石玉榮 吳軍錄 權(quán)文強(qiáng) 李 冬

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，蚌埠233000)

IL-1β促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究①

石玉榮 吳軍錄②權(quán)文強(qiáng)③李 冬②③

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，蚌埠233000)

目的：研究IL-1β在巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。方法：采用Transwell?插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿共培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H520細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。BrdU-ELISA法檢測巨噬細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的增殖能力。采用Real-time PCR法檢測巨噬細(xì)胞和A549、NCI-H520細(xì)胞中IL-1β mRNA的表達(dá)。應(yīng)用IL-1β的中和抗體抑制IL-1β的活性，觀察IL-1β在巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖中的作用。利用Western blot法檢測肺癌細(xì)胞中自噬標(biāo)志物Beclin 1的表達(dá)。結(jié)果：BrdU-ELISA檢測結(jié)果：A549細(xì)胞與巨噬細(xì)胞以1∶0.5的比例共培養(yǎng)，A549細(xì)胞的OD值從(0.41±0.06)增加到(1.13±0.10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且A549細(xì)胞的OD值隨共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞比例的增加而升高(P<0.05)。NCI-H520細(xì)胞與不同濃度的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，NCI-H520細(xì)胞的OD值變化趨勢與A549細(xì)胞相似。Real-time PCR法檢測結(jié)果：在共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，且有時間依賴性，并顯著高于肺癌細(xì)胞中的表達(dá)。加入IL-1β中和抗體后，BrdU ELISA法檢測的細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示IL-1β中和抗體可明顯抑制巨噬細(xì)胞對肺癌細(xì)胞A549和NCI-H520的增殖促進(jìn)作用。Western blot法檢測結(jié)果顯示IL-1β可顯著抑制腫瘤細(xì)胞Beclin 1的表達(dá)。結(jié)論：巨噬細(xì)胞和肺癌細(xì)胞通過增強(qiáng)IL-1β的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。抑制腫瘤細(xì)胞的自噬可能是IL-1β促進(jìn)肺癌發(fā)展的作用機(jī)制。

巨噬細(xì)胞；肺癌；IL-1β；細(xì)胞增殖；自噬

肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居于各種腫瘤的前列，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是最為普遍的肺癌類型，占肺癌發(fā)病總數(shù)的85%，5年生存率只有15%[1]。臨床和實(shí)驗研究表明炎癥與腫瘤有著極為密切的聯(lián)系[2]。腫瘤微環(huán)境中存在的炎癥因子對腫瘤形成和發(fā)展的每一步都十分重要[3]。IL-1β是IL-1家族最重要的一員，具有強(qiáng)大的前炎癥活性，與細(xì)胞的惡變，腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移有著極為密切的關(guān)系[4]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，由巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β是大腸癌生長的重要因子[5]。在肺癌中，表達(dá)上調(diào)的IL-1β是炎癥促進(jìn)肺癌形成的重要因素，可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6]。但是前期的肺癌研究只局限在IL-1β對腫瘤的直接作用，沒有涉及到腫瘤微環(huán)境中包含的炎癥免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞在其中的作用，因此，IL-1β在肺癌微環(huán)境中的表達(dá)，及其對肺癌發(fā)展的作用和機(jī)制至今尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。本研究中，我們將在體外以共培養(yǎng)方式建立腫瘤微環(huán)境模型，研究巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)和機(jī)制，并探討了IL-1β在其中的重要作用，為肺癌的臨床治療提供一個潛在的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要抗體和試劑 兔抗人Beclin 1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；重組人IL-1β和人IL-1β中和抗體購自美國R&D公司；免疫球蛋白IgG購自美國Sigma公司；10%胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；Transwell? 插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國Corning公司；BrdU-ELISA試劑盒購自瑞士羅氏公司；ECL化學(xué)發(fā)光劑購自Thermo公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司產(chǎn)品；QPCR SYBR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 細(xì)胞來源和培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞： NCI-H520購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，A549細(xì)胞購自美國ATCC。巨噬細(xì)胞：分離人外周血單核細(xì)胞，于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，加巨噬細(xì)胞集落刺激因子50 ng/ml繼續(xù)培養(yǎng) 5 d，形態(tài)學(xué)和巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD14和CD68鑒定。

1.2 方法

1.2.1 BrdU-ELISA法檢測共培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞的增殖能力 使用Transwell? 插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，將肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)4 d。實(shí)驗分組：將每株肺癌細(xì)胞各分為4組，1組為肺癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組； 2、3、4組按肺癌細(xì)胞和不同比例的巨噬細(xì)胞(1∶0.5、1∶1和1∶2)共培養(yǎng)，其中肺癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)在24孔板中，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在Transwell?培養(yǎng)皿中。肺癌細(xì)胞與不同濃度巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)4 d后，按照BrdU-ELISA試劑盒操作說明檢測各樣本的吸光度。

1.2.2 BrdU-ELISA法檢測IL-1β對肺癌細(xì)胞的增殖能力的影響 實(shí)驗分組：將每株肺癌細(xì)胞各分為3組，第1組為肺癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組； 第2組為肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞按1∶1的比例共培養(yǎng)組，并加免疫球蛋白IgG作為對照；第3組為肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞按1∶1的比例共培養(yǎng)組，第3組為共培養(yǎng)后，加入10 μg/ml IL-1β中和抗體。按照BrdU-ELISA試劑盒操作說明檢測肺癌細(xì)胞的增殖能力。

1.2.3 Real-time PCR 檢測巨噬細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中IL-1β mRNA的表達(dá) 將2×105個肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞按1∶1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)。收集所需細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，實(shí)時定量PCR檢測IL-1β mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，70℃延伸45 s，25個循環(huán)；70℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參。引物序列如下，IL-1；F:5′-ATGGCAGAAGTACCTAAGCTC-3′；R:5′-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAACTCAGT-3′。β-actin，F(xiàn)： 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′；R：5′-CTGGTGCCT-GGGGCG-3′。

1.2.4 Western blot法檢測Beclin 1蛋白的表達(dá) 肺癌細(xì)胞經(jīng)10 ng/ml IL-1β作用到待檢時間后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白樣品定量。取40 μl總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合，變性后上樣于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉封閉，加一抗4℃孵育過夜，經(jīng)TBS-T充分洗滌，加HRP-羊抗兔抗體，TBS洗滌，用化學(xué)發(fā)光試劑盒定影顯影。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖 BrdU-ELISA法分析結(jié)果顯示(表1)，A549細(xì)胞與不同比例的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)4 d后，與A549細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組的A549細(xì)胞的吸光度明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著巨噬細(xì)胞數(shù)量的增多，A549細(xì)胞的吸光度增加的越明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與不同濃度的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，NCI-H520細(xì)胞的增殖變化趨勢與A549細(xì)胞相似。提示巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖，且促進(jìn)作用隨巨噬細(xì)胞比例的增加而增加。

LungcancercellsControlLungcancercell：macrophage1∶051∶11∶2FvaluePvalueA549041±006113±0101)232±0301)2)379±0351)2)3)3896001NCI?H520031±007071±0061)197±0211)2)345±0231)2)3)744001

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the 1∶0.5 group，2)P<0.05；compared with the 1∶1 group，3)P<0.05.

圖1 Real-time PCR 檢測IL-1β mRNA在巨噬細(xì)胞和A549細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Detect expression of IL-1β mRNA in macrophages and A549 cells by Real-time PCRNote: Compared with the macrophages 0 h group，*.P<0.05；compared with the A549 cell 0 h group，#.P<0.05.

圖2 Real-time PCR 檢測IL-1β mRNA在巨噬細(xì)胞和NCI-H520細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Detect expression of IL-1β mRNA in macrophages and NCI-H520 cells by Real-time PCRNote: Compared with the macrophages 0 h group，*.P<0.05；compared with the NCI-H520 cell 0 h group，#.P<0.05.

LungcancercellControlLungcancercell∶macrophage=1∶1ControlIgGIL?1βneutralizingantibodyFvaluePvalueA549055±003363±033146±0181)5472001NCI?H520055±004294±038153±0201)2371001

Note：Compared with the control IgG group，1)P<0.05

2.2 共培養(yǎng)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和肺癌細(xì)胞IL-1β mRNA的表達(dá) Real-time PCR檢測結(jié)果顯示在與肺癌A549細(xì)胞或NCI-H520細(xì)胞共培養(yǎng)8 h后，巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，且隨著時間的延長其表達(dá)增加(P<0.05,圖1、2)。A549細(xì)胞和NCI-H520細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)也上調(diào)，但是上升的幅度顯著低于巨噬細(xì)胞(圖1、2)。

2.3 IL-1β中和抗體抑制巨噬細(xì)胞的促肺癌細(xì)胞增殖作用 BrdU ELISA法檢測的結(jié)果顯示，A549細(xì)胞與巨噬細(xì)胞以1∶1的比例共培養(yǎng)后，對照IgG組的A值為(2.95±0.11)，IL-1β中和抗體組的A值為(1.45±0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。NCI-H520細(xì)胞的檢測結(jié)果與A549細(xì)胞相似，提示：IL-1β中和抗體也可抑制A549細(xì)胞和NCI-H520細(xì)胞的增殖(P<0.05，表2)。

圖3 Western blot 檢測IL-1β處理肺癌細(xì)胞后Beclin 1蛋白的表達(dá)Fig.3 Detect expression of Beclin 1 protein in IL-1β treated lung cancer cells by Western blotNote: A.A549 cell;B.NCI-H520 cell Compared with the 0 h group，P<0.05.

2.4 IL-1β對肺癌細(xì)胞自噬的影響 Western blot法檢測的結(jié)果顯示，IL-1β分別作用于肺癌細(xì)胞A549和NCI-H520后，自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)在兩種細(xì)胞里隨著作用時間地延長逐漸下調(diào)，與0 h組相比有統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05 (圖3)。提示IL-1β可降低肺癌細(xì)胞的自噬能力。

3 討論

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用已被生物醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可，但具體的作用機(jī)制現(xiàn)仍不清楚。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞與肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)時，巨噬細(xì)胞促進(jìn)了肺癌細(xì)胞增殖，肺癌細(xì)胞增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞IL-1β的表達(dá)；IL-1β下調(diào)腫瘤細(xì)胞Beclin 1表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬。提示對肺癌細(xì)胞自噬能力的影響可能是IL-1β促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，常有炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞的浸潤，這也是腫瘤的重要特征[7]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是滲入腫瘤組織的巨噬細(xì)胞，其數(shù)量與腫瘤的預(yù)后不良關(guān)系密切[8]。激活的TAMs滲入到腫瘤微環(huán)境中，通過自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)控腫瘤的生長[9]。在巨噬細(xì)胞缺陷的小鼠中，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移幾乎被完全抑制[10,11]。抑制小鼠炎癥免疫細(xì)胞的NF-κB信號途徑，顯著抑制小鼠肺部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小鼠肺腫瘤生長阻滯[7,9]。前期我們的研究發(fā)現(xiàn)[7]，在人類肺腺癌和鱗癌組織中有大量的巨噬細(xì)胞浸潤，而正常的肺組織中僅有少量巨噬細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞可以顯著促進(jìn)2株肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和NCI-H520細(xì)胞的增殖，并且具有明顯的巨噬細(xì)胞數(shù)量依賴性。但是巨噬細(xì)胞浸潤與肺癌的發(fā)展還存在爭議。Koukourakis等[12]發(fā)現(xiàn)在Ⅰ～Ⅱ期的非小細(xì)胞肺癌患者中，巨噬細(xì)胞數(shù)量決定了肺癌患者的預(yù)后，巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量越多，患者預(yù)后越差。而在Kerr[13]的研究中，發(fā)現(xiàn)在對腫瘤生長抑制的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本分析中，高巨噬細(xì)胞數(shù)目與腫瘤的生長抑制存在正相關(guān)。不同的巨噬細(xì)胞評價方法可能是導(dǎo)致結(jié)論不一致的原因，這一問題將有待今后進(jìn)一步研究。

現(xiàn)已有研究表明[14]，巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，對腫瘤的增殖和發(fā)展具有重要作用，如白介素、腫瘤壞死因子等。IL-1β是巨噬細(xì)胞表達(dá)的重要前炎癥因子，多個研究發(fā)現(xiàn)IL-1β對肺癌，大腸癌等腫瘤的發(fā)展具有促進(jìn)作用[4,6]。其機(jī)制包括：IL-1β可通過激活大腸癌的wnt信號途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[15]；IL-1β具有血管生成功能，可以增加肺腫瘤周圍的血管形成[15]。IL-1β通過抑制肺癌細(xì)胞microRNA-101/Lin28B 途徑促進(jìn)肺癌的發(fā)展[6]。本研究采用肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中IL-1β 的表達(dá)。結(jié)果顯示，當(dāng)肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時，巨噬細(xì)胞中的IL-1β表達(dá)顯著增強(qiáng)，且高于肺癌細(xì)胞IL-1β的表達(dá)，提示共培養(yǎng)時IL-1β的表達(dá)和分泌主要來源于巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步采用IL-1β中和抗體抑制IL-1β，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的能力明顯減低，證實(shí)巨噬細(xì)胞釋放的IL-1β是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素。

IL-1β可被多種炎癥中介物調(diào)控表達(dá)，是巨噬細(xì)胞分泌的主要炎性細(xì)胞因子之一[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，肺癌病人的肺泡巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β遠(yuǎn)高于同一病人外周血單核細(xì)胞，顯示了其在腫瘤發(fā)展中的作用。IL-1β通過誘導(dǎo)GSK3β磷酸化，穩(wěn)定β-catenin，增強(qiáng)TCF依賴的基因活性，從而激活腫瘤細(xì)胞Wnt/β-catenin信號途徑促進(jìn)腫瘤增殖[5]。自噬(Autophagy)是一個受到高度調(diào)控的對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程[16]。該過程中一些臨時的或損壞的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器通過溶酶體進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新[9]。自噬可出現(xiàn)在機(jī)體的多種生理和病理過程，其所起的作用是正面還是負(fù)面的尚未完全闡明，對腫瘤的研究尤其如此，值得關(guān)注[17]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β的刺激顯著降低肺癌細(xì)胞Beclin1蛋白的表達(dá)。Beclin1是一種腫瘤抑制蛋白，是哺乳動物參與自噬的特異性基因，刺激自噬的發(fā)生[16]。結(jié)果提示，IL-1β很可能通過抑制Beclin1的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞增殖增強(qiáng)。已有研究表明，在乳腺癌小鼠模型中，抑制腫瘤細(xì)胞Beclin1基因表達(dá)，顯著增加小鼠腫瘤的數(shù)量，加快腫瘤的生長。而在肝細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，通過沉默Beclin1基因抑制自噬，卻顯著降低肝細(xì)胞癌的肺轉(zhuǎn)移。因此，IL-1β在小鼠肺癌模型中是否通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白抑制自噬，從而促進(jìn)腫瘤生長還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞能促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，肺癌細(xì)胞增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，IL-1β可下調(diào)腫瘤細(xì)胞自噬能力。

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[收稿2016-06-25 修回2016-09-21]

(編輯 許四平)

Study on mechanisms of IL-1β promoted lung cancer cells proliferation

SHIYu-Rong,WUJun-Lu,QUANWen-Qiang,LIDong.

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BengbuMedicalCollege，Bengbu233000，China

Objective:To investigate the mechanisms of IL-1β promoted lung cancer cells proliferation.Methods: The “Transwell? Inserts” system was used to coculture lung cancer cells A549，NCI-H520 with macrophages.BrdU ELISA used to measure the effect of macrophages promoted lung cancer cells proliferation.Expression of mRNA of IL-1β in A549 and NCI-H520 cells were analysed by Real-time PCR analysis.IL-1β was responsible for macrophage-promoted lung cancer cells growth,IL-1β neutralizing antibody was added.The autophagy marker Beclin1 protein was detected by Western blot.Results: The BrdU ELISA assay showed that after coincubation with macrophages in the proportion of 1∶0.5,the OD value of A549 increased from(0.41±0.06)to(1.13±0.10).There was statistical significance(P<0.05).It also showed that the growth of the A549 cell was dependent on the macrophage number(P<0.05).The OD value variability of NCI-H520 cells was as same as A549 cell upon cocultured with macrophages.Real-time PCR results showed that the expression of IL-1β mRNA in macrophages was remarkably enhanced in a time dependent manner upon coincubated with lung cancer cell,and the expression level was higher than lung cancer cells.Addition of IL-1β neutralizing antibody markedly inhibited macrophage-promoted lung cancer cells proliferation.The OD value of these two cells were decreased from(3.63±0.33) to (1.46±0.18),from (2.94±0.38) to (1.53±0.20),respectively (P<0.05).After treatment with IL-1β,the expression of Beclin1 was significantly inhibited in tumor cells.Conclusion: Over-expression of IL-1β from macrophages and lung cancer cells is responsible for proliferation of tumor cells in coculture condition.Inhibition of autophagy in tumor cells may be the important mechanisms of IL-1β promotes lung cancer cells proliferation.

Macrophages；Lung cancer；IL-1β；Cell proliferation；Autophagy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.004

①本文為國家自然科學(xué)基金(81272603，81472179)和安徽省自然科學(xué)基金(KJ2014A162)資助項目。

石玉榮(1974年-)，女，碩士，副教授，主要從事腫瘤分子生物學(xué)方面的研究。

R734.2

A

1000-484X(2017)01-0020-05

②同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗科，上海200065。

③通訊作者，E-mail: 186ld@163.com。