余 毅 李增棋 廖 劍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟外科,福州350004)

Irbesartan對冠狀動脈粥樣硬化小鼠的治療作用及可能機制

余 毅 李增棋 廖 劍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟外科,福州350004)

目的：明確Irbesartan對冠狀動脈粥樣硬化小鼠的治療作用，并進一步分析可能的機制。方法：將16只雄性ApoE-/-小鼠給予高脂飲食(1.25%膽固醇，10%脂肪)構(gòu)建冠心病模型。模型建立后將小鼠隨機分為治療組[Irbesartan,50 mg/(kg·d),4周]及對照組(等量生理鹽水灌胃對照)。采用HE、ELISA、Western blot及免疫熒光技術(shù)分析療效及機制。結(jié)果：治療組小鼠動脈粥樣斑塊面積顯著低于對照組(P<0.05)。治療組血管內(nèi)IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著低于對照組(P<0.05)。治療組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)PPAR-γ及Adiponectin水平顯著升高，而Leptin水平顯著降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot及免疫熒光證實，Irbesartan顯著抑制了治療組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)的NF-κB信號通路。結(jié)論：Irbesartan通過調(diào)節(jié)血管周圍脂肪組織內(nèi)PPAR-γ-NF-κb(p65)信號通路，調(diào)節(jié)血管周圍脂肪組織功能及炎癥，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化療效。

厄貝沙坦；動物模型；動脈粥樣硬化；脂肪組織；炎癥

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(Coronary atherosc-lerotic heart disease，CAD)是一種以冠狀動脈粥樣硬化性狹窄所示冠脈血流不足而引發(fā)的一系列心臟缺血、缺氧的慢性疾病[1]。CAD目前無法治愈，部分患者會在CAD的基礎(chǔ)之上并發(fā)心肌梗死，嚴重者會導(dǎo)致患者死亡[2]。CAD的發(fā)病機制雖然并不清楚，但目前認為與西方化的生活飲食方式等相關(guān)，其中脂質(zhì)代謝紊亂可能是導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊形成的主要因素之一[3]。因而調(diào)節(jié)患者脂質(zhì)代謝紊亂有望改善該病。厄貝沙坦(Irbesartan)是一種新型血管緊張素Ⅱ-1型(AⅡ1)-受體拮抗劑，除降壓外，新近的研究表明其具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能[4]。ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)是一種被國際學(xué)術(shù)界廣泛認可的CAD動物模型。本研究嘗試應(yīng)用Irbesartan治療ApoE-/-小鼠，觀察其抗動脈粥樣硬化療效，并分析可能機制，以期為該病的診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分組及干預(yù) 選取16只雄性ApoE-/-小鼠(ApoEKO;B6.129P2-Apoetm1Unc,Jackson Laboratory,Bar Harbor,USA)給予高脂飲食(1.25%膽固醇，10%脂肪)構(gòu)建冠心病模型[5]。模型建立后將小鼠隨機分為治療組(Treatment group)及對照組(Control group)。治療組采用灌胃方式給予Irbesartan[50 mg/(kg·d),Shionogi & Co.Ltd.,Osaka,Japan]治療4周；對照組給予等量生理鹽水灌胃對照。兩組均共同飼養(yǎng)于SPF環(huán)境下；防止噪聲及強光燈干擾；控制室內(nèi)溫度在25～27℃；小鼠自由飲水和進食。實驗結(jié)束后脫頸處死小鼠，取主動脈弓及血管周圍脂肪，分別固定于10%中性甲醛及-80℃凍存；采集靜脈血離心后取血清-80℃凍存。

1.2 檢測及評估指標 兩位研究員獨立依據(jù)血管組織學(xué)檢查，采用Image-Pro Plus軟件測試并比較兩組小鼠相對動脈粥樣斑塊面積[6]；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠主動脈弓內(nèi)白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-10及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)；采用組織病理學(xué)分析血供周圍脂肪組織改變，并采用Western blot分析脂肪組織內(nèi)過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)、瘦素(Leptin)及脂聯(lián)素(Adiponectin)表達；采用Western blot及免疫熒光分析血管周圍脂肪組織NF-κB(p65)信號通路的改變。ELISA試劑盒均購自于R&D公司(USA)，均購置于Abcam公司(England)。

2 結(jié)果

2.1 Irbesartan對ApoE-/-小鼠的治療效果 治療組小鼠動脈粥樣斑塊面積顯著低于對照組，相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

治療組血管內(nèi)IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著低于對照組，而IL-10水平無明顯改變，相比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.2 Irbesartan對血管周圍脂肪組織的影響 如圖3所示，對照組小鼠血管周圍脂肪中有大量炎癥細胞浸潤(箭頭處)，而經(jīng)過Irbesartan治療后，治療組小鼠血管周圍脂肪組織炎癥明顯改善。

圖4所示，治療組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)PPAR-γ及Adiponectin水平顯著升高，而Leptin水平顯著降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Irbesartan對血管周圍脂肪組織內(nèi)NF-κB信號通路的影響 如圖5A、B所示，治療組小鼠血管周圍脂肪組織p-p65及p-IKK水平顯著低于對照組(P<0.05)，圖5C顯示p65分布于細胞核內(nèi)。證實Irbesartan治療顯著抑制了血管周圍脂肪組織內(nèi)NF-κB信號通路。

圖1 兩組小鼠相對動脈粥樣斑塊面積比較Fig.1 Comparison of relative atheroma macular areas between two groupsNote: *.P<0.05.

圖2 兩組小鼠血管內(nèi)炎癥因子水平的比較Fig.2 Comparison of inflammatory cytokine in blood vessel between two groupsNote: *.P<0.05.

圖3 兩組小鼠血管周圍脂肪組織病理學(xué)改變比較Fig.3 Comparison of histopathologic changes of perivascular adipose tissues between two groups

圖4 兩組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)脂肪因子水平的比較Fig.4 Comparison of adipocytokines in perivascular adipose tissues between two groupsNote: *.P<0.05.

圖5 兩組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)NF-κB信號通路的改變Fig.5 Comparison of NF-κB signaling pathway changes in perivascular adipose tissues between two groupsNote: *.P<0.05.

3 討論

冠心病是歐美發(fā)達國家人群的主要死亡原因之一，隨著我國工業(yè)化進程發(fā)展，在西方化的生活飲食方式及人口老齡化等多種因素的影響下，我國冠心病的發(fā)病率在不斷攀升，已經(jīng)開始具有取代惡性腫瘤成為危害人民健康的首要致死性疾病[7-9]。雖然冠心病的發(fā)病機制不清楚，但醫(yī)學(xué)界逐漸認識到這是一種在遺傳易感基礎(chǔ)上，免疫、炎癥、脂質(zhì)代謝等多因素所共同作用下產(chǎn)生的疾病[10,11]。以往對該病的治療主要集中在擴張血管上，而新近的觀點認為改善脂質(zhì)代謝可能具有更為深遠的預(yù)后影響[12-14]。我們嘗試在一個學(xué)術(shù)界公認的冠心病動物模型上采用Irbesartan治療[15-17]，觀察其對血管周圍脂肪的影響，以及是否可以通過調(diào)節(jié)脂肪功能而影響血管內(nèi)病變。

我們的研究顯示，治療組小鼠動脈粥樣斑塊面積顯著縮小，這提示Irbesartan治療是有效的。進一步分析血管內(nèi)炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)，Irbesartan治療后血管內(nèi)IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著低于對照組，而IL-10水平無明顯改變。IL-1β、IL-6及TNF-α均為經(jīng)典的促炎因子，主要有激活的T、B淋巴細胞及單核巨噬細胞所分泌。具有維持炎癥狀態(tài)及炎癥級聯(lián)放大作用[18]。這提示Irbesartan具有降低血管內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用。而IL-10是一種抑炎因子，我們的研究未發(fā)現(xiàn)其水平明顯改變。提示Irbesartan可能并無直接誘導(dǎo)抑炎因子升高而產(chǎn)生抗炎的功能。血管周圍脂肪組織病理學(xué)分析顯示，對照組小鼠脂肪存在明顯炎癥細胞浸潤[19]，而治療組小鼠脂肪炎癥明顯減輕。脂肪因子的分析中發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)PPAR-γ及Adiponectin水平顯著升高，而Leptin水平顯著降低。PPAR-γ是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、維持脂肪細胞生理功能、促進脂肪細胞分化成熟的重要脂肪因子[20,21]。Adiponectin是一種具有抗炎作用的脂肪因子，而Leptin具有促進炎癥反應(yīng)的功能[22]。這一結(jié)果提示，Irbesartan具有明確的調(diào)節(jié)脂肪細胞內(nèi)炎癥穩(wěn)態(tài)，促進脂肪細胞功能的作用。這可能是其療效機制之一。鑒于我們發(fā)現(xiàn)PPAR-γ水平在Irbesartan治療下升高，而PPAR-γ具有調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的作用。我們采用免疫熒光及Western blot法，證實了在Irbesartan的治療下，治療組小鼠血管周圍脂肪組織內(nèi)NF-κB信號通路被顯著抑制，這可能是Irbesartan的療效機制之一。

綜上，我們的研究初步證實Irbesartan通過調(diào)節(jié)血管周圍脂肪組織內(nèi)PPAR-γ-NF-κB(p65)信號通路，調(diào)節(jié)血管周圍脂肪組織功能及炎癥，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化療效。提示調(diào)節(jié)血管周圍脂肪組織功能及炎癥是抗動脈粥樣硬化治療的一個潛在靶點。

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[收稿2016-03-11 修回2016-04-22]

(編輯 張曉舟)

Therapeutical effect of Irbesartan for coronary atherosclerosis mice (ApoE-/-)and its possible mechanisms

YUYi,LIZeng-Qi,LIAOJian.

DepartmentofCardiacSurgery,FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China

Objective:To analyze the therapeutical effect of Irbesartan for coronary atherosclerosis mice (ApoE-/-) and its possible mechanisms.Methods: A total of 16 male ApoE-/-mice were randomly divided into control group and Treatment group [Irbesartan,50 mg/(kg·d),4 weeks].HE,immunofluorescence,Western blot and ELISA were performed to analyze the effect of Irbesartan on ApoE-/-and the changes of related signaling pathways.Results: Compared with control group,the treatment group had lower atheroma macular areas and inflammatory cytokines in blood vessel (P<0.05).Treatment group had lower levels of leptin,but higher levels of PPAR-γ and adiponectin in perivascular adipose tissues (PVAT) than these of control group,the difference were statistically significant (P<0.05).Western blot and immunofluorescence analysis shown that Irbesartan treatment significantly depressed the expression of p-p65 and p-IKK in PVAT when compared with these of control group (P<0.05).Conclusion: Irbesartan has significantly therapeutic effect on ApoE-/-mice,the possible mechanisms including anti-inflammatory effects in PVAT,improved the adipose tissue function and regulated the PPAR-γ-NF-κB signaling pathways.

Irbesartan；Animal model；Coronary atherosclerotic heart disease；Adipose tissue;Inflammation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.026

余 毅(1981年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病方面的研究，E-mail：13957510@qq.com。

及指導(dǎo)教師：李增棋(1964年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事復(fù)雜先天性心臟病糾治術(shù)/心臟瓣膜替換術(shù)方面的研究，E-mail：zqli888@yahoo.com。

R541.7

A

1000-484X(2017)01-0126-04