董紅玲 周 萍 楊文靜

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430015)

噻可拉林協(xié)同順鉑促進(jìn)宮頸癌c4-1及Hela細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

董紅玲 周 萍①楊文靜

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430015)

目的：探討噻可拉林協(xié)同順鉑促進(jìn)宮頸癌c4-1、Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法：用不同濃度噻可拉林和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的c4-1、Hela細(xì)胞，MTT法檢測(cè)c4-1、Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，Hoechst 33342 和AO-EB染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bax、Bcl2、p53、p21蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期。結(jié)果：c4-1及Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度的噻可拉林和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用后，細(xì)胞的體外增殖活力被明顯抑制，呈劑量依賴關(guān)系，且在聯(lián)合使用噻可拉林(10 nmol/L)：順鉑(4 μmol/L)用量時(shí)抑制效果最明顯(P<0.05)；AO-EB染色法顯示，噻可拉林和順鉑聯(lián)合使用，細(xì)胞凋亡更明顯。Western blot則顯示，Bax、p53、p21表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl2的表達(dá)則明顯下調(diào)。結(jié)論：噻可拉林能協(xié)同順鉑上調(diào)Bax、p53、p21的表達(dá)和下調(diào)Bcl2的表達(dá)，抑制宮頸癌c4-1、Hela細(xì)胞增殖同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

噻可拉林；順鉑；宮頸癌；凋亡

子宮頸癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它占所有癌癥發(fā)病率的13%[1]，人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是子宮頸癌發(fā)生的主要因素，該疾病常好發(fā)于育齡婦女，中老年婦女因生殖系統(tǒng)易感HPV，也是發(fā)病人群之一[2]。最近，有兩個(gè)預(yù)防HPV的疫苗(Gardasil和Cervarix)上市，但是對(duì)于已經(jīng)感染HPV或患宮頸癌患者而言，該疫苗無(wú)任何作用[3]。因此，仍然需要尋找新的治療策略。目前宮頸癌的常規(guī)治療方法是放療、化療和手術(shù)治療。順鉑無(wú)論是單獨(dú)使用或與托泊替康組合使用的首選藥物。然而，順鉑治療時(shí)產(chǎn)生的副作用如骨髓抑制癥、粒細(xì)胞減少、血小板減少、腎毒性和神經(jīng)毒性貧血會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生嚴(yán)重危害[4]。鑒于以上血液系統(tǒng)毒性反應(yīng)和后天耐藥，在整個(gè)化療過(guò)程中必須對(duì)使用順鉑使用劑量進(jìn)行嚴(yán)格的限制[5]。因此提高低劑量順鉑的化療效果是目前臨床治療有效的治療手段之一[6,7]。噻可拉林是一種硫代縮酚酸肽雙嵌入劑，研究表明，其對(duì)很多腫瘤細(xì)胞均有一定的細(xì)胞毒性，包括乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞以及黑色素瘤細(xì)胞。它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期在G1期停滯[7-9]。本研究將探討噻可拉林協(xié)同順鉑對(duì)宮頸癌c4-1、Hela細(xì)胞凋亡的影響，并初步研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備 主要試劑包括RPMI1640培養(yǎng)、基胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Bax、Bcl2、p53、p21、β-actin抗體購(gòu)自Santa cruz，ECL試劑購(gòu)自Thermo fisher，細(xì)胞裂解液、PMSF(蛋白酶抑制劑)、BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，SDS-PAGE試劑購(gòu)自Bio-Rad，噻可拉林購(gòu)自馬爾藥品公司，AO-EB染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。主要設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)， 熒光顯微鏡，Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。人宮頸癌c4-1、Hela細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌c4-1、Hela細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%FBS、150 U/ml青霉素、150 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白消化傳代后按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中。

1.2.2 MTT比色法分析不同濃度噻可拉林和順鉑單獨(dú)使用或聯(lián)合使用對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的c4-1、Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，接種至96孔板，每孔100 μl，分為對(duì)照組，順鉑單獨(dú)使用(終濃度為0.75、1、2、3、4 μmol/L )組，噻可拉林單獨(dú)使用(終濃度為0、2、4、8、10 nmol/L)組，順鉑和噻可拉林聯(lián)合使用組共4組，每組每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前4 h向每孔中加入40 μl MTT，使MTT的終濃度為1 mg/ml，4 h后結(jié)束培養(yǎng)，棄掉上清，向每孔中加入150 μl DMSO，置低速搖床上10 min，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定每孔吸光度OD值(λ=492 nm)。計(jì)算細(xì)胞增殖活性：增殖活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期 取對(duì)數(shù)期的c4-1、Hela細(xì)胞，收集細(xì)胞后 1 200 r/min離心10 min，PBS洗1次去除FBS，用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，以16%的RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106ml-1，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入最佳濃度的順鉑和噻可拉林(4 μmol/L和10 nmol/L)，對(duì)照組細(xì)胞加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。參照文獻(xiàn)[10]的方法，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，資料經(jīng)Modfit軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 Hoechst 33342和AO-EB染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期的c4-1、Hela細(xì)胞，消化后接種于已經(jīng)放入清洗滅菌蓋玻片的6孔板中，接種量為5×104孔-1，待細(xì)胞貼壁后，向其中加入對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞增殖影響最佳濃度的順鉑和噻可拉林，繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h換液一次，換液時(shí)再次加入順鉑和噻可拉林，48 h以Hoechst 33342和AO-EB染色試劑盒進(jìn)行染色，方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。染色后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl2、p53、p21、β-actin蛋白表達(dá)量 取對(duì)數(shù)期的c4-1、Hela細(xì)胞，經(jīng)順鉑和噻可拉林處理后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液及PMSF，充分裂解后4℃離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，取上清，BCA法蛋白定量后，加入5×loading buffer，沸水煮10 min后置冰上，然后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、洗膜(5 min×3次)、5%BSA封閉，封閉結(jié)束后洗膜(5 min×3次)，孵育一抗，4℃冰箱過(guò)夜，然后再次洗膜(5 min×3次)，孵育二抗，37℃低速搖床1 h，結(jié)束后洗膜(5 min×3次)，ECL法曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析，P<0.05為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度噻可拉林和順鉑單獨(dú)使用或聯(lián)合使用對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞增殖活性的影響 結(jié)果顯示，隨著噻可拉林和順鉑濃度的增加，噻可拉林和順鉑單獨(dú)使用或聯(lián)合使用細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組比明顯下降(P<0.05)，而當(dāng)噻可拉林和順鉑濃度分別小于等于2 nmol/L和1 μmol/L時(shí)，聯(lián)合使用組與單獨(dú)使用組比較，細(xì)胞增殖活性未有明顯變化(P>0.05)；當(dāng)噻可拉林和順鉑濃度分別10 nmol/L和4 μmol/L時(shí)聯(lián)合使用，其較單獨(dú)使用時(shí)細(xì)胞增殖活性下降更明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 噻可拉林協(xié)同順鉑對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞周期的影響 噻可拉林協(xié)同順鉑作用c4-1、Hela細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期停滯(見(jiàn)表1)，結(jié)果顯示，加入8 h后開(kāi)始起作用，48 h最顯著，與單獨(dú)使用組相比，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Group8h24h48h72hControl6003±3416115±3195964±3496631±248Thiocoraline(10nmol/L)5237±2166593±2898702±3597204±262Cisplation(4μmol/L)5021±2036452±2618546±3177019±241Combination(10nmol/L：4μmol/L)6952±2831)7919±3151)9597±4291)7927±3311)

Note：Compared with the control group,thiocoraline and cisplatin group，1)P<0.05.

圖1 不同濃度噻可拉林和順鉑單獨(dú)使用或聯(lián)合使用對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Influence on cell proliferation activity of different concentration of thiocoraline and cisplatin alone or in combination on c4-1 and Hela cellNote:*.P<0.05.

圖2 噻可拉林協(xié)同順鉑對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of thiocoraline combination with cisplatin on apoptosis of c4-1 and Hela cell

圖3 噻可拉林協(xié)同順鉑對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞Bax、p53、p21、Bcl2表達(dá)的影響Fig.3 Effect of thiocoraline combination with cisplatin on the expression of Bax，p53，p21，Bcl2 of c4-1 and Hela cellNote: 1.Control;2.Thiocoraline(100 nmol/L);3.Cisplation(4 μmol/L);4.Combination(10 nmol/L： μmol/L).

2.3 噻可拉林協(xié)同順鉑對(duì)c4-1、Hela細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33342和AO-EB染色顯示，噻可拉林協(xié)同順鉑(終濃度為10 nmol/L和4 μmol/L)能夠明顯的誘導(dǎo)c4-1、Hela細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖2)，AO-EB染色顯示聯(lián)合使用組較單獨(dú)使用組可見(jiàn)更多的細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮狀橘紅色熒光(見(jiàn)圖2)。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果 噻可拉林和順鉑均能夠明顯上調(diào)Bax、p53、p21的表達(dá)，噻可拉林則能下調(diào)Bcl2的表達(dá)，而順鉑單獨(dú)使用則不影響B(tài)cl2的表達(dá)。協(xié)同使用時(shí)(終濃度為10 nmol/L和4 μmol/L) Bax、p53、p21表達(dá)較單獨(dú)使用上調(diào)更明顯，而Bcl2則較噻可拉林單獨(dú)使用無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖3)。

3 討論

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它威脅著全球女性的健康，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[12]。且隨著人們的兩性生活觀念的轉(zhuǎn)變，該疾病發(fā)病呈現(xiàn)逐年上升和年輕化趨勢(shì)。中老年婦女由于其生理機(jī)能的退化和機(jī)體免疫力的下降，對(duì)HPV呈現(xiàn)易感性，因此中老年婦女和育齡婦女仍是高發(fā)人群[13]。我國(guó)每年新發(fā)病例10萬(wàn)以上，是導(dǎo)致女性死亡的第二大惡性腫瘤[14]。目前宮頸癌的主要治療手段是手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療，而化療對(duì)患者機(jī)體正常功能又具有極大的損傷，因此如何降低化療對(duì)患者的副作用成為宮頸癌術(shù)后化療未來(lái)治療方案中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。順鉑是宮頸癌化療中最常用的藥物，特別是轉(zhuǎn)移性的宮頸癌，而順鉑治療的毒性反應(yīng)和獲得性耐藥是臨床宮頸癌化療面臨的重要問(wèn)題[15]。如何在低劑量的順鉑下更有效的殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，成為使用順鉑治療轉(zhuǎn)移性宮頸癌的策略之一，某些天然的有毒或無(wú)毒的具有抗癌特性的化合物將是解決這一問(wèn)題的有效途徑。

研究表明，噻可拉林是一種來(lái)自海洋放線菌Micromonospora marina的具有抗瘤潛能的天然疏水性化合物，它能夠?qū)?xì)胞的周期進(jìn)行干擾，其主要作用方式是抑制DNA合成酶的活性，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，影響細(xì)胞的增殖[9]。最近的研究表明，噻可拉林能夠抑制甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞的增殖。本研究觀察到，噻可拉林單獨(dú)使用能夠明顯抑制宮頸癌c4-1、Hela細(xì)胞的增殖，同時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，當(dāng)其協(xié)同順鉑使用時(shí)，能夠明顯提高順鉑促進(jìn)c4-1、Hela細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種細(xì)胞主動(dòng)參與的“自殺”機(jī)制，化療藥物被認(rèn)為是在這一過(guò)程中對(duì)細(xì)胞內(nèi)的某些靶點(diǎn)進(jìn)行作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)“自殺”現(xiàn)象。本研究觀察到的現(xiàn)象表明，噻可拉林可能是協(xié)同順鉑作用于c4-1、Hela細(xì)胞后，上調(diào)了p53的表達(dá)，而上調(diào)的p53則能夠?qū)е缕湎掠蔚膒21蛋白表達(dá)增加的，同時(shí)上調(diào)的p53還能夠直接對(duì)促凋亡分子Bax的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。這表明，噻可拉林協(xié)同順鉑的這種誘導(dǎo)表達(dá)模式導(dǎo)致細(xì)胞p53功能的恢復(fù)，從而上調(diào)p21和Bax，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。此外，本研究還觀察到，單獨(dú)使用噻可拉林和與順鉑聯(lián)合使用時(shí)Bcl-2表達(dá)下調(diào)效應(yīng)是一樣的，這表明，噻可拉林還能通過(guò)作用于凋亡的線粒體通路Bcl-2家族對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。而噻可拉林是通過(guò)何種途徑調(diào)控Bcl-2表達(dá)、以及協(xié)同順鉑調(diào)控p53及其下游調(diào)控細(xì)胞凋亡基因表達(dá)仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，盡管噻可拉林是一種疏水性化合物，其在體內(nèi)半衰期非常短，同時(shí)體內(nèi)還存在p450及其同工酶對(duì)其進(jìn)行降解，但鑒于其在體外能夠通過(guò)下調(diào)Bcl-2和協(xié)同低濃度順鉑恢復(fù)p53功能促進(jìn)宮頸癌c4-1、Hela的凋亡，這為宮頸癌化療降低順鉑使用濃度提供了聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)。因此，開(kāi)發(fā)能夠轉(zhuǎn)變噻可拉林疏水性和降低其在體內(nèi)降解的途徑，將會(huì)為臨床降低宮頸癌化療時(shí)使用順鉑的毒性反應(yīng)和化療耐藥提供新的策略。

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[收稿2016-03-25 修回2016-05-05]

(編輯 許四平)

Mechanism of thiocoraline combination with cisplatin on promoting apoptosis of cervical cancer cell line c4-1 and Hela

DONGHong-Ling,ZHOUPing,YANGWen-Jing.

ObstetricsandGynecology,AffiliatedHospitalofJianghanUniversity,Wuhan430015,China

Objective:To investigate the apoptosis by thiocoraline in combination with cisplatin on cervical cell line c4-1 and Hela and its mechanism.Methods: Different concentrations of thiocoraline and cisplatin alone or in combination used for cultured c4-1 and Hela cells.The inhibition of cell proliferation was detected by MTT assay,and the apoptosis was detected by Hoechst 33342 and AO-EB staining.The expressions of the protein Bax,Bcl2,p53,p21 were detected by Western blot.The cell cycle of c4-1 and Hela cells were detected by Flow cytometry.Results: The cell proliferation activity of c4-1 and HeLa cells were inhibited obviously by different concentrations of thiocoraline and cisplatin alone or in combination.The inhibition effect was in a dose-dependent manner.Meanwhile,when the concentrations of thiocoraline and cisplatin were 10 nmol/L and 4 μmol/L,respectivity the inhibitory effect was most significant (P<0.05);Hoechst 33342 and AO-EB staining showed that the cell apoptosis effect was more obvious on thiocoraline in combination with cisplatin.The Western blot showed that the expressions of the protein Bax,p53,p21 were significantly up-regulated,and the Bcl2 was significantly down-regulated.Conclusion: Thiocoraline combination with cisplatin could up-regulate the expression of the protein Bax,p53,p21 and down-regulation the expression of Bcl2 to inhibition the proliferation and promotion apoptosis of cervical cell line c4-1 and Hela.

Thiocoraline;Cisplatin;Cervical carcinoma;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.020

董紅玲(1980年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科炎癥、宮頸癌及卵巢腫瘤，妊娠合并內(nèi)科疾病的診斷及治療等方面的研究，E-mail：donghongling2344@163.com。

及指導(dǎo)教師：周 萍(1980年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事子宮內(nèi)膜異位癥、婦科腫瘤等方面的研究。

R711

A

1000-484X(2017)01-0099-04

①武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦產(chǎn)科，武漢430015。