蘭巧芬 廖煥金 陳秋華 蔡 珺 張莉芳 彭艷霞 何一鳴 吳 平 謝 彤 潘慶軍

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湛江524001)

·臨床免疫學(xué)·

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者嗜堿性粒細(xì)胞活化機(jī)制研究①

蘭巧芬 廖煥金②陳秋華③蔡 珺④張莉芳 彭艷霞④何一鳴③吳 平 謝 彤③潘慶軍④

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湛江524001)

目的：探討類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血嗜堿性粒細(xì)胞的活化情況及其機(jī)制。方法：流式檢測(cè)正常人對(duì)照組和RA患者組外周嗜堿性粒細(xì)胞活化標(biāo)記物CD203c的表達(dá)及IL-4陽(yáng)性的比例；用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清IgE水平；負(fù)選正常人嗜堿性粒細(xì)胞，以anti-IgE刺激為陽(yáng)性對(duì)照，置含或不含IgE的微環(huán)境中，流式檢測(cè)CD203c的表達(dá)及IL-4陽(yáng)性的比例。結(jié)果：較正常人對(duì)照組，RA患者嗜堿性粒細(xì)胞高表達(dá)CD203c和IL-4(均P<0.05)；RA患者血清IgE水平顯著高于正常人對(duì)照組(P<0.05)；RA患者血清和其血清中純化的IgE可使負(fù)選的正常人來(lái)源的嗜堿性粒細(xì)胞活化，上調(diào)CD203c表達(dá)及IL-4陽(yáng)性比例。結(jié)論：RA患者嗜堿性?；罨c發(fā)病相關(guān)，且主要由IgE介導(dǎo)，靶向嗜堿性粒細(xì)胞及其活化通路有望為RA的防治提供新的策略。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；嗜堿性粒細(xì)胞；活化；IgE；IL-4

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種典型的自身免疫性疾病，免疫功能紊亂及免疫調(diào)節(jié)失衡是其在發(fā)病過(guò)程中的重要因素，尤其T、B淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡被認(rèn)為是RA發(fā)病的核心所在，其中輔助性T細(xì)胞(Th1/Th2和Th17/Treg)等應(yīng)答失衡在RA疾病進(jìn)展中的重要作用已被廣泛認(rèn)知[1]。

近年，嗜堿性粒細(xì)胞作為一群曾被忽略的小群體重新贏得了尊重，除參與過(guò)敏反應(yīng)外，在免疫調(diào)節(jié)等方面也具有重要作用[2]，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)、RA等。活化是嗜堿性粒細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能的關(guān)鍵步驟，多種途徑可介導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞的活化，進(jìn)而分泌大量介質(zhì)(IL-4/IL-6/組胺等)，同時(shí)，表面上調(diào)一系列免疫分子(CD40/CD40L/CD62L/HLA-DR/BAFF/CCRs/CXCRs等)，參與多種免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[3]，如促進(jìn)Th2型細(xì)胞分化[4,5]，是Th2細(xì)胞分化所必需的IL-4的一個(gè)重要起始來(lái)源[6]，也可抑制Th1分化[7]等。

本課題前期曾提出嗜堿性粒細(xì)胞參與RA發(fā)病的假說(shuō)[8]，基于此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)RA患者臨床標(biāo)本和體外實(shí)驗(yàn)，探討RA患者外周嗜堿性粒細(xì)胞活化機(jī)制，有望為RA的防治提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 2014年7月～2015年12月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科明確診斷RA的患者45例，平均年齡為(49.5±1.6)歲。所有入選的患者診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)及2009年ACR和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)提出新的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分系統(tǒng)。將所有入組RA患者的疾病活動(dòng)度按照DAS28進(jìn)行評(píng)分，其中RA患者5例為低活動(dòng)度，20例為中活動(dòng)度，20例為高活動(dòng)度，另有22例同期健康志愿者(男4例、女18例)作為正常人對(duì)照組，平均年齡(46.7±2.5)歲。

1.1.2 試劑及儀器 流式抗體PE anti-human CD203c、PE Mouse IgG1、κIsotype Control、PE-Cy7 anti-human IL-4、PE-Cy7 Mouse IgG1均購(gòu)自Biolegend公司；Goat anti-Human IgE抗體購(gòu)自Sigma公司；Anti-Human IgE antibody購(gòu)自Abcam公司；BFA/Monensin mixture(×250)購(gòu)自Multiscience公司；嗜堿性粒細(xì)胞負(fù)選試劑盒EasySep Human Basophil Enrichment Kit及HetaSepTMBuffer購(gòu)自Stemcell公司；溴化氰活化高速4B瓊脂糖購(gòu)自GE Helthcare公司；胎牛血清及1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锟萍脊荆还潭ㄒ?、染色液及?0穿透液購(gòu)自eBioscience公司。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為Roche Diagnostics GmbH的Cobase 601；磁極EasySepTMMagnet購(gòu)自Stemcell公司；流式細(xì)胞儀為BD公司的FACSCantoTMⅡ型；CO2培養(yǎng)箱為Heraeus公司。

1.2 主要方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞活化情況 采集RA病人和正常人對(duì)照組EDTA 抗凝的外周靜脈血，密度梯度離心法獲得PBMC。PBS洗滌后分別加入4支流式管(A、B、C、D)并用染色液重懸，A、C、D管加入PE標(biāo)記的鼠抗人CD203c 抗體，B管滴加與抗體相等量的同型對(duì)照抗體，混勻，避光孵育30 min；PBS洗滌后加入固定液混勻，室溫避光孵育15 min，A、B管用PBS洗滌離心。C、D管再加入通透液混勻，1 500 r/min×6 min 離心洗滌一次。棄上清，加入通透液，C管滴加PE-Cy7標(biāo)記的鼠抗人IL-4抗體，D管滴加相等量的同型對(duì)照抗體，避光孵育40 min。PBS洗滌重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。以CD203c同型對(duì)照組為基準(zhǔn)畫(huà)門(mén)，確定嗜堿性粒細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)位置，接著對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門(mén)。以同型對(duì)照為基準(zhǔn)確定IL-4的陽(yáng)性表達(dá)位置。

1.2.2 RA患者血清中IgE水平的檢測(cè) 全部入組的患者以及健康對(duì)照組外周靜脈血分離的血清經(jīng)羅氏Cobase 601化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)IgE(包括游離的IgE和含IgE的免疫復(fù)合物，即與特異抗原結(jié)合形成的CIC)。

1.2.3 親和層析純化IgE 取適量的溴化氫活化的瓊脂糖微球置于1 mmol/L HCl中懸浮溶脹，與anti-human IgE抗體一同加入含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L NaHCO3(pH=8.3)偶聯(lián)液中，4℃過(guò)夜。轉(zhuǎn)移到0.1 ml Tris-HCl(pH=8.0)，常溫反應(yīng)2 h，裝柱，用含有0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH=4.0)和含有0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8)交替洗滌，用PBS洗滌平衡柱子至pH=7.2～7.4。將血清樣品上樣，再用PBS平衡柱子至pH=7.2～7.4。用0.1 mol/L(pH=2.4)甘氨酸-HCl洗脫，洗脫下的溶液立即用1 mol/L NaHCO3中和至pH=7.2～7.4，然后濃縮，并用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)定量，用Western blot分析制備好的IgE。

1.2.4 正常人外周血嗜堿性粒細(xì)胞的負(fù)選 采集EDTA抗凝的外周血，HetasepTM分離液分離多型核細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107個(gè)/ml，置于5 ml的聚苯乙烯材質(zhì)的管中。加入負(fù)選試劑盒中的 EasySep Human Basophil Enrichment Cocktail 50 μl/(ml cells)，混勻，常溫孵育10 min，再加100 μl/(ml cells)的Nanoparticles，混勻，常溫孵育10 min。加入含有2%FBS和EDTA的PBS至2.5 ml，吹打混勻，放入EasySepTMMagnet磁極中，常溫放置5 min。將整個(gè)磁極拿起，輕輕傾斜倒出細(xì)胞液，重復(fù)3次。最后收集的細(xì)胞懸液為嗜堿性粒細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)其活性并用流式檢測(cè)純度。

1.2.5 IgE的微環(huán)境對(duì)嗜堿性粒細(xì)胞的活化情況 將嗜堿性粒細(xì)胞懸液種于12孔板內(nèi)(5.0×105個(gè)/孔)，設(shè)A、B、C、D、E五孔。A孔細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加20%的正常人血清；B孔細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加20%RA患者的血清；C孔細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加了已去除IgE的20%的RA血清；D孔細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加純化的IgE(5 μg/ml)；E孔細(xì)胞培養(yǎng)基中添加anti-IgE抗體，作為陽(yáng)性對(duì)照組。另外，各孔同時(shí)添加IL-3(終濃度為10 ng/ml)以維持嗜堿性粒細(xì)胞的存活。于37℃、5%CO2養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，30 min和12 h后，分別檢測(cè)CD203c的水平及IL-4陽(yáng)性比例情況。

2 結(jié)果

2.1 正常人對(duì)照組和RA患者組外周嗜堿性粒細(xì)胞活化情況 RA患者組外周血嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)CD203c的水平(MFI)高于正常人對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1，而不同活動(dòng)度組間無(wú)顯著性差異。

2.2 正常人對(duì)照組和RA患者組外周血IL-4陽(yáng)性嗜堿性粒細(xì)胞的比例 RA患者外周血IL-4陽(yáng)性嗜堿性粒細(xì)胞的比例高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2A)；當(dāng)評(píng)分為低中度時(shí)，IL-4陽(yáng)性的比例高于正常人對(duì)照組和高活動(dòng)度組(P<0.05)，高活動(dòng)度組與正常人對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2B。

圖1 正常人對(duì)照組和RA患者組外周血嗜堿性粒細(xì)胞CD203c表達(dá)情況Fig.1 Expression of CD203c on basophils from RA patients and healthy controlsNote: Basophils were identified by the expression of CD203c;A.The abscissa representatives fluorescence intensity of PE-CD203c;B.RA patients (n=30),healthy controls (n=18),**.P<0.01.

2.3 RA患者組和正常人對(duì)照組血清IgE水平的比較 RA患者組血清IgE水平顯著高于正常人對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。低中活動(dòng)度組和高活動(dòng)度組分別與正常人對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低中活動(dòng)度組與高活動(dòng)度組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3B。

2.4 RA患者來(lái)源的IgE可活化正常人來(lái)源的嗜堿性粒細(xì)胞 通過(guò)免疫印跡檢測(cè)純化濃縮后的IgE和去除IgE的血清，發(fā)現(xiàn)親和層析方法可以有效地分離RA血清中的IgE，進(jìn)而得到高純度的IgE和去除IgE的血清(圖4)。

流式檢測(cè)正常人外周血負(fù)選前和負(fù)選后的嗜堿性粒細(xì)胞純度，發(fā)現(xiàn)負(fù)選后可得到高純度的嗜堿性粒細(xì)胞(圖5)。

將正常人來(lái)源的嗜堿性粒細(xì)胞分別置于含正常人血清(Control)、RA患者血清(Serum,RA patients)、去除IgE的RA患者血清(IgE free,RA patients)，以及RA患者血清純化的IgE(purified IgE,RA patients)的培養(yǎng)液中刺激30 min和24 h，以anti-IgE抗體刺激組為陽(yáng)性對(duì)照，各組嗜堿性粒細(xì)胞CD203c的表達(dá)(圖6A)和IL-4陽(yáng)性比例(圖6B)顯著不同。

圖2 正常人對(duì)照組和RA患者組外周血IL-4陽(yáng)性嗜堿性粒細(xì)胞比例Fig.2 Proportion of IL-4 positive basophils in RA patients and healthy controlsNote: A.RA patients (n=30),healthy controls (n=18);B.Low and medium activity RA group (n=16),and high activity RA group (n=14).*.P<0.05.

圖3 正常人對(duì)照組和RA患者組總IgE水平比較Fig.3 Total serum levels of IgE in RA patients and healthy controlsNote: A.RA patients (n=30),healthy controls (n=18);B.Healthy controls (n=18),low and medium activity RA group (n=16),and high activity RA group (n=14).*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 免疫印跡檢測(cè)親和層析分離的RA患者IgE Fig.4 Western blot detection of IgE purified by affinity chromatography from RA patients

圖5 負(fù)選正常人外周血細(xì)胞中嗜堿性粒細(xì)胞Fig.5 Basophils negatively isolated from healthy controls

圖6 RA患者來(lái)源的IgE對(duì)正常人來(lái)源的嗜堿性粒細(xì)胞的活化作用Fig.6 Role of IgE isolated from RA patients in activation of basophils negatively isolated from healthy controlsNote: The expression of CD203c (A) and proportion of IL-4 positive basophils (B) in different groups.*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

活化的嗜堿性粒細(xì)胞參與過(guò)敏性疾病的發(fā)展已被人們所知曉，其在過(guò)敏原的誘導(dǎo)下，活化的嗜堿性粒細(xì)胞釋放大量的活性介質(zhì)(組胺、白三烯、細(xì)胞因子等)，與此同時(shí)表面標(biāo)志物CD203c和/或CD63表達(dá)上調(diào)[9]。研究顯示CD203c不僅是嗜堿性粒細(xì)胞的一個(gè)特異性較強(qiáng)的標(biāo)志物，而且也是一個(gè)敏感的活化指標(biāo)[10]。嗜堿性粒細(xì)胞活化是多途徑的，可以被細(xì)胞因子、蛋白酶、抗體、Toll樣受體配體和補(bǔ)體介導(dǎo)的一系列信號(hào)所活化。當(dāng)今研究者們也已達(dá)成共識(shí)，嗜堿性粒細(xì)胞是產(chǎn)生Th2細(xì)胞分化過(guò)程中必要的細(xì)胞因子IL-4的早期細(xì)胞，而IgE是介導(dǎo)其活化的主要途徑[7,8]。已報(bào)道在自身免疫性疾病如SLE患者中嗜堿性粒細(xì)胞活化時(shí)，在外周血微環(huán)境誘導(dǎo)下可使其釋放致病性炎癥因子(IL-4、6、13等)，進(jìn)而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周嗜堿性粒細(xì)胞胞膜CD203c表達(dá)明顯升高，處于高度活化狀態(tài)，活化的嗜堿性粒細(xì)胞合成分泌IL-4增加，進(jìn)而參與疾病的進(jìn)展。

IgE是一類(lèi)只存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的經(jīng)典免疫球蛋白亞型，在過(guò)敏疾病及自身免疫性疾病中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血血清中存在高水平的IgE，而且總IgE水平與IL-4陽(yáng)性嗜堿性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)。我們推測(cè)IgE可促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞的活化。為了驗(yàn)證該推測(cè)，我們將復(fù)選的高純度嗜堿性粒細(xì)胞置于含或不含IgE的微環(huán)境中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞在含IgE的微環(huán)境中的活化程度明顯高于在不含IgE的微環(huán)境中。表明RA患者外周血中高水平的IgE可促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞的活化。這是因?yàn)槭葔A性粒細(xì)胞表面表達(dá)大量高親和力IgE受體FcεRⅠα。嗜堿性粒細(xì)胞通過(guò)IgE高親和力受體FcεRⅠ與IgE-抗原復(fù)合物交聯(lián)，可激活一系列信號(hào)通路(信號(hào)分子Fyn、Syk、Lyn、PI3K及Akt等)，誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞活化，釋放炎性介質(zhì)導(dǎo)致組織損傷[12]。同時(shí)，活化后的嗜堿性粒細(xì)胞表面的一系列膜分子表達(dá)上調(diào)(CD203c、CD63、CD11b、CD62L等)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。

眾所周知，RA患者血清總IgE包括游離的IgE和含IgE的免疫復(fù)合物(即與特異抗原結(jié)合形成的循環(huán)免疫復(fù)合物)。本研究用anti-IgE抗體刺激嗜堿性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以使其活化，并合成分泌IL-4。表明RA患者血清游離的IgE可以誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞活化。此外，含IgE的免疫復(fù)合物也可能誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞活化。一方面，RA外周血循環(huán)著大量自身反應(yīng)性致病抗體(如類(lèi)風(fēng)濕性因子、抗瓜氨酸蛋白抗體等)，并以各種免疫復(fù)合物形式存在，而且其抗體滴度與疾病的活動(dòng)性密切相關(guān)[13,14]。另一方面，研究也發(fā)現(xiàn)在RA患者體內(nèi)存在IgE型免疫復(fù)合物，尤其是合并有重度關(guān)節(jié)炎及血管炎的患者[15-17]。此外，在RA血清中瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸抗體IgE-ACPAs形成免疫復(fù)合物通過(guò)與FcεRⅠ受體交聯(lián)活化嗜堿性粒細(xì)胞[18]。RA中雖然含IgE的免疫復(fù)合物也可誘導(dǎo)嗜堿粒細(xì)胞活化，但是，具體有哪些致病抗體與IgE形成免疫復(fù)合物，通過(guò)何種途徑參與RA疾病的發(fā)病尚不清楚，有待深入研究。

綜上，RA患者嗜堿性?；罨c發(fā)病相關(guān)，且主要由IgE介導(dǎo)，靶向嗜堿性粒細(xì)胞及其活化通路有望為RA的防治提供新的策略。

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[收稿2016-07-22]

(編輯 倪 鵬)

Mechanisms of peripheral basophils activation in patients with rheumatoid arthritis

LANQiao-Fen,LIAOHuan-Jin,CHENQiu-Hua,CAIJun,ZHANGLi-Fang,PENGYan-Xia,HEYi-Ming,WUPing,XIETong,PANQing-Jun.

ClinicalResearchCenter,AffilicatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China

Objective:To investigate the activation of peripheral basophils from patients with rheumatoid arthritis (RA) and its mechanisms.Methods: The activation markers including CD203c and the proportion of IL-4 positive rate of peripheral basophils from RA patients and healthy controls were detected by flow cytometry.Serum levels of IgE in RA patients and healthy controls were detected by electrochemilu minescence immunoassay.Basophils were negatively isolated and co-cultured with or without purified IgE,anti-IgE as positive control,then,the expression of CD203c and propotion of IL-4 positive basophils were detected by flow cytometry.Results: The expression of CD203c and IL-4 positive rate of basophils from RA patients were higher than that of healthy controls (P<0.05).Serum levels of IgE in RA were higher than that of healthy controls (P<0.05).After co-cultured with isolated IgE from RA patients,basophils negatively isolated from healthy controls were activated,and higher expression of CD203c and proportion of IL-4 (P<0.05).Conclusion: Basophil activation is related with development of RA,and its activation is mainly mediated by IgE.Targeting basophil and its activation pathway would be expected to provide new strategies for the treatment of RA.

Rheumatoid arthritis;Basophil;Activation;IgE;IL-4

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.017

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81471530)和廣東省自然科學(xué)基金(No.S2013010011568)。

蘭巧芬(1991年-)，女，在讀碩士，E-mail:18719097947@163.com。

及指導(dǎo)教師：謝 彤(1967年-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫性疾病防治研究，E-mail:xt1234@163.com。 潘慶軍(1978年-)，男，博士，副教授，主要從事自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

R539.22

A

1000-484X(2017)01-0085-05

②共同第一作者。

③廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湛江524001。

④廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江524001。