方艷秋 魏海峰 李 丹 米旭光 劉 磊 李首慶 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗中心，長春130021)

·生物治療·

CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗的體內(nèi)抗腫瘤活性觀察①

方艷秋 魏海峰 李 丹②米旭光 劉 磊 李首慶 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗中心，長春130021)

目的：觀察已構(gòu)建的含有CEA625-667基因單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667對荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的抑制情況及小鼠存活時間的改變。方法：建立小鼠肝細(xì)胞癌實(shí)驗動物模型，應(yīng)用單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠，以生理鹽水為對照組，觀察各實(shí)驗組小鼠皮下腫瘤生長情況，記錄皮下腫瘤生長曲線，觀察疫苗對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響以及疫苗對荷瘤小鼠生存時間的影響。結(jié)果：與生理鹽水對照組相比，兩種疫苗均能明顯抑制CEA陽性荷瘤小鼠的腫瘤體積以及生長速度(P<0.01)，其中，pcDNA-triCEA625-667疫苗組的抑制作用明顯優(yōu)于pcDNA-CEA625-667疫苗組(P<0.01)，而二者均不能抑制CEA陰性荷瘤小鼠的腫瘤生長。pcDNA-CEA625-667疫苗組平均生存時間為(48.50±6.73)d，與生理鹽水對照組(39.00±6.64)d相比有顯著差異(P<0.01)；pcDNA-triCEA625-667疫苗組生存時間(48.50±6.73)d明顯高于生理鹽水對照組和pcDNA-CEA625-667疫苗組(P<0.01)。兩組疫苗均不能延長CEA陰性荷瘤小鼠的生存時間。結(jié)論：無論是單倍體還是三串聯(lián)體的DNA疫苗，均能夠明顯抑制CEA陽性荷瘤小鼠的腫瘤生長速度(P<0.01)及明顯延長其生存時間(P<0.01)，而對CEA陰性荷瘤小鼠則無治療作用。

癌胚抗原；迷你基因；基因疫苗；體內(nèi)實(shí)驗；抗腫瘤

免疫基因治療已成為惡性腫瘤治療的新模式而日益受到人們的重視。癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen,CEA)的存在是其陽性腫瘤治療的靶向物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。CEA作為腫瘤相關(guān)抗原具有一定的抗原性，可以作為誘導(dǎo)腫瘤免疫的有效靶抗原，被機(jī)體內(nèi)特異性CTL識別，誘發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答[2]，故被應(yīng)用于其陽性腫瘤的主動免疫治療。通過前面的工作，我們已構(gòu)建了含有CEA625-667基因單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667[3]，并證實(shí)了該疫苗確能引起小鼠脾臟的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。本部分實(shí)驗擬進(jìn)一步觀察單倍體疫苗和三串聯(lián)疫苗對荷瘤小鼠(分別植入小鼠肝癌細(xì)胞H22-CEA+及H22-CEA-)體內(nèi)腫瘤的抑制情況及小鼠存活時間的改變，探討迷你基因串聯(lián)體疫苗應(yīng)用于CEA陽性腫瘤治療的可能性，為進(jìn)一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 CEA陽性小鼠肝癌細(xì)胞株(H22-CEA+)、CEA陰性小鼠肝癌細(xì)胞株(H22-CEA-)(本室制備并保存)；重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667(本室制備并保存)；IMDM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibcobrl公司)。

1.1.2 實(shí)驗動物 BALB/c小鼠購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物室，雄性，6～8周，體重18～22 g，在實(shí)驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗組和對照組。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細(xì)胞癌實(shí)驗動物模型的建立 將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。在小鼠的右前肋部分別皮下接種5×105、1×106、2×106個H22-CEA+肝癌細(xì)胞，觀察不同濃度H22-CEA+肝癌細(xì)胞對小鼠生存時間的影響。

1.2.2 疫苗免疫小鼠后皮下移植瘤生長情況 應(yīng)用單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠，觀察各實(shí)驗組小鼠皮下腫瘤生長情況，記錄皮下腫瘤生長曲線。實(shí)驗分組方法：將實(shí)驗小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。第1組腹腔注射0.5 ml生理鹽水；第2組脛前肌內(nèi)接種50 μl pcDNA-CEA625-667質(zhì)粒(1 mg/ml)；第3組脛前肌內(nèi)接種50 μl pcDNA-triCEA625-667質(zhì)粒(1 mg/ml)。3周后，第1、2、3組小鼠每只皮下接種0.2 ml CEA陽性小鼠肝癌細(xì)胞H22-CEA+(約含2×105個細(xì)胞)；第2、3組小鼠每只皮下接種0.2 ml CEA陰性小鼠肝癌細(xì)胞H22-CEA-(約含2×105個細(xì)胞)。每3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑與短徑，計算腫瘤體積。

1.2.3 疫苗對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響 按照前述方案分組及免疫小鼠，接種CEA+及CEA-肝癌細(xì)胞，每周測量小鼠腫瘤直徑，觀察小鼠皮下腫瘤生長速度。

1.2.4 疫苗對荷瘤小鼠生存時間的影響 按照前述方案分組及免疫小鼠，接種CEA+及CEA-肝癌細(xì)胞，觀察疫苗對荷瘤小鼠生存時間的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，若方差齊則采用樣本均數(shù)比較的方差檢驗(LSD-t檢驗)，若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)；采用 Kaplan-Meier 法計算生存率，P<0.05或P<0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝細(xì)胞癌實(shí)驗動物模型的建立及其皮下接種H22-CEA+細(xì)胞對小鼠生存時間的影響 圖1結(jié)果表明，皮下接種1×106個腫瘤細(xì)胞組小鼠平均生存時間為(39.00±6.64)d，半數(shù)致死期為35 d，此接種數(shù)量最適合觀察微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞疫苗的治療效果，又能區(qū)別因操作失誤而引起的動物死亡。

2.2 疫苗對實(shí)驗小鼠成瘤情況的影響 單倍體疫苗和三串聯(lián)體疫苗接種均可以抑制CEA陽性腫瘤的生長，表現(xiàn)為腫瘤的生長速度緩慢、瘤塊較小，與生理鹽水對照組相比有顯著差異(P<0.05)，并且可以見到疫苗免疫組接種局部較早出現(xiàn)紅腫、破潰等炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞免疫增強(qiáng)的現(xiàn)象，表明疫苗對CEA陽性腫瘤有明顯的殺傷或抑制作用，見圖2。

圖1 皮下接種不同數(shù)量H22肝癌細(xì)胞后BALB/c小鼠的生存時間Fig.1 Survival time of BALB/c mice inoculated subcutaneously with H22 hepatocarcinoma cells

圖2 疫苗免疫后各組小鼠皮下腫瘤生長曲線Fig.2 Grow curve of subcutaneously tumor of various groups immuned by vaccine

圖3 疫苗對CEA+腫瘤荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響Fig.3 Effect of vaccine on growth velocity of CEA+ bearing cancer mice

圖4 疫苗對CEA+腫瘤荷瘤小鼠生存時間的影響Fig.4 Effect of vaccine on survival time of CEA+ bearing cancer mice

2.3 疫苗對CEA陽性荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響 圖3所示均為每組10只小鼠全部存活時的測量值。結(jié)果表明，與生理鹽水對照組相比，兩種疫苗均能明顯抑制CEA陽性荷瘤小鼠的腫瘤生長速度(P<0.01)，其中，pcDNA-triCEA625-667疫苗組的抑制作用明顯優(yōu)于pcDNA-CEA625-667疫苗組(P<0.01)，而二者均不能抑制CEA陰性荷瘤小鼠的腫瘤生長速度。

2.4 疫苗對CEA陽性荷瘤小鼠生存時間的影響 結(jié)果表明，兩組疫苗均能延長CEA陽性荷瘤小鼠的生存時間。生理鹽水對照組平均生存時間為(39.00±6.64)d，pcDNA-CEA625-667疫苗組平均生存時間為(48.50±6.73)d，與生理鹽水對照組相比有顯著差異(P<0.01)；pcDNA-triCEA625-667疫苗組觀察至70 d，小鼠均有半數(shù)以上存活，其生存率明顯高于生理鹽水對照組和pcDNA-CEA625-667疫苗組(P<0.01)。見圖4。此外，結(jié)果還顯示兩組疫苗均不能延長CEA陰性荷瘤小鼠的生存時間。

3 討論

CEA作為腫瘤相關(guān)抗原，可以被機(jī)體內(nèi)特異性CTL細(xì)胞識別，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被殺傷，而且CEA陽性腫瘤的瘤譜較廣，制成疫苗后，能克服其他腫瘤疫苗僅對一種腫瘤起作用的局限性，具有良好的開發(fā)價值和臨床應(yīng)用前景。本研究應(yīng)用同尾酶連接方法成功地構(gòu)建了含有CEA625-667迷你基因三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667，這種以抗原表位為基礎(chǔ)的基因免疫策略由于既純化了抗原性又減少了無關(guān)干擾序列的影響，免疫的效果將更加專一和精確，更符合疫苗的分子設(shè)計和開發(fā)研究[4]。

Rodriguez等[5]在研究抗病毒的表位疫苗時發(fā)現(xiàn)，用獨(dú)立的迷你基因免疫個體，再用病毒在4 d之后刺激機(jī)體，能產(chǎn)生在數(shù)量上與已知的有防御作用的疫苗在致敏病毒特異性T淋巴細(xì)胞方面相同的反應(yīng)，但奇怪的是，這些有活力的CTL效應(yīng)卻不能在正常致死量的病毒攻擊之下產(chǎn)生防御反應(yīng)，盡管這些CTL表現(xiàn)出全職的功能，也具有高度的裂解活性，與靶細(xì)胞的親和力和分泌CK方面也與病毒感染誘導(dǎo)的CTL一樣，但是這些迷你基因只能導(dǎo)致低頻率的CTL前體的出現(xiàn)；只有大約1/40 000個T細(xì)胞是表位特異的，這就提示了迷你基因質(zhì)粒的缺陷主要在于不能在細(xì)胞表面提供充足拷貝的肽-MHC復(fù)合物。為提高迷你基因的免疫原性，人們做過很多有益的嘗試，包括共表達(dá)泛素蛋白或一些免疫刺激分子[6-9]；直接將DNA接種到DC中等[10]。本研究在綜合考慮了疫苗制備的流程和成本等問題的前提下，擬將迷你基因連接成“串珠樣”，這樣的想法已經(jīng)有人做過嘗試[11,12]，并取得了良好的效果。

本研究結(jié)果提示：與對照組相比，無論是單倍體還是三串聯(lián)體的DNA疫苗，均能夠明顯抑制CEA陽性荷瘤小鼠的腫瘤生長速度(P<0.01)及明顯延長其生存時間(P<0.01)，而對CEA陰性荷瘤小鼠則無治療作用。應(yīng)用相同劑量的疫苗治療CEA陽性荷瘤小鼠，無論是在抑制荷瘤小鼠腫瘤生長速度方面，還是在延長荷瘤小鼠生存時間方面，三串聯(lián)體疫苗治療組明顯優(yōu)于單倍體疫苗組。本實(shí)驗的成功，為進(jìn)一步研究在人體應(yīng)用迷你基因DNA疫苗進(jìn)行有效治療CEA陽性腫瘤和預(yù)防手術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移奠定了基礎(chǔ)。由于CEA陽性腫瘤的瘤譜廣，發(fā)病率和惡性程度高，因此，CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗pcDNA-triCEA625-667將具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

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[收稿2016-10-09]

(編輯 倪 鵬)

Observation of anti tumor activity in vivo of three tandem repeats of minigene DNA vaccine derived from CEA gene

FANGYan-Qiu,WEIHai-Feng,LIDan,MIXu-Guang,LIULei,LIShou-Qing,TANYan.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China

Objective:To observe the inhibitory effect of haploid vaccine pcDNA-CEA625-667and three tandem repeats of minigene DNA vaccine pcDNA-triCEA625-667derived from CEA gene on tumor in mice bearing tumor and the changes of survival time.Methods: The experimental animal model of mouse liver cell carcinoma was established and the mice were immunized with pcDNA-CEA625-667and three series of DNA vaccine.Some of the mice were treated with normal saline as control group.The growth curve of tumor growth curve was recorded and the effect of vaccine on the survival time of tumor bearing mice was observed.Results: Compared with the normal saline control group,the two vaccines were able to significantly inhibit the tumor size and growth rate (P<0.01) of CEA positive tumor bearing mice,the inhibition of pcDNA-triCEA625-667vaccine group was significantly better than the pcDNA-CEA625-667vaccine group (P<0.01),while the two were not inhibited tumor growth in CEA negative tumor bearing mice.The average survival time of the pcDNA-CEA625-667vaccine group was(48.50±6.73)d,and there was significant difference (P<0.01) compared with the saline control group (39.00±6.64)d.The survival time (48.50± 6.73)d of the pcDNA-triCEA625-667vaccine group was significantly higher than that of the normal saline control group and the pcDNA-CEA625-667vaccine group (P<0.01).The survival time of CEA negative tumor bearing mice could not be prolonged in the two groups.Conclusion: Either the haploid or the three series of the DNA vaccine,were able to significantly inhibit tumor growth rate (P<0.01) and significantly prolong the survival time(P<0.01) of CEA positive tumor bearing mice,but they had no therapeutic effect on CEA negative tumor bearing mice.

Carcino-embryonic antigen;Minigene;DNA vaccine;Vivo experiment；Anti tumor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.012

①本文受吉林省科技廳國際合作項目(20140414043GH)、吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊項目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發(fā)資金(2016年度)和吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗室項目(20122113)資助。

方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療基礎(chǔ)與臨床研究,E-mail：yq.fang@163.com。

及指導(dǎo)教師：譚 巖(1956年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療及疫苗研發(fā)方面的研究,E-mail：tanyan49@hotmail.com。

R392 R730.5

A

1000-484X(2017)01-0062-04

②吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長春130012。