。因此建立成熟的轉基因方法是實現(xiàn)CRISPR技術在海洋生物中大規(guī)模應用的先決條件。一旦解決轉基因方法的問題,可以嘗試進行Cas9蛋白穩(wěn)定表達轉基因海洋生物品系的構建,這將大大推動CRISPR技術在海洋生物中的應用。目前在果蠅研究中,有研究者[24]通過轉基因手段將表達Cas9蛋白的基因片段整合到果蠅基因組中,當需要利用CRISPR進行基因敲除時,只需將gRNA的表達載體導入轉基因果蠅卵中,即可完成定點突變,該方法可以大大提高了基因敲除的效率。Platt等[81]也成功構建了穩(wěn)定表達Cas9的轉基因小鼠,用于快速構建癌癥小鼠模型。

在海洋動物的CRISPR技術應用中,還有一個值得探索的方向是光遺傳學與CRISPR技術的結合。光遺傳學,就是結合生物工程方法,利用光對某些生物活動進行控制。在CRISPR的研究中,可以利用光控元件與Cas9蛋白的偶聯(lián),在時間和空間上實現(xiàn)對CRISPR系統(tǒng)的進行控制。Nihongaki等[99]將正常的Cas9蛋白分成2部分,分別偶聯(lián)上不同的光控元件,該光控元件源自粗糙脈胞菌(Neurospora crassa),存在帶正電與帶負電的兩種形式,黑暗狀態(tài)下以單體形式存在,在藍光作用下能形成異源二聚體從而使與之偶聯(lián)的被分割為2部分的Cas9蛋白重新聚合成一個完整蛋白。在Nihongaki等[100]的另一項研究中,則利用失去雙鏈切割能力的Cas9突變體dCas9偶聯(lián)光控元件CIB1,該融合蛋白與gRNA形成復合體識別并結合靶DNA,在藍光作用下,偶聯(lián)了光控元件CYB2的激活因子可以與上述復合體結合,從而激活靶基因的表達。Polsein和Gersbach[101]在研究中也使用了類似的方法,所不同的是,他們所使用的Cas9偶聯(lián)了2個CIBN結構域,效率較只偶聯(lián)1個結構域更高。上述光遺傳學技術如果用于海洋動物中,就能方便的利用光控制基因的時空表達模式,將有助于發(fā)育生物學研究。

CRISPR另一個極具潛力的應用方向是海洋動物遺傳育種。2015年美國FDA批準了轉基因三文魚上市銷售,成為首例獲準上市的轉基因動物[102]?；蚬こ淌侄斡糜谶z傳育種正逐漸被消費者認可。Qian等[103]在2015年的一項研究中利用鋅指核酸酶技術敲除了家豬(Susscrofa domestica)體內抑制肌肉生長的mstn基因,獲得了肌肉含量更加豐富的家豬品種。CRISPR技術比鋅指核酸酶技術更加簡便、快捷、廉價。目前CRISPR技術在海洋經(jīng)濟魚類大西洋鮭[97]和淡水魚類斑馬魚[60,71,72]和青鳉(Oryzias latipes)[104]中均取得了成功。如果在水產(chǎn)領域應用推廣此項技術,敲除魚、蝦、貝類的肌肉抑制基因,獲取更高肌肉含量的水產(chǎn)品種將具有十分廣闊的市場前景。

目前,利用CRISPR技術在幾乎所有的模式生物中實現(xiàn)基因的定點敲除和編輯,在海洋生物中也已有9種生物,即玻璃海鞘[88—90]、海膽[94]、?？鸞91]、大西洋角螺[92]、海七鰓鰻[93]、大西洋鮭[97]、端足類動物[95]、脊尾白蝦[98]、三角褐指藻[96]中獲得了成功,涵蓋了尾索動物、棘皮動物、刺胞動物、貝類、圓口綱、魚類、甲殼動物和藻類等8個生物類群。相信不遠的將來,隨著人們認識的進一步的深入,CRISPR技術一定可以在更多的海洋生物體內實現(xiàn)基因編輯,幫助研究者們獲得更多、更有價值的研究成果。

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CRISPR/CAS9 AND ITS APPLICATIONS IN MARINE ORGANISMS

LIXiang1andDONGBo1,2,3
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao266003,China;2.Institute of Evolution & Marine Biodiversity,Ocean University of China,Qingdao266003,China;3.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao266100,China)

CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)isanadaptiveimmunesystem thatconfersresistancetobacteriophageorexogenousplasmidinbacteria.CRISPR/Cas9technologydevelopedfrom bacterialtypeIICRISPRsystemhasbecomeapowerfulgenomiceditingtoolsuccessfullyusedinmostofexisting creatures.ComparedwithZinc-fingernucleases(ZFN)andTranscriptionactivatorlikeeffectornucleases(TALEN) techniques,theadvantagesofCRISPR/Cas9technicalsystemaremoresimple,highlyefficient,andcheaper.Butfor marineorganisms,itisnotwidelyusedbecauseofthedifficultyoftransferringexogenousDNAintomostofmarine animals.Inthisreview,weintroducedthedevelopmentalcourse,workingmechanisms,prospectsofCRISPR/Cas9 technologyandthecurrentstatusofitsapplicationinmarineorganisms.Moreover,weanalyzedthepotentialapplicationofdCas9andthecombinationofCas9andoptogeneticcontrolmethodonstudyinggeneregulatorymechanismsin marineanimals,whichmightpromotefurtherapplicationofCRISPR/Cas9technologyinmoremarineorganismsinthe nearfuture.

CRISPR/Cas9;Geneediting;Marineorganisms;Functionidentification;Generesources



10.7541/2017.31

Q789

A

1000-3207(2017)01-0244-13

2016-03-23;

2016-06-17

國家自然科學基金(31572352);山東省自然科學基金(ZR2015DM003);山東省泰山學者建設工程專項經(jīng)費資助[Supportedby theNationalNaturalScienceFoundationofChina(31572352);theNaturalScienceFoundationofShandongProvince (ZR2015DM003);TaishanScholarProgramofShandongProvince]

李響(1986—),男,天津市人;博士研究生;主要從事動物基因組編輯技術的研究。E-mail:lx861024@126.com

董波,男,遼寧丹東人;博士,教授;主要從事動物胚胎發(fā)育與器官形態(tài)發(fā)生方面的研究。E-mail:bodong@ouc.edu.cn