陳聰哲 董 丹 方海瑞 蔣紅群 侯 雋 楊 琨 郭 峰 陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832000)

原頭蚴體外刺激巨噬細(xì)胞高表達PPARα/γ并調(diào)節(jié)其極化①

陳聰哲 董 丹 方海瑞 蔣紅群 侯 雋 楊 琨 郭 峰 陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832000)

目的：探討原頭蚴與RAW264.7共培養(yǎng)后PPARα/γ的表達水平以及對巨噬細(xì)胞極化的作用。方法：原頭蚴與RAW264.7共培養(yǎng)12、 24、 36、 48、72 h取細(xì)胞。用qRT-PCR的方法檢測RAW264.7細(xì)胞PPARα/γ的表達水平，用qRT-PCR的方法檢測巨噬細(xì)胞M1型相關(guān)因子TNF-α、MCP-1、IL-1β和M2型相關(guān)因子Arg-1、TGF-β、Fizz-1的水平，ELISA的方法檢測Arg-1和MR的表達量。結(jié)果：RAW264.7細(xì)胞PPARα/γ的表達水平和M2型相關(guān)因子Arg-1、TGF-β、Fizz-1和MR均逐漸升高，72 h表達最高(P<0.05)；巨噬細(xì)胞M1型相關(guān)因子TNF-α、MCP-1、IL-1β先升高后降低(P<0.05)，Arg-1和MR的蛋白水平也逐漸增高。結(jié)論：原頭蚴與RAW264.7共培養(yǎng)后PPARα/γ的表達逐漸升高，可能促進巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化，從而在蟲體免疫逃逸中發(fā)揮一定作用。

原頭蚴；巨噬細(xì)胞；PPARα/γ；極化

棘球蚴病(Hydatid disease)又稱包蟲病是由棘球蚴絳蟲幼蟲寄生于人畜體內(nèi)而導(dǎo)致感染的人畜共患病，主要分布于牧區(qū)。其中由細(xì)粒棘球蚴絳蟲(Echinococcus granulosus，Eg)引起的囊性包蟲病多見。人類是其中間宿主[1]。人類感染包蟲病的主要部位為肝(65%)，其次為肺(25%)[2]。細(xì)粒棘球蚴病是慢性感染性疾病，蟲體之所以能長期寄生在宿主體內(nèi)并對宿主各器官造成不同傷害，可能與宿主的免疫逃逸功能有關(guān)[3]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)，是一種類固醇受體，屬于由配體激活的Ⅱ型核受體超家族成員[4]，分為三個亞型即α、β和γ。 PPAR-α主要分布于肝、腎、褐色脂肪組織(BAT)，在脂肪酸氧化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及肝臟的纖維化中起重要作用[5]。 PPAR-γ主要在脂肪組織、肝、腎、單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等表面表達[6]。有研究顯示，PPAR-γ的功能復(fù)雜多樣，它參與抗炎反應(yīng)，調(diào)節(jié)糖脂代謝，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和分化，抑制腫瘤血管生成，抗動脈粥樣硬化，改善心功能和參與心室重構(gòu)等。然而包蟲病作為一種感染性疾病，對于PPAR-γ和PPAR-α的表達研究尚未見報道。故本文主要研究包蟲病感染早期PPAR-γ和PPAR-α的表達水平。

巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境下有不同表型，分為促炎的M1型和抗炎的M2型[7]。TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和IL-1β是巨噬細(xì)胞M1型相關(guān)因子，精氨酸酶-1(Arg-1)、TGF-β、MR(甘露糖受體)和Fizz-1(與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān))。Th1型細(xì)胞因子如LPS可以促使巨噬細(xì)胞向M1型極化，相反Th2型細(xì)胞因子如IL-4可以促使巨噬細(xì)胞向M2型極化[8]。有文獻證明PPARα/γ參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，促使巨噬細(xì)胞向M2型極化[9]。巨噬細(xì)胞在天然免疫中發(fā)揮重要作用，故本文還將研究包蟲病時PPARα/γ對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)，為進一步研究包蟲病早期免疫逃逸機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 RAW264.7細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基，RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)均購自Hyclone公司；總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光染料(SYBR Green Ⅰ)均購自QIAGEN公司，熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；MR和Arg-1 ELISA檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生生物科技有限公司。

1.1.3 內(nèi)參引物 根據(jù)Genebank中小鼠PPAR-γ，MCP-1，Arg-1及內(nèi)參β-actin的基因序列，應(yīng)用primer 5軟件進行分析和比較，選取適當(dāng)?shù)膮^(qū)域合成引物，并由上海生工公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的采集及制備懸液 從昌吉屠宰場購買感染細(xì)粒棘球蚴病的羊肝，酒精消毒，清洗。選取無鈣化的，無感染的，囊泡完整的單囊型包囊內(nèi)容物(囊液清澈)，置于無菌容器中，待原頭節(jié)(Protoscole，PSC)自然沉淀，用含1%雙抗(100 U/ml青霉素和鏈霉素)的無菌PBS(pH7.3)清洗3次，去除活性較差的原頭蚴以及育囊碎片，用含雙抗的PBS重懸頭節(jié)，取10 μl懸液用0.5%的伊紅染色5 min，顯微鏡下鑒定蟲體活性(活性>90%)，用含雙抗的PBS將懸液稀釋成濃度10 000個/ml，備用。

1.2.2 RAW264.7細(xì)胞體外培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，以每孔濃度為1×106接種于6孔板上，每孔1 ml,進行下面處理。

表1 RT-PCR引物

Tab.1 Primer of RT-PCR

PrimernameNucleotidesequenceβ?actinF5′?AATTCCATCATGAAGTGTGA?3′R5′?ACTCCTGCTTGCTGATCCAC?3′PPAR?αF5′?GCTGGTGTACGACAAGTG?3′R5′?GTGTGACATCCCGACAGAC?3′PPAR?γF5′?TACCACAGTTGATTTCTCCAGC?3′R5′?CCACAGACTCGGCACTCAAT?3′TNF?αF5′?GAGAGGCAGAGGACACTCAATG?3′R5′?GCTCAGGTTGTGGCGGATG?3′MCP?1F5′?ATGCAGGTCCCTGTCATG?3′R5′?GCTTGAGGTGGTTGTGGA?3IL?1βF5′?CGCTCAGGGTCACAAGAAAC?3′R5′?AGAGAGTGCTGCCTAATGTCC?3′Arg?1F5′?CAGAAGAATGGAAGAGTCAG??3′R5′?CAGATATGCAGGGAGTCACC?3′TGF?βF5′?TGACGTCACTGGAGTTGTACGG?3′R5′?GGTTCATGTCATGGATGGTGC?3′Fizz?1F5′?ACTCGTTGACTGGACCACTG?3′R5′?AAGAAGCAGGGTAAATGGGCA?3′

1.2.3 細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng) 對照組：加1 ml DMEM培養(yǎng)基；實驗組：原頭蚴濃度1 000個/ml，取1 ml與細(xì)胞共培養(yǎng)。在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48、72 h(各設(shè)3個復(fù)孔)，收集細(xì)胞，取上清離心備用。

1.2.4 熒光定量PCR檢測PPAR-γ、PPAR-α、TNF-α、MCP-1、IL-1β、Arg-1、TGF-β、Fizz-1的表達 按照總RNA提取試劑盒提取RAW264.7細(xì)胞的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。上機進行熒光定定量檢測，體系20 μl，其中cDNA 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，SYBR Green Ⅰ 10 μl，ddH2O 7 μl，共40個循環(huán)。

1.2.5 ELISA方法檢測上清液中相關(guān)細(xì)胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間的顯著性差異采用One-way ANOVA檢驗，組內(nèi)采用兩樣本均數(shù)t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，RAW264.7巨噬細(xì)胞PPAR-γ表達逐漸升高 通過熒光定量PCR技術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞PPAR-γ表達水平。結(jié)果顯示：細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)在12、24、36、48、72 h時，巨噬細(xì)胞PPAR-γ表達逐漸升高(P<0.05)，見圖1。

2.2 細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，RAW264.7巨噬細(xì)胞PPAR-α表達逐漸升高 通過熒光定量PCR技術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞PPAR-α表達水平。結(jié)果顯示：細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)在12、24、36、48、72 h時，巨噬細(xì)胞PPAR-α表達逐漸升高(P<0.05)，見圖2。

2.3 細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，RAW264.7細(xì)胞M1型相關(guān)因子表達先升高后降低 通過熒光定量PCR檢測細(xì)粒棘球蚴感染早期，RAW264.7細(xì)胞M1型相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、MCP-1、 IL-1β表達水平。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)后TNF-α、MCP-1在12、24、36、48 h時表達逐漸升高，48 h達最高，以后逐漸降低(P<0.05)；IL-1β在36 h達最高，以后逐漸降低(P<0.05)，見圖3。

圖1 qRT-PCR技術(shù)檢測原頭蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞PPAR-γ的含量Fig.1 PPAR-γ level in RAW264.7 cells treated with protoscolices were analyzed by qRT-PCRNote: The expression of PPAR-γ from RAW264.7cells treated with protoscolices were increased at different time points；Statistic analysis of the expression of PPAR-γ from RAW264.7 cells treated with protoscolices at different time points.*.P<0.05.

2.4 細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，RAW264.7細(xì)胞M2型相關(guān)因子mRNA水平和蛋白水平表達均逐漸升高 通過熒光定量PCR檢測細(xì)粒棘球蚴感染早期，RAW264.7細(xì)胞M2型相關(guān)細(xì)胞因子Arg-1、TGF-β、Fizz-1表達水平，用ELISA方法檢測Arg-1和MR的表達水平。結(jié)果顯示：共培養(yǎng)后Arg-1、TGF-β、Fizz-1在12、24、36、48、72 h時表達逐漸升高，72 h達最高(P<0.05)，Arg-1和MR的ELISA結(jié)果也相同，見圖4。

圖2 qRT-PCR技術(shù)檢測原頭蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞PPAR-α的含量Fig.2 PPAR-α level in RAW264.7 cells treated with protoscolices were analyzed by qRT-PCRNote: The expression of PPAR-α from RAW264.7cells treated with protoscolices were increased at different time points；Statistic analysis of the expression of PPAR-α from RAW264.7 cells treated with protoscolices at different time points.*.P<0.05.

圖3 qRT-PCR技術(shù)檢測原頭蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)TNF-α、MCP-1、IL-1β的含量Fig.3 TNF-α，MCP-1，IL-1β levels in RAW264.7 cells detected with protoscolices were analyzed by qRT-PCR Note: A .The TNF-α levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by qRT-PCR;B.The MCP-1 levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by qRT-PCR;C.The IL-1β levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by qRT-PCR.*.P<0.05.

圖4 qRT-PCR技術(shù)檢測原頭蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)Arg-1、TGF-β、Fizz-1的含量，ELISA檢測Arg-1和MR的蛋白量Fig.4 Arg-1，TGF-β and Fizz-1 levels in RAW264.7 cells treated with protoscolices were analyzed by qRT-PCR,Arg-1 and MR were detected by ELISA Note: A .Detected by qRT-PCR;B.The TGF-β levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by qRT-PCR;C.The Arg-1 levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by qRT-PCR;D.The Arg-1 levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by ELISA;E.The MR levels in protoscolices and RAW264.7 cells co-cultured were detected by ELISA ,*.P<0.05.

3 討論

宿主抵抗包蟲病感染的免疫應(yīng)答是一個復(fù)雜的過程，不同的抗原進入機體先激活的細(xì)胞不同其對抗原免疫的方向和結(jié)果也不同[10]。巨噬細(xì)胞是一類具有異質(zhì)性的免疫細(xì)胞，能吞噬殺傷病原體，清除損傷和衰老的細(xì)胞，是機體非特異性免疫的重要組成部分。成熟的巨噬細(xì)胞在各種因素誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生不同的功能表型即為巨噬細(xì)胞極化[11]。有研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子對巨噬細(xì)胞極化起重要作用。PPARα/γ屬于Ⅱ型核激素受體家族成員，在轉(zhuǎn)錄水平上對靶基因進行調(diào)控，由此來實現(xiàn)不同的生物學(xué)作用[12]。PPARα/γ在腫瘤中發(fā)揮作用可能與其抑制血管生成有關(guān)[13]，在抑制動脈粥樣硬化方面PPARα/γ增高主要通過抑制炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和增生[14]，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中PPARα/γ表達增高可以增加抗炎因子的表達，從而延遲神經(jīng)損害來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。

本實驗中細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)后PPAR-γ和PPAR-α的表達量從第12 h開始到72 h都是逐漸升高，72 h表達最高； 巨噬細(xì)胞M1型相關(guān)因子TNF-α、MCP-1、IL-1β、的mRNA水平先升高后降低，而M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子Arg-1、TGF-β、Fizz-1的mRNA水平逐漸升高，Arg-1和MR的蛋白水平也相同，與PPARα/γ的趨勢相一致，有文獻報道PPARα/γ與M2型巨噬細(xì)胞成熟相關(guān)[16]。我們猜測PPARα/γ的表達增高可能影響了巨噬細(xì)胞的極化，使其由促炎的M1型變?yōu)榭寡椎腗2型，表型發(fā)生了變化，功能也發(fā)生改變，從而使蟲體產(chǎn)生免疫逃逸，導(dǎo)致原頭蚴能夠在體內(nèi)長期存活。

綜上所述，細(xì)粒棘球蚴與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)后PPAR-γ和PPAR-α的表達量逐漸增高。巨噬細(xì)胞M1型相關(guān)因子先增高后降低，M2型相關(guān)因子逐漸增高，巨噬細(xì)胞表型的改變可能與PPARα/γ表達增加相關(guān)，從而影響了巨噬細(xì)胞的功能，抑制宿主的免疫殺傷，引起了蟲體的免疫逃逸。

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[收稿2016-07-15 修回2016-09-05]

(編輯 許四平)

Echinococcus granulosus stimulates high PPARα/γ expression and drives polarization of macrophages in vitro

CHENCong-Zhe,DONGDan,FANGHai-Rui,JIANGHong-Qun,HOUJun,YANGKun，GUOFeng,CHENXue-Ling.

DepartmentofImmunology,ShiheziUniversitySchoolofMedicine,Shihezi832000,China

Objective:To investigate the expression levels of PPARα/γ in RAW264.7 cells in the early stages of co-cultivation with Echinococcus granulosus in vitro.Methods: RAW264.7 cells were co-cultured with E.granulosus and collected at 12,24,36,48,72 h.The mRNA levels of PPAR-γ,PPAR-α,M1 macrophages-associated cytokines including TNF-α,MCP-1 and IL-1β,and M2 macrophages-associated cytokines including Arg-1,TGF-β and Fizz-1 were detected by qRT-PCR.The protein levels of Arg-1 and MR were analyzed by ELISA.Results: The expression levels of PPAR-γ, PPAR-α and the M2 macrophages-associated cytokines including Arg-1,TGF-β,Fizz-1 and MR were significantly increased,especially at 72 h (P<0.05).M1 macrophages-associated cytokines including TNF-α,MCP-1 and IL-1β were decreased at 72h although increased at first.Conclusion: During the early stages of co-cultivation with Echinococcus granulosus in vitro,the levels of PPAR-γ/α are up-regulated in RAW264.7 cells,which may drive macrophage polarization and play a role in the immune escape.

Echinococcus granulosus;Macrophage;PPAR-γ/α;Polarization

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.003

①本文為國家自然科學(xué)基金(81360453，81260412)和兵團博士基金(2011BB018)。

陳聰哲(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事地方感染性疾病的研究，E-mail:13150405937@163.com。

及指導(dǎo)教師：陳雪玲(1971年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染免疫方面的研究，E-mail:xuelingch@hotmail.com。

R383.33

A

1000-484X(2017)01-0016-05