張 展 李?lèi)?ài)萍 王媛媛 宋婉玉 徐 娜 劉 慧 周 潔

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

MicroRNA-155通過(guò)調(diào)節(jié)CXCR4/PI3K/AKT途徑影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與遷移

張 展 李?lèi)?ài)萍 王媛媛 宋婉玉 徐 娜 劉 慧 周 潔

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

目的：以人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)合該細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化情況，研究轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor之后CXCR4的表達(dá)變化及其對(duì)下游PI3K/AKT信號(hào)通路的影響作用，從而探討miR-155參與子癇前期發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。方法：設(shè)計(jì)miR-155 mimics和miR-155 inhibitor，對(duì)JEG-3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲和遷移能力的變化；利用Real-time PCR檢測(cè)CXCR4 mRNA的表達(dá)；利用Western blot 檢測(cè)CXCR4及下游p-AKT蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-155 mimics轉(zhuǎn)染組CXCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.589±0.096)明顯低于空白對(duì)照組(1.503±0.090)和陰性對(duì)照組(1.146±0.153)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染組CXCR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.739±0.083)與兩組對(duì)照組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示miR-155 mimics轉(zhuǎn)染組CXCR4蛋白和下游p-AKT蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染組CXCR4和p-AKT蛋白水平則升高，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組(63.46±2.37)和陰性對(duì)照組(49.29±5.81)侵襲細(xì)胞數(shù)相比，miR-155 mimics轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)(22.89±9.42)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)(81.50±11.25)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后，JEG-3細(xì)胞相對(duì)遷移距離(0.159±0.058)低于空白對(duì)照組(1.080±0.045)和陰性對(duì)照組(0.823±0.201)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染組，JEG-3細(xì)胞相對(duì)遷移距離(1.640±0.078)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：miR-155可能通過(guò)抑制CXCR4的表達(dá)進(jìn)而抑制其下游PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲及遷移能力，最終導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

miR-155；CXCR4；PI3K/AKT；滋養(yǎng)細(xì)胞；子癇前期

子癇前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特有的一種疾病，也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒發(fā)病及死亡的主要原因之一。迄今為止，PE的發(fā)病機(jī)理尚未清楚。MicroRNA(miRNA)是一組長(zhǎng)18～23個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小RNA分子，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)子癇前期發(fā)生時(shí)，一些miRNAs可出現(xiàn)異常表達(dá)，miR-155是其中之一[1-3]。miR-155的異常表達(dá)可能與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移等功能紊亂的發(fā)生密切相關(guān)[4]，但具體的分子機(jī)制仍然需要更多的探索和研究。CXCR4是G蛋白偶聯(lián)受體，在整個(gè)孕期絨毛組織中均有表達(dá)。CXCR4與其配體結(jié)合之后，可激活下游PI3K/AKT信號(hào)通路，影響細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，從而調(diào)控妊娠早期人絨毛組織中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力[5，6]。在子癇前期中miR-155與CXCR4的相關(guān)性及如何調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的具體機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。

在本次研究中，我們以人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系是人類(lèi)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系的衍生物，其生物學(xué)行為和特性與滋養(yǎng)細(xì)胞極為相似，很多學(xué)者用該細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的機(jī)制調(diào)控。已有很多研究表明JEG-3細(xì)胞能特異性表達(dá)CXCR4，因此，本實(shí)驗(yàn)將此細(xì)胞系作為研究滋養(yǎng)細(xì)胞功能的細(xì)胞模型，分別將miR-155 mimics和miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)上調(diào)及下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)水平，檢測(cè)CXCR4及下游p-AKT蛋白的表達(dá)變化，探討miR-155是否可以通過(guò)抑制CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，從而探究子癇前期的發(fā)病機(jī)制，并為臨床子癇前期的靶點(diǎn)治療提供有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)。

1.1.2 miR-155相關(guān)產(chǎn)品合成 miR-155 mimics、Negative Control(NC)、miR-155 inhibitor、miR-155 inhibitor Negative Control(miR-155 inhibitor NC)均由中國(guó)上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。miR-155 mimics序列(5′ to 3′)為：sense：UUAUGCUAAUCGUGAUA-GGGGU；antisense：CCCUAUCACGAUUAGCAUU-AAUU。miR-155 inhibitor序列(5′ to 3′)為：ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA。NC序列(5′ to 3′)為：sense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；antise-nse：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。miR-155 inhi-bitor NC(5′ to 3′)為：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。

1.1.3 主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)，Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco)胎牛血清FBS(杭州四季青)，胰酶(Geneview)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料(Toyobo)，Real-time PCR System，Transwell Chamber(BD Biosciences)，蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)，蛋白marker分子標(biāo)記(Geneview)，兔抗人CXCR4單克隆抗體、兔抗人p-AKT單克隆抗體、鼠抗人β-acitn單克隆抗體(Abcam)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) JEG-3細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，用RPMI1640(含10%FBS、100 U/ml 青霉素及100 μg/ml鏈霉素)完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行一次細(xì)胞傳代(0.25%胰蛋白酶-EDTA消化)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于六孔板，調(diào)整細(xì)胞密度每孔1×105個(gè)細(xì)胞，按照凍存批次將JEG-3細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)分組。細(xì)胞匯合度為60%～70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為miR-155 mimics組、NC組、miR-155 inhibitor組、miR-155 inhibitor NC組、空白對(duì)照組。miR-155 mimics終濃度為50 nmol/L；miR-155 inhibitor 終濃度為100 nmol/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，按Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)定各組RNA的濃度及純度。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl。反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列：CXCR4-F為ACTACACCGAG-GAAATGGGCT；CXCR4-R為CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA；β-actin-F為GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG；β-actin-R為CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，10 min，進(jìn)行預(yù)變性；95℃，15 s；60℃，1 min(共40個(gè)循環(huán))，72℃延伸10 min。以目的基因的相對(duì)表達(dá)量作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算CXCR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 試驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌3次后加入50 μl蛋白裂解液(含有1∶100的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，得到蛋白質(zhì)溶液，BCA法測(cè)定濃度。蛋白上樣量為80 μg，配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，CXCR4采用5% 脫脂奶粉封閉，p-AKT采用5% BSA封閉，室溫封閉2 h后棄去封閉液，加入一抗CXCR4(1∶500稀釋)、p-AKT(1∶5 000稀釋)及內(nèi)參β-acitn(1∶5 000稀釋)抗體，4℃孵育過(guò)夜。加入二抗(1∶1 000稀釋)于室溫下避光孵育2 h，ODYSSEY Clx檢測(cè)與成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并拍照。觀察5組中蛋白條帶顏色的深淺程度并比較。

1.2.5 Transwell 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 在接種細(xì)胞之前，需要對(duì)Transwell小室和24孔板進(jìn)行平衡：分別在上室加100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加600 μl FBS，置于37℃，5%CO2環(huán)境下過(guò)夜。收集轉(zhuǎn)染后經(jīng)過(guò)24 h饑餓處理的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于上室，在37℃，5%環(huán)境下培養(yǎng)36 h，隨后將上室細(xì)胞擦除，將小室膜下室側(cè)的細(xì)胞甲醇固定，吉姆薩染色后進(jìn)行拍照，高倍鏡下取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值，每組重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。將六孔板內(nèi)培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基使細(xì)胞饑餓12 h后，用200 μl移液器吸頭沿培養(yǎng)板呈“一”字形劃痕，形成中央空白區(qū)，PBS洗滌1次，并在顯微鏡下拍照記錄劃痕區(qū)域(0 h)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察并拍照(24 h)。使用Image J軟件分析細(xì)胞的相對(duì)遷移距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor對(duì)CXCR4 mRNA表達(dá)的影響 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)表明：與 NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 mimics轉(zhuǎn)染組CXCR4 mRNA 在JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖1、表1)；與miR-155 inhibitor NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染組CXCR4 mRNA 在JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高(見(jiàn)圖2、表2)。

2.2 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor對(duì)CXCR4 及p-AKT蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 mimics轉(zhuǎn)染組CXCR4 及p-AKT蛋白在JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)均明顯降低(見(jiàn)圖3)；與miR-155 inhibitor NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 inhibitor轉(zhuǎn)染組CXCR4 及p-AKT蛋白在JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)均明顯升高(見(jiàn)圖4)。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 對(duì)JEG-3細(xì)胞中CXCR4 mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effect on expression of CXCR4 mRNA of JEG-3 cells after transfection of miR-155 mimicsNote: Compared with blank control group,**.P<0.01;compared with NC group,*.P<0.05.

GroupsnCXCR4mRNABlankcontrolgroup121503±0090NCgroup121146±0153miR?155mimicsgroup120589±00961)2)F3659P0035

Note：Compared with blank control group,1)P<0.01;compared with NC group,2)P<0.05.

圖2 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 對(duì)JEG-3細(xì)胞中CXCR4 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect on expression of CXCR4 mRNA of JEG-3 cells after transfection of miR-155 inhibitorNote: Compared with blank control group,*.P<0.05;compared with inhibitor NC group,**.P<0.01.

2.3 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明：與 NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，侵襲力降低(見(jiàn)表3、圖5)；與miR-155 inhibitor NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 inhibitor組穿膜細(xì)胞明顯增加，侵襲力增加(見(jiàn)表4、圖5)。

GroupsnCXCR4mRNABlankcontrolgroup121498±0090InhibitorNCgroup120880±0245miR?155inhibitorgroup121739±00831)2)F2834P0027

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;compared with inhibitor NC group,2)P<0.01.

圖3 轉(zhuǎn)染miR-155 mimics對(duì)JEG-3細(xì)胞內(nèi)CXCR4及p-AKT蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect on expression of CXCR4 and p-AKT protein of JEG-3 cellls after transfection of miR-155 mimicsNote: 1.Blank control group;2.NC group;3.miR-155 mimics group.

圖4 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor對(duì)JEG-3細(xì)胞內(nèi)CXCR4及p-AKT蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect on expression of CXCR4 and p-AKT protein of JEG-3 cells after transfection of miR-155 inhibitorNote: 1.Blank control group;2.miR-155 inhibitor NC group;3.miR-155 inhibitor group.

2.4 miR-155 mimics和miR-155 inhibitor對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)表明：24 h之后，與 NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 mimics組JEG-3細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(見(jiàn)圖6、表5)；與miR-155 inhibitor NC組及空白對(duì)照組相比，miR-155 inhibitor組細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖6、表6)。

GroupsnThenumberofinvasioncellsBlankcontrolgroup86346±237NCgroup84929±581miR?155mimicsgroup82289±9421)F12737P0000

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

GroupsnThenumberofinvasioncellsBlankcontrolgroup86346±237InhibitorNCgroup84890±559miR?155inhibitorgroup88150±11251)F294P0027

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

GroupsnRelativemigrationdistanceBlankcontrolgroup51080±0045NCgroup50823±0201miR?155mimicsgroup50159±00581)F29600P0017

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

圖5 轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor對(duì)JEG-3細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)Fig.5 Effect on ability of invasion of JEG-3 cells after transfection of miR-155 mimics and miR-155 inhibitor(×400)

圖6 轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor對(duì)JEG-3細(xì)胞遷移能力的影響(×200)Fig.6 Effect on ability of migration of JEG-3 cells after transfection of miR-155 mimics and miR-155 inhibitor(×200)

GroupsnRelativemigrationdistanceBlankcontrolgroup51079±0045InhibitorNCgroup50724±0267miR?155inhibitorgroup51640±00781)F16103P0024

Note：Compared with blank control group and NC group,1)P<0.05.

3 討論

子癇前期是正常血壓婦女在妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等臨床表現(xiàn)的一種特發(fā)性高血壓綜合征，可引起嚴(yán)重的母胎并發(fā)癥，也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一[7]。目前，歐美國(guó)家子癇前期發(fā)病率較低，大約為2%～5%，而發(fā)展中國(guó)家子癇前期卻更常見(jiàn)，發(fā)病率約為10%，亞洲和非洲子癇前期占孕產(chǎn)婦死亡率的9%[8]。每年全世界1 000萬(wàn)個(gè)孕產(chǎn)婦中由于妊娠期高血壓，特別是子癇前期，造成76 000例孕產(chǎn)婦死亡和500 000個(gè)胎兒或新生兒的死亡[9]。美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)也曾將子癇前期納入心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素中，并建議了解有子癇前期病史的患者并改善其生活方式[10,11]。但PE的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，而且臨床上尚缺乏有效的治療手段，很多情況下不得不提前終止妊娠，造成妊娠失敗，許多流行病學(xué)研究也證明妊娠期子癇前期的發(fā)生可能對(duì)后代產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的不良后果[12,13]。PE的發(fā)病機(jī)制可涉及胎盤(pán)缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、與PE相關(guān)的信號(hào)通路的改變、滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)異常、母胎界面免疫異常、胎盤(pán)的局部凝血和抗凝血機(jī)制失衡以及miRNA的表達(dá)譜異常等多種因素[14,15]。

自1993年，Lee等[16]在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)miRNA至今，已有超過(guò)2 000個(gè)miRNAs被發(fā)現(xiàn)，且經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA可能調(diào)節(jié)人類(lèi)基因組中60%的編碼蛋白質(zhì)的基因[17]。miRNA在炎癥和腫瘤方面的研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，而與子癇相關(guān)的miRNA的研究才剛剛開(kāi)始。miRNA可通過(guò)與mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′-untranslated region，3′UTR)進(jìn)行完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，起轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，在細(xì)胞的的分化發(fā)育、增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。miR-155基因，由BIC基因編碼，位于人類(lèi)21q21.3號(hào)染色體，是一種與炎癥、腫瘤和免疫調(diào)節(jié)[19]密切相關(guān)的miRNA。目前很多研究都有發(fā)現(xiàn)miR-155在PE胎盤(pán)中有顯著的差異性表達(dá)，尤其在重度PE胎盤(pán)中，miR-155呈高表達(dá)。還有研究顯示，在胃癌、乳腺癌等[20，21]疾病中，miR-155可靶向調(diào)控CXCR4的表達(dá)，影響癌細(xì)胞的增殖和血管生成，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性。因此，miR-155可能是通過(guò)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，抑制下游AKT蛋白的磷酸化，影響PI3K/AKT途徑的活化，使滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與遷移能力下降。

CXCR4，又稱(chēng)趨化因子受體4，位于人類(lèi)2q21號(hào)染色體，由352個(gè)氨基酸組成?？杀磉_(dá)于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上，包括滋養(yǎng)細(xì)胞，且在整個(gè)孕期絨毛組織中均有表達(dá)[22]。本研究的RT-PCR和Western blot結(jié)果也證明在分別轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor之后，人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞株中CXCR4在mRNA和蛋白水平均發(fā)生了顯著的變化。其中，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics之后，JEG-3細(xì)胞中CXCR4 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均明顯下降；反之，轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后，CXCR4 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高。因此，推測(cè)在子癇前期發(fā)生過(guò)程中，miR-155可能通過(guò)抑制CXCR4的表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的功能。

同時(shí)，本研究還通過(guò)Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后JEG-3細(xì)胞的侵襲和遷移能力的變化。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics組JEG-3細(xì)胞侵襲及遷移能力均下降，而轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor組JEG-3細(xì)胞侵襲及遷移能力則明顯升高。因此，從細(xì)胞水平證明miR-155可能通過(guò)CXCR4調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

本研究還檢測(cè)了在轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞后，CXCR4下游關(guān)鍵因子AKT的磷酸化水平，證明miR-155是否可通過(guò)抑制CXCR4影響下游PI3K/AKT途徑的活化。Western blot結(jié)果顯示p-AKT蛋白的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染miR-155 mimics之后發(fā)生顯著下降，而在轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor之后則明顯升高。在研究乳腺癌時(shí)，Liang等通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-155抑制CXCR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力均下降，并進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)AKT蛋白的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)miR-155可能是通過(guò)CXCR4/SDF-1/AKT途徑發(fā)揮其抑制作用。結(jié)合Liang等[23]的研究，本次研究認(rèn)為miR-155可能通過(guò)下調(diào)CXCR4的表達(dá)降低下游AKT蛋白的磷酸化水平，從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移等生物學(xué)功能，在臨床治療子癇前期時(shí)也可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平闡明miR-155參與子癇前期發(fā)病機(jī)制的一個(gè)可能的分子機(jī)制，即miR-155可能通過(guò)抑制CXCR4/PI3K/AKT信號(hào)通路影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移等生物學(xué)功能，進(jìn)而促進(jìn)子癇前期發(fā)生、發(fā)展，也為臨床子癇前期的治療提供了一個(gè)可行的研究思路。

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[收稿2016-07-09 修回2016-09-07]

(編輯 張曉舟)

MicroRNA-155 induced invasion and migration of human trophoblast cells via CXCR4/PI3K/AKT signaling pathway

ZHANGZhan,LIAi-Ping,WANGYuan-Yuan,SONGWan-Yu,XUNa,LIUHui,ZHOUJie.

TheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

Objective:To investigate the effect on the CXCR4/PI3K/AKT pathway after the transfection of miR-155 mimics and miR-155 inhibitor combined with the research on the ability of invasion and migration of human chorionic JEG-3 trophoblast cells.Methods: Chemically synthesized miR-155 mimics and miR-155 inhibitor were transfected into JEG-3 cells.The effect on the ability of invasion and migration were analyzed by Transwell migration assay and Wound healing assay.The expression of CXCR4 mRNA was detected by Real-time PCR.The expression of CXCR4 and p-AKT protein were detected by Western blot.Results: Transfection with miR-155 mimics significantly down-regulated the expression of CXCR4 as compared with the control group(P<0.05);JEG-3 cells transfected miR-155 mimics had lower levels of migration and invasion capacity than cells in the control group(P<0.05).However,transfection with miR-155 inhibitor significantly up-regulated the expression of CXCR4 as compared with the control group(P<0.05);JEG-3 cells transfected miR-155 inhibitor had higher levels of migration and invasion capacity than cells in the control group(P<0.05).Addition,the expression of p-AKT protein of JEG-3 cells was down-regulated after transfected miR-155 mimics,and the expression of p-AKT protein of JEG-3 cells was up-regulated after transfected miR-155 inhibitor.Conclusion: miR-155 may inhibits the invasion and migration of trophoblast cells by regulating CXCR4/PI3K/AKT pathway contributing to the development of preeclampsia.

miR-155;CXCR4;PI3K/AKT;Trophoblast cells;Preeclampsia

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.008

張 展(1959年- )，女，博士，教授，主要從事生殖免疫學(xué)方面研究，同時(shí)供職于商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，E-mail:zhangzhanzdsfy@126.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)01-0041-07