楊鎵寧 鄧 菲 潘 寧

(四川省醫(yī)學科學院,四川省人民醫(yī)院皮膚外科,成都610072)

c-Myc調(diào)控PIK3R3抑制黑色素瘤B16-F10細胞的遷移和侵襲①

楊鎵寧 鄧 菲②潘 寧

(四川省醫(yī)學科學院,四川省人民醫(yī)院皮膚外科,成都610072)

目的：探討c-Myc調(diào)控PIK3R3對黑色素瘤B16-F10細胞的遷移和侵襲的影響。方法：運用免疫組化檢測PIK3R3在正常皮膚組織和黑色素瘤組織的表達；檢測慢病毒(LV3-c-Myc和LV3-PIK3R3)對c-Myc和PIK3R3基因的沉默效率；使用EdU增殖實驗檢測沉默c-Myc和PIK3R3后黑色素瘤細胞株B16-F10的增殖情況；Transwell侵襲實驗檢測c-Myc和PIK3R3的表達對黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲能力的影響；劃痕實驗檢測c-Myc和PIK3R3的表達對黑色素瘤細胞B16-F10遷移能力的影響；qPCR檢測沉默c-Myc和PIK3R3后miR-199a的表達；qPCR檢測轉(zhuǎn)染miR-199a mimics和miR-199a inhibitor后c-Myc和PIK3R3的表達；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-199a對c-Myc和PIK3R3轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果：和正常皮膚組織比較，PIK3R3在黑色素瘤組織中表達明顯增加；沉默c-Myc和PIK3R3基因后，黑色素瘤細胞株B16-F10的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低；沉默c-Myc和PIK3R3基因后，miR-199a表達上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-199a mimics后，c-Myc和PIK3R3表達降低；轉(zhuǎn)染miR-199a inhibitor后，c-Myc和PIK3R3表達上調(diào)；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，miR-199a可以直接調(diào)控c-Myc和PIK3R3的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論：c-Myc可以通過miR-199a調(diào)控PIK3R3的表達，從而促進黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

miR-199a；c-Myc；黑色素瘤；Western blot;Transwell;劃痕實驗;PIK3R3

黑色素瘤是高轉(zhuǎn)移高侵襲性的一種惡性腫瘤，也稱為惡性黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)，它是世界范圍內(nèi)男性中是第五大惡性腫瘤，女性中是第六大惡性腫瘤，通常發(fā)病在皮膚表面，約占皮膚腫瘤十分之一，一旦確診后患者的死亡率高達80%以上，較難治愈，在發(fā)病人群中存在一定的家族聚集現(xiàn)象[1]。黑色素瘤容易出現(xiàn)早起轉(zhuǎn)移，侵襲至其他組織器官，且在早期發(fā)病期間癥狀不明顯，不易發(fā)現(xiàn)，早期診斷率較低，一旦確診多屬于晚期情況，診斷治療的效果較差，這是導致黑色素瘤死亡率居高不下的主要原因[2]。因此，探討黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機制可以在一定程度上提高黑色素瘤的早期診斷和治療，有效減少腫瘤的發(fā)生和進展，進而降低黑色素瘤死亡率。

MicroRNA(miRNA) 是一類新的小分子非編碼RNA，可以與基因的3′-UTR端的連接，從而影響靶基因mRNA的性能，對細胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移以及凋亡進行調(diào)控[3]。miRNA領域在黑色素瘤中涉及較少，只有少量報告對黑色素瘤的單一表達譜進行研究，比如在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)miR-221可結(jié)合的3-UTR′端，調(diào)控酪氨酸激酶信號通路中關(guān)鍵受體Ckit的轉(zhuǎn)錄和翻譯，提示其參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程[4]。miR-199a和miR-33的表達與黑色素瘤的高轉(zhuǎn)移特性顯著正相關(guān)，可能成為黑色素瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵miRNA[5]。

Myc基因是較早發(fā)現(xiàn)的癌基因，Myc基因家族包括c-Myc、N-Myc、L-Myc等，其中c-Myc定位于8號染色體上。c-Myc由不編碼蛋白質(zhì)的第1 外顯子和編碼蛋白質(zhì)的第2、3外顯子構(gòu)成。c-Myc 基因編碼c-Myc致癌蛋白，可以調(diào)控細胞增殖功能。c-Myc 是一個多功能的基因，可以調(diào)控細胞周期，細胞的生長代謝、細胞惡性轉(zhuǎn)變等生物學功能[6,7]。正常細胞中的 c-Myc 原癌基因一旦被異常激活為癌基因，c-Myc mRNA 和 c-Myc蛋白的相關(guān)表達會異常增高，使細胞的生長增殖不受正常的調(diào)節(jié)限制，開始向惡性細胞特性轉(zhuǎn)變，同時c-Myc的高水平表達還可以抑制細胞的正常分化，影響細胞的正常凋亡，進而誘導腫瘤的發(fā)生。Wang等[8]研究表明，c-Myc基因表達與脈絡膜黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但是在皮膚黑色素瘤中c-Myc的表達水平和調(diào)控機制尚未有文獻報道。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3R3)是信號通路中重要的信號因子，參與細胞增殖、生長、分化、細胞遷移和凋亡等多個生理過程，在多種腫瘤中存在廣泛激活的現(xiàn)象[9]。PIK3CA基因在非小細胞肺癌、前列腺癌和腸癌等腫瘤中表達增高。經(jīng)過活化后的PIK3R3可調(diào)控Akt、mTOR等家族成員等[10]。PIK3R3的異常表達會影響癌細胞的遷移侵襲等生物學功能[11]。因此，我們推測可能通過miR199a負性調(diào)控的c-Myc表達通過PI3K/AKT信號通路抑制黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學功能，并研究c-Myc在黑色素細胞中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚黑色素瘤細胞株B16-F10購買自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI1640，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基均購自Gibco公司。PIK3R3兔單克隆抗體均購自Abcam(ab186612)。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。miR-199a mimics，miR-199a inhibitors，PIK3R3和c-Myc沉默及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術(shù)有限公司。miR-199a、PIK3R3和c-Myc qPCR引物以及RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購自廣州復能基因有限公司。

1.2 方法

1.2.2 qPCR 熒光定量PCR檢測miR-214、PIK3R3和c-Myc的表達 用Trozel (Gibco) 抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增miR-199a、PIK3R3和c-Myc，PIK3R3和c-Myc用GAPDH作為內(nèi)參物，miR-199a使用U6作為內(nèi)參。反應條件：以100 ng總RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應條件為：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根據(jù)PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。

1.2.3 PIK3R3蛋白檢測 配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗(山羊抗人PIK3R3多克隆抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記兔抗羊IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗檢測黑色素瘤細胞遷移能力 所有試劑及器材均于冰上預冷，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠 50 μl (0.2 μg/μl)，37孵育15 min，使膠凝固；消化、離心、計數(shù)細胞后，按照2.5×104ml-1用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，制成細胞懸液；按照每孔200 μl，將細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基600 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結(jié)晶紫染色10 min，然后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)膜上的細胞。顯微鏡下技術(shù)，計數(shù)4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.2.5 劃痕實驗檢測黑色素瘤細胞遷移能力 劃痕實驗：將B16-F10細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200 μl消毒槍頭從上而下劃線，并在顯微鏡下觀察，測量劃痕的初始距離(0 h)；在24 h后，測量劃痕的距離，并拍照，計算細胞的遷移率。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 PIK3R3在黑色素瘤組織中表達增加 黑色素瘤及癌旁組織免疫組化結(jié)果顯示，PIK3R3定位在細胞核中，胞漿和胞質(zhì)中較少。PIK3R3在黑色素瘤癌組織中呈強陽性表達，在癌旁組織中呈弱陽性表達(圖1)。黑色素瘤組織中PIK3R3的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

2.2 c-Myc在不同黑色素瘤細胞株中的表達 Western blot實驗結(jié)果顯示： 相比WM451、 A375、SK-MEL-1、B16-BL6細胞株，c-Myc蛋白在B16-F10細胞株中表達最高，所以后續(xù)實驗我們選取B10-F10作為實驗細胞株，見圖2。

圖1 免疫組化檢測PIK3R3在黑色素瘤組織和癌旁組織的表達情況(×40)Fig.1 Expression of PIK3R3 in Melanoma was detected using immunohistochemical staining(×40)Note: *.P<0.05.

2.3 c-Myc通過miR-199a調(diào)控 PIK3R3的表達 我們通過生物信息學進行預測(Targetscan)、c-Myc和 PIK3R3互為內(nèi)源競爭性RNA。c-Myc和PIK3R3可能通過miR-199a進行相互調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組(LV3-NC)比較，黑色素瘤細胞株B16-F10感染慢病毒LV3-c-Myc后，PIK3R3的蛋白水平和 mRNA水平明顯降低(圖3A，P<0.05)。

圖2 c-Myc在不同黑色素瘤細胞株中的表達Fig.2 Expression of c-Myc in different melanoma cell linesNote: *.P<0.05.

圖3 c-Myc通過miR-199a調(diào)控 PIK3R3的表達Fig.3 c-Myc regulated PIK3R3 through miR-199aNote: *.P<0.05.A.The level of PIK3R3 mRNA decreased after silencing c-Myc;B.PIK3R3 protein level decreased after silencing c-Myc;C.c-Myc mRNA level decreased after silencing PIK3R3;D.mRNA level of miR-199a after increased silencing PIK3R3 and c-Myc.Error bars represent standard error.

同時我們發(fā)現(xiàn)，和對照組(LV3-NC)比較，黑色素瘤細胞株B16-F10感染慢病毒LV3-PIK3R3后，c-Myc的mRNA水平明顯下調(diào)(圖3B，P<0.05)。我們的結(jié)果提示，c-Myc和 PIK3R3可以相互調(diào)控。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，分別沉默c-Myc和PIK3R3后，miR-199a表達升高(圖3C，P<0.05)，這提示miR-199a是c-Myc和PIK3R3相互調(diào)控的一個關(guān)鍵因子。

2.4 c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點 為了進一步證實c-Myc和 PIK3R3互為內(nèi)源競爭性RNA，運用B16-F10細胞，我們轉(zhuǎn)染miR-199a mimics和miR-199a inhibitors。結(jié)果顯示(圖3)，和對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-199a mimics后，c-Myc和 PIK3R3表達降低；轉(zhuǎn)染miR-199a inhibitors后，c-Myc和 PIK3R3表達上調(diào)。同時雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點。結(jié)果提示，c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點，c-Myc和PIK3R3可能通過miR-199a相互調(diào)控。見圖4。

2.5 沉默c-Myc和PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10侵襲能力降低 細胞侵襲穿過Matrigel基質(zhì)膠的能力可以反映細胞的侵襲能力。Transwell實驗結(jié)果表明：感染LV3-c-Myc或者LV3-PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10通過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)量分別為(45.54±6.76)和 (50.65±4.63)明顯少于感染LV3-NC的B16-F10細胞 (310.90±21.86)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。我們的結(jié)果說明，沉默c-Myc和PIK3R3可以抑制黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲能力，見圖5。

圖4 c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點Fig.4 c-Myc and PIK3R3 are direct target of miR-199aNote: *.P<0.05.A.c-Myc and PIK3R3 were down-regulated after transfection with miR-199a mimics;B.c-Myc and PIK3R3 were up-regulated after miR-199a inhibitors transfection;C,D.c-Myc and PIK3R3 are direct targets of miR-199a.Error bars represent standard error.

2.6 沉默c-Myc和PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10遷移能力降低 在顯微鏡下測量24 h后，各組細胞任意三個部位的劃痕的寬度，遷移率=[D(t=24 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。劃痕實驗結(jié)果表明：與LV3-NC轉(zhuǎn)染細胞組比較，在24 h時，LV3-c-Myc或LV3-PIK3R3感染細胞組遷移率明顯降低 [ (0.79±

圖5 Transwell侵襲實驗檢測沉默c-Myc和PIK3R3對黑色素瘤細胞B16-F10侵襲能力的影響Fig.5 Effect on invasion ability of B16-F10 after silencing c-Myc and PIK3R3 cells were detected by Transwell matrigel invasion assaysNote: *.P< 0.05.Error bars represent standard error.

圖6 劃痕實驗檢測沉默c-Myc和PIK3R3對黑色素瘤細胞B16-F10轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.6 Effect on migration ability of B16-F10 cells after silencing c-Myc or PIK3R3 were detected by wound healing assaysNote: *.P< 0.05.Error bars represent standard error.

圖7 沉默c-Myc的表達可以抑制黑色素瘤細胞的體內(nèi)成瘤能力Fig.7 Ability in vivo tumorigenicity of B16-F10 cells after silencing c-Myc were detected in nude miceNote: Error bars represent standard error.*.P< 0.05.

0.04)% vs (0.42±0.02)%,P<0.05;(0.79±0.04)% vs (0.32±0.04)%,P<0.05]，差異有統(tǒng)計學意義。表明沉默c-Myc和PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10遷移能力降低，見圖6。

2.7 沉默c-Myc后，黑色素瘤細胞成瘤能力減弱 裸鼠體內(nèi)成瘤可以檢測腫瘤細胞在體內(nèi)的生物活性和增值侵襲能力。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗表明，沉默c-Myc的黑色素瘤細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤情況明顯與對照組相比要慢，4周后腫瘤體積與對照組相比要小[(1.68±0.08)cm3vs (0.37±0.12)cm3,P<0.05]，4周后腫瘤質(zhì)量與對照組相比要輕[(1.45±0.11) g vs (0.32±0.06) g,P<0.05]。差異有統(tǒng)計學意義。說明沉默c-Myc后黑色素瘤B16-F10細胞的裸鼠體內(nèi)成瘤能力受到的抑制，見圖7。

3 討論

皮膚黑色素瘤起源于神經(jīng)棘來源的黑色素細胞的惡性腫瘤，其惡性程度極高。黑色素細胞在各種體內(nèi)外致癌因素的影響下，早期就可以出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，容易導致轉(zhuǎn)移部位異常增生，除了細胞異常增生，細胞凋亡也出現(xiàn)不可調(diào)控的狀態(tài)，黑色素瘤的臨床診斷和治療都有很大的滯后性。探索黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展的生物學機制，并探討黑色素瘤發(fā)生和進展的分子生物學機制，可以為黑色素瘤的診治提供新的重要途徑[12]。

在多種腫瘤中都可以發(fā)現(xiàn)c-Myc 的異常活化的現(xiàn)象。在小鼠的肝臟模型中過表達c-Myc 可誘發(fā)小鼠肝臟腫瘤的形成[13]，在臨床患者肝癌樣品組織中也能觀察到c-Myc 組織學表達的異常增高[14]。通過針對肝癌基因芯片的生物學表達及功能分析發(fā)現(xiàn)，c-Myc基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[15]。Baroudi等[16]研究表明，在細胞中c-Myc的異常激活可以導致miRNA功能被抑制，從而促進惡性腫瘤的發(fā)生，該結(jié)果提示，c-Myc所介導的基因表達沉默可能會引起腫瘤中miRNA水平廣泛下調(diào)。我們實驗旨在驗證c-Myc介導的基因沉默在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中所起到的作用及其可能的生物學機制。

目前關(guān)于miRNA的研究包括生物信息學預測以及生物芯片篩選，但兩者都需要通過后續(xù)試驗驗證[17，18]。由于miRNA的作用機制非常復雜，比如：調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性或者定位[19]和DNA以及RNA之間相互作用調(diào)控基因表達[20，21]、形成mRNA調(diào)控基因的表達[22]、調(diào)控mRNA前體的拼接、作為內(nèi)源性競爭性RNA發(fā)揮調(diào)控作用等。本研究通過生物信息學分析我們的研究證實，c-Myc通過miR-199a調(diào)控PIK3R3的表達，影響黑色素瘤B16-F10的遷移和侵襲，從而促進黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3R3)是細胞內(nèi)脂質(zhì)底物的轉(zhuǎn)換器。可以被酪氨酸激酶激活，進而產(chǎn)生第二信使(cAMP，cGMP)參與多條信號通路，調(diào)控細胞的增殖和侵襲。Huang等[23]研究表明PIK3R3在結(jié)腸癌中，可以促進其生長和轉(zhuǎn)移，抑癌因子miR-152可以直接靶向PIK3R3抑制結(jié)腸癌的惡性生物學行為。有研究發(fā)現(xiàn)，PIK3R3可以誘導EMT從而促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移能力[24]。在黑色素瘤當中，miR-221可以通過靶向PIK3R3抑制黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[25]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PIK3R3在黑色素瘤組織中表達增加，同時沉默PIK3R3后，黑色素瘤B16-F10細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力降低，這和前面其他研究報告結(jié)果相一致。

周建大等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤中，miR-199a可以通過靶向調(diào)控Let-7b，抑制黑色素瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。另一項研究表明，奈鉑達通過促進miR-199a表達抑制黑色素瘤細胞B16-F10的增殖和侵襲[27]。在黑色素瘤細胞B16-F10中，過表達miR-199a后，癌細胞明顯被抑制。這說明miR-199a參與了黑色素瘤的發(fā)生和進展。我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a可以直接靶向調(diào)控c-Myc和PIK3R3。這說明Myc和PIK3R3可能是促進腫瘤的作用，并且也間接說明c-Myc和PIK3R3之間的相互調(diào)控是通過miR-199a來實現(xiàn)的。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細胞B16-F10中，c-Myc的沉默會通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路中PIK3R3蛋白來相應下調(diào)促癌miR199a分子的表達，并且發(fā)現(xiàn)促癌miR-199a與PIK3R3復合物之間有一種相互抑制的關(guān)系，從而可以形成一個雙負反饋環(huán)路。在黑色素瘤發(fā)生的過程中，該環(huán)路的失衡會導致miR-199a的進一步過表達以及下游信號通路的異?；罨１狙芯拷Y(jié)果不但豐富了miRNA表觀沉默機制的內(nèi)容，而且還為以c-Myc和PIK3R3為分子靶標的黑色素瘤癌治療新策略提供了新的理論依據(jù)。

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[收稿2016-08-15 修回2016-10-12]

(編輯 許四平)

c-Myc promoted migration and invasion of malignant melanoma B16-F10 cells through regulating PIK3R3

YANGJia-Ning，DENGFei，PANNing.

DepartmentofDermatologicalSurgery,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective:To investigate the effect and the related mechanism of c-Myc on the proliferation,invasion and migration ability of malignant melanoma B16-F10 cells.Methods: We detected the expression of PIK3R3 in malignant melanoma and normal tissues.Efficiency of gene silencing of c-Myc and PIK3R3 was determined by qPCR and Western blot.We detected the proliferate ability of B16-F10 cells after silencing c-Myc and PIK3R3 using EdU assay.We detected the migration and invasion ability of B16-F10 cells after silencing c-Myc and PIK3R3 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.The expression of miR-199a after silencing c-Myc and PIK3R3 using qPCR.The expression of c-Myc and PIK3R3 was detected by qPCR after transfecting miR-199a mimics or miR-199a inhibitor.Dual-luciferase reporter assay system was used to detect miR-199a regulating c-Myc and PIK3R3.Results: Compared normal skin tissue,expression of PIK3R3 was significantly increased in malignant melanoma tissue;after silencing c-Myc and PIK3R3 gene,the proliferation,invasion and metastasis of melanoma cell line B16-F10 were significantly reduced;expression of miR-199a upregulated after silencing c-Myc and PIK3R3 genes,expression of c-Myc and PIK3R3 decreased after transfecting miR-199a mimics,expression of c-Myc and PIK3R3 upregulated after transfecting miR-199a inhibitor,dual luciferase reporter system test results revealed miR-199a can directly regulate c-Myc and PIK3R3 transcription activity.Conclusion: miR199a regulated the expression of c-Myc,then promote proliferation,migration and invasion in malignant melanoma cells.

miR-199a;c-Myc;Malignant melanoma;Western blot;Transwell;Wound healing assay;PIK3R3

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.013

①本文為四川省衛(wèi)計委科研課題(No.140084)。

楊鎵寧(1981年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事皮膚腫瘤的基礎與臨床研究，E-mail：13880602002@163.com。

R739.5

A

1000-484X(2017)01-0066-06

②四川省醫(yī)學科學院，四川省人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，成都610072。