陳 娜 韓 潔 高春燕

(唐山婦幼保健院兒內(nèi)科,唐山063000)

扁蒴藤素對(duì)支氣管哮喘患兒Th17/Treg失衡的影響及意義

陳 娜 韓 潔 高春燕①

(唐山婦幼保健院兒內(nèi)科,唐山063000)

目的：探討扁蒴藤素對(duì)支氣管哮喘患兒Th17/Treg體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響及意義，從而探討免疫因素在支氣管哮喘治療中的機(jī)理。 方法：提取支氣管哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞，并在體外給予扁蒴藤素干預(yù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17及Treg比例，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17及TGF-β含量變化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RORγT及Foxp3含量。 結(jié)果：扁蒴藤素干預(yù)組與對(duì)照組相比，CD4+IL-17+T細(xì)胞(即Th17細(xì)胞)表達(dá)量顯著降低，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞(即Treg細(xì)胞)表達(dá)量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比，IL-17含量顯著降低，TGF-β含量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比，RORγT含量顯著降低，F(xiàn)oxp3含量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：扁蒴藤素干預(yù)可較大程度緩解體外培養(yǎng)Th17/Treg細(xì)胞失衡，提示該藥物可能通過影響免疫平衡來(lái)調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)生發(fā)展，為扁蒴藤素在臨床治療哮喘的應(yīng)用提供了理論支持。

Th17；Treg；扁蒴藤素；支氣管哮喘

哮喘作為影響患兒健康的重要疾病，其發(fā)病機(jī)制至今未明，但多數(shù)研究認(rèn)為其與機(jī)體免疫因素息息相關(guān)。Th17及Treg細(xì)胞是近年來(lái)研究和發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。已經(jīng)明確的是，Th17及Treg細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[1]。扁蒴藤素作為一種單體化合物(Pristimerin)，多是從衛(wèi)矛科南蛇藤植物中提取而來(lái)，具有抗炎、抗類風(fēng)濕、抗腫瘤及抗氧化等作用[2]。已有研究表明，扁蒴藤素對(duì)過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥具有保護(hù)作用，可顯著降低多種炎性細(xì)胞因子的分泌[3]，但其是否可以通過調(diào)控Th17及Treg細(xì)胞來(lái)影響哮喘至今未明。因此，本研究提取哮喘患兒的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，體外給予扁蒴藤素干預(yù)，觀測(cè)Th17/Treg的變化，來(lái)探討扁蒴藤素治療疾病的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 選取2014年1月到2015年10月在我院兒科就診的哮喘20例，其中男性10例，女性10例，年齡為2～6歲，平均(4.4±0.9)歲?；純翰∏榉现腥A醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，均為急性發(fā)作,此次發(fā)作前4周已停用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑，免疫增強(qiáng)劑等，患兒均無(wú)嚴(yán)重心、肝疾病史，近期無(wú)呼吸道感染。本調(diào)查程序符合本單位的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)，且已得到患兒與家屬的知情同意。

1.1.2 主要試劑 扁蒴藤素、離子霉素購(gòu)于Sigma公司，流式抗體CD3抗體，CD4單抗和CD25單抗，IL-17A單抗，F(xiàn)oxp3單抗及FACS透膜劑，及ELISA試劑盒均購(gòu)于Ebioscience公司，TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real-time)及TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒均購(gòu)于TaKaRa公司，佛波酯(PMA)，MTS/PMS混合液購(gòu)于Promga公司。

1.1.3 標(biāo)本采集 收集哮喘患兒入院時(shí)的血液標(biāo)本9 ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分離培養(yǎng) 將血液標(biāo)本與PBS緩沖液倍比稀釋混勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行步驟操作，將混合液輕輕置于淋巴細(xì)胞分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)分層，將第二層白膜細(xì)胞洗出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得PBMC單個(gè)核細(xì)胞備用。應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清)調(diào)整PBMC至一定濃度，取2 ml/孔至于六孔板中培養(yǎng)，加入CD3(5 mg/ml)及CD28單抗(5 mg/ml)培養(yǎng)刺激，向?qū)?yīng)孔中加入一定濃度的扁蒴藤素(即為實(shí)驗(yàn)組)，對(duì)照組加入等量的PBS溶液培養(yǎng)。將六孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 MTS檢測(cè)最佳藥物濃度 應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清)調(diào)整PBMC密度為1×105ml-1，取100 μl/孔鋪于96孔板中。將扁蒴藤素稀釋為不同的濃度，取100 μl加于96孔板中，使其終濃度為100、300、500、700、900 ng/ml，將孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培養(yǎng)3 h后，應(yīng)用光密度儀進(jìn)行光密度檢測(cè)，以O(shè)D值來(lái)反映細(xì)胞活性從而代表藥物最佳作用濃度。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 將細(xì)胞培養(yǎng)上清-80℃保存，批量檢測(cè)。IL-17A及TGF-β的含量采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 TH17細(xì)胞分析 取刺激后的PBMC，PBS反復(fù)洗滌，配置成100 μl的單細(xì)胞懸液，向上述懸液中加入抗CD4單抗10 μl，4℃避光染色30 min。經(jīng)PBS洗滌一次后，應(yīng)用透膜劑，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行，加入標(biāo)記的抗IL-17A單抗10 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌一次后，加入300 μl溶液，斡旋混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Treg細(xì)胞分析 取刺激后的PBMC，PBS反復(fù)洗滌，配置成100 μl的單細(xì)胞懸液，向上述懸液中加入抗CD4及CD25單抗10 μl，4℃避光染色30 min。經(jīng)PBS洗滌一次后，應(yīng)用透膜劑，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行，加入抗Foxp3單抗10 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌一次后，加入300 μl溶液，斡旋混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)所需器械均經(jīng)高壓去RNA酶處理，并經(jīng)0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實(shí)驗(yàn)均在冰塊上操作，降低溫度對(duì)結(jié)果的影響。取PBMC，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進(jìn)行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測(cè)定濃度及純度。應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real-time)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并應(yīng)用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進(jìn)行PCR體系的擴(kuò)增及反應(yīng)。其中，引物序列為：β-actin： 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′和5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′；Foxp3：5′-GCACAAGTGCTTTGTGCGAGT-3′和5′-TGTCTGTGGTTGCAGAC-GTTAT-3′；RORγT： 5′-GCAGCGCTCCAACATCTT-CT-3和5′-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3′ 試驗(yàn)時(shí)每個(gè)樣本和基因做2個(gè)相同的復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 扁蒴藤素藥物最佳作用濃度 PBMC由不同藥物濃度的扁蒴藤素刺激后，與未刺激組相比，當(dāng)藥物濃度為300、500、700 ng/ml時(shí)，細(xì)胞活性均顯著升高，且當(dāng)藥物濃度為500 ng/ml，細(xì)胞活性達(dá)到最大，因此選取500 ng/ml為藥物作用最佳濃度，見圖1。

圖1 不同藥物濃度PBMC活性比較(A值,Fig.1 Cell activity of PBMC with different concentrations of pristimerin(A ±s,n=20)Note: Vs control group,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2 各組對(duì)象體內(nèi)Th17/Treg亞群分析Fig.2

2.2 各組對(duì)象Th17/Treg亞群分析 給藥組與對(duì)照組相比，CD4+IL-17+T細(xì)胞(即Th17細(xì)胞)表達(dá)量顯著降低，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞(即Treg細(xì)胞)表達(dá)量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見圖2，表1。

2.3 各組對(duì)象細(xì)胞因子分泌 給藥組與對(duì)照組相比，IL-17含量顯著降低，TGF-β含量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4 各組對(duì)象轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) 給藥組與對(duì)照組相比，RORγT含量顯著降低，F(xiàn)oxp3含量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

GroupsCD4+IL?17+CD4+CD25+Foxp3+Experimentalgroup55±191)59±261)Controlgroup79±1637±21

Note：Vs control group,1)P<0.05.

GroupsIL?17TGF?βExperimentalgroup2317±371)3458±311)Controlgroup3679±352143±32

Note：Vs control group,1)P<0.05.

圖3 各組對(duì)象轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)±s,n=20)Fig.3 Expression of transcription factors in each n=20) Note: Vs control group,*.P<0.05.

3 討論

支氣管哮喘是由多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致的氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥，其病因和發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明確，其中Th1/Th2平衡失調(diào)及Th2細(xì)胞在機(jī)體占優(yōu)勢(shì)地位，被認(rèn)為是哮喘形成的關(guān)鍵性因素[4]。然而該機(jī)制并不能完全解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，Th17及Treg細(xì)胞的出現(xiàn)對(duì)發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充和完善。作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型免疫細(xì)胞，Th17及Treg細(xì)胞，具有獨(dú)立的分化和調(diào)節(jié)機(jī)制，且互相抑制，Th17的產(chǎn)生可抑制Treg的分化及發(fā)育[5,6]。兩者之間可通過多種途徑和機(jī)制互相影響，參與機(jī)體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。ROR-γT 作為 Th17 細(xì)胞的特異性核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì) Th17 細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能起決定性作用；Foxp3是Treg細(xì)胞的一個(gè)較為特異性的標(biāo)記，其可在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控Treg細(xì)胞分化與發(fā)育，兩者均是在轉(zhuǎn)錄因子層面反應(yīng)Th17及Treg細(xì)胞的表達(dá)。在機(jī)體正常狀態(tài)下，Th17及Treg細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡，以利于機(jī)體多種免疫反應(yīng)的適當(dāng)進(jìn)行。Th17/Treg失衡則導(dǎo)致炎性反應(yīng)過度，從而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明[7,8]，卵蛋白致敏的哮喘動(dòng)物模型體內(nèi)存在Th17/Treg失衡，并且哮喘患兒體內(nèi)也存在Th17/Treg失衡，提示Th17/Treg在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

扁蒴藤素作為一種天然單體化合物，傳統(tǒng)中醫(yī)曾把它應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘的治療，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，扁蒴藤素還具有多種其他特性[2,3]：①抗炎作用，其可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，可以降低腫瘤壞死因子、IL-6及一氧化氮合成酶的分泌；還可以顯著抑制腹腔白細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低腹膜通透性和一氧化氮的合成，在抗炎過程中起著重要作用。②抗類風(fēng)濕作用，扁蒴藤素可抑制關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)處骨的破壞，扁蒴藤素干預(yù)的關(guān)節(jié)炎模型可見多種炎性因子含量降低，及抑炎性因子IL-10分泌增加。③另有研究發(fā)現(xiàn)，扁蒴藤素可有效抑制人類巨細(xì)胞病毒對(duì)體外培養(yǎng)人胚胎成纖維細(xì)胞系的感染，具有較強(qiáng)的抗病毒作用。國(guó)內(nèi)已有研究顯示[3]，扁蒴藤素對(duì)過敏性哮喘模型的氣道炎癥具有保護(hù)作用，但其更深入的研究仍然缺如。

本研究可以看出，與對(duì)照組相比，給藥組Th17細(xì)胞表達(dá)量，IL-17及RORγT含量顯著降低，Treg細(xì)胞表達(dá)量，TGF-β及Foxp3含量顯著升高，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-17作為促炎性因子，可以改變基質(zhì)金屬蛋白酶的數(shù)量，引起嗜中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，Treg細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞來(lái)減緩疾病發(fā)生發(fā)展的作用，其作用可能與TGF-β密切相關(guān)[9,10]。以上結(jié)果均說(shuō)明，扁蒴藤素可顯著緩解Th17/Treg失衡，提示扁蒴藤素可能通過干預(yù)Th17/Treg平衡來(lái)影響哮喘的發(fā)生發(fā)展。這一研究與多數(shù)研究吻合[3,10]，均提示扁蒴藤素的抗炎功能，及Th17/Treg平衡在哮喘發(fā)病中的重要作用。

綜上所述，扁蒴藤素可較大程度緩解Th17/Treg失衡，提示該藥物可能通過影響免疫平衡來(lái)調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)生發(fā)展，為扁蒴藤素在臨床治療哮喘的應(yīng)用提供了理論支持。

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[收稿2016-06-16 修回2016-08-25]

(編輯 許四平)

Influence and significance of pristimerin therapy in patients with allergic asthma on Th17 and Treg

CHENNa，HANJie，GAOChun-Yan.

DepartmentofPediatricInternalMedicine,TangshanMaternalandChildHealthCareHospital，Tangshan063000,China

Objective:To investigate the effects of pristimerin therapy on the functions of Th17 and Treg cells in patients with allergic asthma,and expore the function of immune factors in therapy on allergic asthma. Methods: Extracted mononuclear cells in peripheral blood of patients with allergic asthma,and given pristimerin intervention in vitro.Then used fluorescence-activated cell sorting analysis to detect the contect of Th17 and Treg,enzyme-linked immunosorbent assay to detect cytokine production of IL-17 and TGF-β,and Real-time PCR to detect the contect of RORγT and Foxp3. Results: Compared with the control group,experimental group had reduced expression of CD4+IL-17+T cells (Th17 cells),and increased expression of CD4+CD25+Foxp3+T cells (Treg cells),which all had the statistical significance (P<0.05);displayed decreased level of IL-17,and increased level of TGF-β,which all had the statistical significance (P<0.05);had reduced expression of RORγT,and increased expression of Foxp3,which all had the statistical significance (P<0.05). Conclusion: Pristimerin therapy can remit the unbalance of Th17/Treg in vitro,hinting this drug may regulate allergic asthma by influencing immunologic balance,which offers the theoretical support for pristimerin in clinical application.

Th17；Treg；Pristimerin;Allergic asthma

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.011

陳 娜(1979年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事兒科方面的研究，E-mail：cccnnn_11@sina.com。

及指導(dǎo)教師：韓 潔(1970年-)，女，主任醫(yī)師，主要從事小兒血液系統(tǒng)疾病、小兒腫瘤疾病方面的研究。

R562.2+5

A

1000-484X(2017)01-0058-04

①唐山婦幼保健院檢驗(yàn)科,唐山063000。