王曉慶 田倩倩 李艷花 劉建春 劉春云 楊春彥 肖保國 尉杰忠 馬存根

(山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心,太原030024)

·中醫(yī)中藥與免疫·

補陽還五湯對EAE小鼠免疫調(diào)節(jié)的作用①

王曉慶 田倩倩 李艷花②劉建春 劉春云②楊春彥 肖保國③尉杰忠②馬存根

(山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心,太原030024)

目的：探討補陽還五湯對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的抗炎治療效果和免疫調(diào)節(jié)機制。方法：雌性C57BL/6小鼠采用MOG35-55多肽誘導建立EAE模型后，隨機分為生理鹽水組、補陽還五湯組，每組13只。造模的第3天給藥，生理鹽水組給予生理鹽水25 ml/kg灌胃，補陽還五湯組給予補陽還五湯生藥量50 g/kg灌胃，共治療25 d。每天記錄臨床癥狀評分和體重變化。HE染色檢測脊髓組織炎細胞浸潤，髓鞘染色觀察髓鞘脫失情況，免疫熒光技術(shù)檢測脾臟ROCKⅡ表達。流式細胞術(shù)檢測脾臟CD4+T細胞亞群變化。Western blot法檢測脊髓TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2、ROCKⅡ和腦ROCKⅡ的表達。結(jié)果：與生理鹽水組比較，補陽還五湯治療后明顯降低EAE小鼠神經(jīng)功能評分(P<0.001)，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎細胞浸潤(P<0.05)，減輕髓鞘脫失(P<0.05)，增加CD25+(P<0.05)、IL-10+(P<0.05)、TGF-β+(P<0.01)、IFN-γ+(P<0.05)CD4+T細胞的比例；抑制外周和中樞ROCKⅡ的表達(P<0.05)；減少脊髓TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2的表達(P<0.05)。結(jié)論：補陽還五湯可以通過抑制ROCKⅡ/TLR4/ NF-κB炎性通路和調(diào)節(jié)外周T細胞亞群比例發(fā)揮其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

補陽還五湯；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；ROCKⅡ/TLR4/NF-κB炎性通路

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis ,MS)是發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的CD4+T細胞介導的炎性自身免疫性疾病，以神經(jīng)髓鞘的脫失、多病灶的炎癥和軸突退化為病理特點。臨床上對MS的治療多采用免疫抑制劑或激素療法，病殘率較高，預后差，且價格高昂[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎( Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是國際公認的MS實驗動物模型[2]。在EAE發(fā)病情況下，CD4+T細胞通過血-腦脊液屏障進入CNS，經(jīng)抗原提呈激活CNS內(nèi)小膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1等致炎性細胞因子，形成炎性微環(huán)境，更多的CD4+T細胞和巨噬細胞進入CNS，放大炎性反應，最終導致神經(jīng)元的變性死亡[3]。中醫(yī)學通過對MS的研究探索認為，本虛標實是其基本特征，氣虛血瘀證為MS辨證論治中的常見證型，益氣活血能明顯改善臨床癥狀[4]。補陽還五湯(Buyang Huanwu Decoction，BYHWD)為清代著名醫(yī)家王清任經(jīng)典的補氣活血方劑，由生黃芪四兩、當歸尾二錢，赤芍一錢半，川芎一錢，地龍一錢，桃仁一錢，紅花一錢組成，具有補氣活血通絡之功效。研究顯示，補陽還五湯或組方中的單藥或有效成分具有抗炎抑炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和神經(jīng)保護等作用[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)激素合并BYHWD治療MS能有效緩解病情，減少激素撤減過程中復發(fā)的危險性，減少發(fā)作次數(shù)與發(fā)作程度[6]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)BYHWD對離體的致腦炎性T細胞有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，初步證實了其具有治療EAE的潛能[7]。本研究以EAE小鼠為研究對象，根據(jù)中醫(yī)理論，進一步觀察益氣活血法的代表方BYHWD對EAE的干預治療，積極發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢，為臨床應用益氣活血法，有效防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8～10周齡雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物實驗遵照山西大同大學生物醫(yī)學研究倫理審查委員會制定的實驗動物倫理原則執(zhí)行科學實驗)，實驗前小鼠在無病原菌動物房清潔級飼養(yǎng)(25℃左右)，自由飲食喂養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物及試劑 補陽還五湯方劑由黃芪120 g，當歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g 等7味藥組成，購自太原同仁堂藥店，由山西中醫(yī)學院段秀俊老師鑒定藥物合格。藥物按常規(guī)方法，用自來水煎煮2次，混勻后用雙層紗布過濾，收集濾液，文火煎煮濃縮成生藥2 g/ml，室溫冷卻后，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，臨用前充分搖勻，并且加熱至37℃。髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35～55多肽(Myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55peptide，MOG35-55)(純度98.39%，批號：9001)購自上海強耀生物科技有限公司；結(jié)核分枝桿菌(M.TUBERCULOSIS H37 RA)(批號：231141)購自美國DIFCO公司；完全弗氏佐劑(Complete Freund,s Adjuvant)(批號：60103)購自美國Sigma 公司；細胞流式相關(guān)抗體FITC Rat Anti-mouseCD4(批號：553729)、PE-TGF-β(批號：563143)購自美國BD公司；PE-CD25(批號：12-0251-82)、PE-IL-10(批號：12-7101-81)購自美國eBioscience公司；PE-IFN-γ(批號：505808)、PE-IL-17A(批號：506904)購自美國Biolegend 公司；Western blot 相關(guān)抗體Toll-like Receptor 4(批號：2219S)購自美國Cell Signaling 公司；Myd88(批號：ab2064)、p-NF-κB/p65(批號：ab86299)、COX-2(批號：ab62331)、ROCKⅡ(批號ab125025)購自英國abcam公司；bete-actin(批號：4970S)、GAPDH(批號：4970S)購自美國Cell Signaling 公司；二抗HEP-goat anti-mouse IgG(批號：E030110-1)、HEP-goat anti-rabbit IgG(批號：E030120-1)購自美國Pierce公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，BCA 試劑(A、 B)、蛋白標準配制液、RIPA 裂解液、PMSF(批號：P0010)購自中國Beyotime Biotechnology 公司。

1.1.3 儀器 凝膠成像分析儀(Bio-Rad，型號：Universal HoodⅡ)，熒光顯微鏡(Olympus，型號：BX51)，冰凍切片機(Leica，型號：CM1950)，流式細胞儀(BD Biosciences，型號：BD FACSCaliburTMFlow Cytometer 342976) 。

1.2 方法

1.2.1 分組 26只雌性C57BL/6小鼠，隨機分為生理鹽水組(Saline)和BYHWD組，每組13只。

1.2.2 EAE模型制備[8]用生理鹽水溶解配制MOG35-55,加用TB和完全弗氏佐劑,使油劑和水劑體積比為1∶1。用注射器反復推抽，形成抗原乳劑。生理鹽水組和BYHWD組小鼠按0.1 ml/只于背部皮下4個點分別注射抗原乳劑(MOG35-55濃度為250 μg/只,TB濃度為350 μg/只),在免疫當日和48 h后，各組每只小鼠分別腹腔注射PTX，每次300 ng。

1.2.3 BYHWD干預 免疫后第3天給藥，生理鹽水組給予生理鹽水25 ml/kg灌胃，補陽還五湯組給予補陽還五湯生藥量50 g/kg(生藥2 g)灌胃，每組取8只動物于發(fā)病高峰期(免疫后第17天)處死。每組剩余5只動物持續(xù)給藥至疾病緩解期(免疫后28 d)。

1.2.4 神經(jīng)功能評分 免疫后第1天起，每日對小鼠進行神經(jīng)功能評分。評分標準參考國際通用的5分法進行臨床癥狀評分，癥狀介于兩者評分之間者以±0.5分計[9]：①0分：無任何臨床癥狀；②1分：尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；③2分：一側(cè)后下肢無力，被動翻身后可以恢復；④3分：雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動；⑤4分：雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓；⑥5分：瀕死狀態(tài)或死亡。累積臨床評分[10]為每組每只小鼠自發(fā)病當日起(疾病評分≥1)至實驗結(jié)束評分的總和。累積疾病指數(shù)[11]為組內(nèi)每只小鼠每天臨床評分總和的均數(shù)。

1.2.5 標本采集 免疫后17 d，采用0.3%戊巴比妥鈉0.2 ml/只腹腔麻醉，各組4只取脾臟制備成單個核細胞懸液；用生理鹽水心臟灌注至肝臟發(fā)白，同時動物快速冰上解剖脊髓和腦組織，勻漿后提取蛋白，定量后采用Western blot技術(shù)檢測TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2、ROCKⅡ。各組其余4只動物用4%多聚甲醛灌流進行體內(nèi)組織固定，然后分離脊髓、腦和脾臟，OCT(Optimum cutting temperature)包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做厚度為10 μm的冰凍切片，進行髓鞘、HE染色及免疫熒光染色。

1.2.6 HE染色和髓鞘染色 取脊髓切片水中浸泡2 min，蘇木精染色4 min，快速水洗，0.5%鹽酸乙醇分化15 s，0.5%伊紅30 s，快速水洗，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。取脊髓切片于95%乙醇中浸泡15 min，浸于勒克司堅牢藍(Luxol fast blue，LFB)染液中，57℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去離子水浸洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰質(zhì)與白質(zhì)能夠清晰辨別，去離子水浸洗5 min，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.7 免疫熒光染色 脾臟的冰凍切片室溫干燥,經(jīng)PBS洗5 min×3次；1%BSA室溫封閉1 h后， 將抗小鼠Rock單克隆抗體按1∶500比例加入含BSA(10 g/L)、TritonX-100(3 ml/L)的稀釋液中，將含有抗體的稀釋液均勻滴在脾臟的冰凍切片上，置4 ℃過夜。次日PBS 洗5 min × 3 次，熒光素標記抗小鼠IgG(1∶1 000)標記，室溫孵育2 h,PBS洗5 min×3次,最后50%甘油封片熒光顯微鏡鏡檢。

1.2.8 Western blot 用組織裂解液在4℃條件下充分裂解脊髓和腦組織蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。制備蛋白上樣緩沖液樣品，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。電泳完畢后，將分離好的蛋白凝膠用濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維(PVDF)膜(穩(wěn)流220 mA，2 h)，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TLR4、Myd88、NF-κB、COX-2、ROCKⅡ抗體(1∶1 000)β-actin、GAPDH抗體(1∶10 000)，4℃過夜；次日洗滌后孵育相對應的HRP耦聯(lián)二抗(1∶10 000)室溫2 h。洗膜后，進行化學發(fā)光反應，用Bio-RAD凝膠成像分析儀檢測條帶，Image Lab(3.0) 軟件進行灰度值比較，并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.9 流式細胞術(shù)檢測 單個核細胞懸于50 μl 0.1% 皂甙/1% BSA-PBS破膜劑中，分別加1 μl流式抗體，包括FITC-CD4，PE-IL-10，PE-CD25，PE-IFN-γ和PE-TGF-β抗體，室溫避光20 min。PBS洗10 min，共2次，加500 μl PBS，流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測。

2 結(jié)果

2.1 BYHWD推遲EAE發(fā)病時間和減輕臨床癥狀 小鼠于免疫后第10天開始陸續(xù)發(fā)病，生理鹽水組小鼠發(fā)病率為100%。BYHWD組發(fā)病率為76%。嚴重發(fā)病死亡率為0。生理鹽水組的平均起病時間為(10.46±2.18) d、平均最高評分為(3.62 ± 0.46) 分、累計臨床評分為(36.58± 8.63)分、累積疾病指數(shù)為(1.13±0.86)；BYHWD治療組平均起病時間為(16.6±2.32) d、平均最高臨床評分為(1.19 ± 0.8)分，累計臨床評分為(3.96± 5.35)分、累積疾病指數(shù)為(0.25±0.28)；與生理鹽水組比較，BYHWD推遲了發(fā)病時間，降低了臨床評分(圖1A)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。兩組小鼠的體重變化結(jié)果顯示生理鹽水組隨著臨床癥狀加重,體重減輕明顯(圖1B)；BYHWD組在臨床癥狀改善的同時體重減輕較少(P<0.001)。2.2 BYHWD抑制脊髓炎性細胞浸潤 HE染色顯示，生理鹽水組小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)大量炎性細胞浸潤，以腰膨大處炎性細胞浸潤最為明顯，而BYHWD組明顯較少。用Image-Pro Plus 軟件統(tǒng)計，生理鹽水組白質(zhì)區(qū)占白質(zhì)比值為(9.95±5.36)%，BYHWD組為(2.25±1.29)%，兩組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

2.3 BYHWD可減少脊髓的髓鞘脫失面積 LFB染色顯示，生理鹽水組脊髓白質(zhì)出現(xiàn)大面積髓鞘脫失，而BYHWD組髓鞘脫失面積較少(圖3A) 。生理鹽水組髓鞘脫失與白質(zhì)面積比值為(27.69±8.44)%，BYHWD組為(8.28±3.02)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B)。

2.4 BYHWD抑制ROCKⅡ在脊髓、腦和脾臟中的表達 免疫熒光染色檢測脾臟中ROCKⅡ的表達，(圖4A)，同時用Western blot法檢測脊髓和腦中ROCKⅡ的表達(圖4B)，結(jié)果顯示，生理鹽水組ROCKⅡ在脾臟、腦和脊髓中高表達，BYHWD治療后，抑制了ROCKⅡ的表達(P<0.05)。

圖1 兩組臨床評分和體重變化的比較Fig.1 Clinical scoring and weight change of two groupsNote: *.P<0.05；**.P<0.01;***.P<0.001 vs the saline group.

圖2 免疫后第17天脊髓HE染色Fig.2 HE staining of spinal cord at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

圖3 免疫后第17天脊髓LFB染色Fig.3 LFB staining of spinal cord at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

2.5 BYHWD調(diào)節(jié)單個核細胞的T細胞表達 無菌操作篩選脾臟單個核細胞，通過流式細胞術(shù)觀察BYHWD對T細胞亞型變化的影響。結(jié)果顯示：BYHWD 可明顯增強CD25+、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+的CD4+T細胞的表達(P<0.05，圖5)。

圖4 免疫后第17天脾臟、脊髓和腦中ROCKⅡ的表達Fig.4 Expression of ROCKⅡ in spleen，spinal cord and brain at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

圖5 BYHWD調(diào)節(jié)CD4+T細胞比例Fig.5 BYHWD regulated polarization of CD4+ T cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01 vs the saline group.

圖6 免疫后第17天BYHWD對炎性通路的影響Fig.6 Effect of inflammatory pathway of BYHWD at day 17 after immunizationNote: *.P<0.05 vs the saline group.

2.6 BYHWD抑制炎性信號通路的激活 Western blot法檢測BYHWD對TLR4炎性信號通路的影響。結(jié)果顯示，生理鹽水組TLR4、Myd88、 p-NF-κB/p65、COX-2均為高表達，而BYHWD組脊髓中TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2表達得到明顯抑制(P<0.05，圖6)。結(jié)果表明，BYHWD可以抑制TLR4信號通路的激活發(fā)揮抗炎作用。

3 討論

多數(shù)研究已證實，MS/EAE的發(fā)病是一種由T細胞介導的、起源于外周的免疫應答，繼而有活化的外周免疫細胞侵入CNS并在局部擴增，在CNS促發(fā)局部炎癥反應，引發(fā)相應的臨床癥狀[12]。Rho/ROCK是機體普遍存在的一條信號轉(zhuǎn)導通路，伴隨多種炎癥介質(zhì)和細胞因子受體后耦聯(lián)的活化而激活，通過激酶級聯(lián)反應介導和調(diào)控細胞的增殖、分化和移行等，是細胞行為改變最直接的信號分子。近年來的研究顯示，ROCK信號通路及炎性信號TLR4/ NF-κB在MS/EAE的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[13]。ROCK激活是T淋巴細胞活化和遷移所必需的條件，抑制ROCK通路能更好地抑制外周免疫細胞活化和增殖，有效阻止向CNS的移行。抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導途徑或MyD88基因敲除阻斷TLR4的MyD88依賴信號轉(zhuǎn)導，對EAE發(fā)生均有一定抑制作用[14，15]。本研究用益氣活血的代表方劑BYHWD在EAE早期(免疫后第3天)給予干預治療，取發(fā)病高峰期(免疫后第17天)的組織進行研究，結(jié)果證實BYHWD使EAE的發(fā)病率明顯下降，平均高峰期臨床癥狀評分下降，有效緩解了EAE的發(fā)病和臨床癥狀。病理結(jié)果也表明，BYHWD明顯減輕EAE外周炎性細胞向CNS的浸潤，明顯降低外周和中樞ROCKⅡ的表達，抑制脊髓中TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2表達。由此推測BYHWD通過抑制ROCKⅡ在中樞表達，抑制TLR4、MyD88的表達，從而抑制MyD88信號轉(zhuǎn)導途徑對NF-κB激活，從而發(fā)揮對EAE的治療作用。

免疫細胞主要有CD4+Th1、Th2細胞和調(diào)節(jié)性T細胞等[16]。CD4+Th1細胞被認為是致炎性細胞，而Th2細胞和調(diào)節(jié)性T細胞具有抗炎作用。在EAE病理情況下，免疫系統(tǒng)的多種成分發(fā)生了復雜的變化。體內(nèi)實驗證實，通過抑制EAE小鼠炎癥反應，抑制CD4+Th1細胞釋放IFN-γ炎性因子，促進Th2細胞釋放免疫抑制因子，改變Th1細胞和Th2細胞的比例，可改善EAE小鼠的臨床癥狀，達到很好的治療效果[17，18]。本實驗的流式細胞術(shù)檢測顯示BYHWD能顯著增加IL-10+、TGF-β+和CD25+的CD4+T細胞的比例。

一般認為IFN-γ是炎性細胞因子，可以刺激小膠質(zhì)細胞激活，產(chǎn)生NO和其他炎性細胞因子[19]。本實驗中BYHWD可增加脾臟單個核細胞IFN-γ+CD4+T 細胞的百分比，提示BYHWD和其他免疫抑制劑之間可能存在不同的作用機制。IFN-γ對EAE也可能具有免疫保護作用。有研究顯示，IFN-γ 缺陷小鼠，Th17 細胞的數(shù)量和細胞分泌會增加，體外給予 IFN-γ 可以使 EAE 小鼠體內(nèi) Th17 細胞的數(shù)量降低，并且抑制其功能[20]。

MS/EAE病因和發(fā)病機制復雜，治療仍缺乏特異性和有效性。中醫(yī)藥以多靶點、多途徑，整體調(diào)節(jié)、協(xié)同作用強、毒副作用小的特點在延緩MS疾病進程方面有著西藥不可比擬的優(yōu)勢。祖國醫(yī)學通過研究探索認為，MS/EAE歸屬于中醫(yī)的“痿證”、“眩暈”、“視譫昏渺”等范疇。病機特點為氣血虧虛致筋脈失養(yǎng)，或兼外邪乘虛侵襲，而成痰、濕、瘀，阻滯經(jīng)絡，屬本虛標實證。針對病機，治療法則應以補氣、活血、祛痰、濕、瘀、通絡為主。補陽還五湯出自清代著名醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯》,原書稱此湯專治“因虛致瘀”之證，因氣血虧虛、經(jīng)絡瘀阻而致諸癥。 方中重用生黃芪為君藥，大補元氣，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷正，并助諸藥之力；當歸尾為臣藥，長于活血補血，且化淤而不傷血；川芎、赤芍、紅花，桃仁均為佐藥，助當歸尾活血祛瘀，地龍則有通經(jīng)活絡之功。諸藥性味平緩、補而不滯、祛邪不傷正，使氣虛得補，氣旺則血行，瘀祛則絡通，血脈通利。

本實驗研究表明，BYHWD以50g/kg為有效劑量，可緩解EAE臨床癥狀、減少髓鞘脫失，抑制炎細胞浸潤、增加CD25+、IL-10+、TGFβ+、IFN-γ+的CD4+T細胞的比例；抑制ROCKⅡ的表達；減少脊髓TLR4、Myd88、p-NF-κB/p65、COX-2的表達。這些作用可能是通過抑制ROCKⅡ/TLR4/ NF-κB炎性通路和調(diào)節(jié)外周CD4+T細胞亞群比例發(fā)揮其抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用，從而減輕EAE的發(fā)病程度。

由此可見，補陽還五湯可以通過補氣、活血、祛瘀、通絡，從抗炎抑炎、免疫調(diào)節(jié)等多重途徑對MS進行干預，有望為臨床治療MS提供一種安全、有效且不良反應少的可靠療法。補陽還五湯所顯示的益氣活血法可作為MS“標本兼治”的通用性中醫(yī)治則之一。

[1] Solchaga LA,Zale EA.Prostaglandin E2: a putative potency indicator of the immunosuppressive activity of human mesenchymal stem cells[J].Am J Stem Cells,2012,1:138.

[2] Bebo BF Jr,Schuster JC,Vandenbark AA,etal.Gender differences in experimental autoimmune encephalomyelitis develop during the induction of the immune response to encephalitogenic peptides[J].J Neurosci Res,1998，52:420-426.

[3] 于婧文,張 輝,宋國斌,等.口服法舒地爾治療EAE對巨噬細胞、T細胞及TLR/NF-κB通路的作用研究[J].中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志,2016,23(3):172-176.

[4] 李 青，詹 青，琚 堅.詹文濤教授從虛損論治多發(fā)性硬化經(jīng)驗[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2008,29(11):1-2.

[5] 劉 斌，費洪新，樸成玉，等．補陽還五湯與神經(jīng)組織關(guān)系的研究進展[J].中醫(yī)藥信息，2014，31(5):136-140.

[6] 曾紅梅,張 明,張 剛,等.激素合并補陽還五湯加減療多發(fā)性硬化臨床療效觀察[J].實用臨床醫(yī)學,2009,10(10):9-14.

[7] 楊春彥,李艷花,辛延樂,等.補陽還五湯對致腦炎性細胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].山西中醫(yī)學院學報,2015,16(6):4-7.

[8] Lou ZY,Chen C,He Q,etal.Targeting CB (2) receptor as a neuro inflammatory modulator in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Mol lmmunol,2011，49(3):453-461.

[9] Urban JL,Kumar V,Kono DH,etal.Restricted use of T cell receptor V genes in murine autoimmune encephalomyelitis raises possibilities for antibody therapy[J].Cell,1988,54(4):577-592.

[10] Fagone P,Mangano K,Quattrocchi C,etal.Prevention of clinical and histological signs of proteolipid protein (PLP)-induced experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice by the water-soluble carbon monoxide-releasing molecule(CORM)-A1[J].Clin Exp Immunol,2011,163(3):368-374.

[11] Kafami L,Raza M,Razavi A,etal.Intermittent feeding attenuates clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL6 mice[J].Avicenna J Med Biotechnol,2010,2(1):47-52.

[12] Kawakami N,Bartholomaus I.An autoimmunity odyssey: how auto-reactive T cells infiltrate into the CNS[J].Immunol Rev,2012,248(1):140-155.

[13] Racke MK,Drew PD.Toll-like receptors in multiple sclerosis[J].Curr Top Mcrobiol Immunol,2009，336:155-168.

[14] Andersson A,Covacu R,Sunnemark D,etal.Pivotal advance : HMGB1 expression in active lesions of human and experimental multiple sclerosis[J].J Leukoc Biol,2008,84(5):1248-1255.

[15] Marta M,Andersson A,Isaksson M,etal.Unexpected regulatory roles of TLR4 and TLR9 in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Eur J Immunol,2008,38(2):565-575.

[16] Mayo L,Quintana FJ,Weiner HL.The innate immune system in demyelinating disease[J].Immunol Rev,2012,248(1):170-187.

[17] Hou SW,Liu CY，Li YH,etal.Fasudil ameliorates disease progression in experimental autoimmune encephalomyelitis,acting possibly through anti-inflammatory effect[J].CNS Neurosci Ther,2012,18: 909-917.

[18] 張 輝，張海飛，李艷花，等.口服鹽酸法舒地爾治療小鼠有效性初探[J].中國病理生理雜志,2013,29(11):2060-2065.

[19] 章培軍,郭敏芳,邢雁霞,等.黃芪糖蛋白對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].細胞與分子免疫學雜志,2016,32(1):54-58.

[20] Berghmans N，Nuyts A，Uyttenhove C，etal.Interferon-γ or chest rates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Interferon Cytokine Res,2011,31(7):5755-5787.

[收稿2016-06-14 修回2016-09-21]

(編輯 許四平)

Immunoregulatory effect of BuyangHuanwu Decoction on experimental autoimmune encephalomyelitis mice

WANGXiao-Qing,TIANQian-Qian,LIYan-Hua,LIUJian-Chun,LIUChun-Yun,YANGChun-Yan,XIAOBao-Guo,YUJie-Zhong,MACun-Gen.

"2011"CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，China

Objective:To explore the anti-inflammatory therapeutic effect and possible immunoregulatory mechanism of Buyang Huanwu Decoction (BYHWD) on the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).Methods: Female C57BL/6 mice were immunized subcutaneously with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides (MOG35-55),and randomly divided into saline group,BYHWD group,with 13 mice in each group.At the 3th day,25 ml/kg of saline was orally given to each mouse of saline group,50 g/kg ig of crude BYHWD was orally given to each mouse in BYHWD group for 25 days.Clinical score and body mass were recorded every day.Inflammatory cell infiltrations of spinal cord were observed by HE staining Myelin staining observes the demyelination situation.And the expression of ROCKⅡ in spleen was detected by immunofluorescence staining.The subtypes of CD4+T cells were analyzed by flow cytometry.Western blot was used to detect the expression of TLR4，Myd88，NF-κB，COX-2，ROCKⅡ in spinal cord and ROCKⅡ in brain.Results: The neurologicalscore significantly decreased in EAE mouse of BYHWD group compared with the saline group(P<0.001) .BYHWD inhibited the inflammatory cell infiltration and demyelination in the nervous centralis(P<0.05).The treatment of BYHWD effectively reduced the increased the proportion of CD25+(P<0.05)，IL-10+(P<0.05)，TGF-β+(P<0.01)，IFN-γ+(P<0.05)CD4+T cells ,and inhibited the expression of peripheral and central ROCKⅡ(P<0.05) ;BYHWD reduced the expression of TLR4,MyD88,NF-κB,COX-2 in spinal cord (P<0.05).Conclusion: BYHWD can exert anti-inflammatory and immune regulation effect by the inhibition of ROCKⅡ/TLR4/ NF-κB signaling pathway and regulation of the proportion of peripheral T cell subsets.

Buyang Huanwu Decoction;Experimental autoimmune encephalomyelitis;ROCKⅡ/TLR4/NF-κB signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.010

①本文為國家自然科學基金2014年面上項目(81473577)、山西省自然科學基金(2013011052-4)、山西省國際科技合作項目(2013081058)、山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)和山西中醫(yī)學院“2011”培育計劃項目(2011PY-1)。

王曉慶(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病研究，E-mail:1109957988@qq.com。

及指導教師：尉杰忠(1975年-)，男，在讀博士，副教授，碩士生導師，主要從事神經(jīng)免疫學研究，E-mail:sxdtyjz@qq.com。 馬存根(1960年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事神經(jīng)免疫學研究， E-mail:macungen2001@163.com。

R285

A

1000-484X(2017)01-0052-06

②山西大同大學腦科學研究所，大同037009。

③復旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所，上海200025。