關(guān)麗娜，王春梅，穆玉明

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

靶向和非靶向微泡聯(lián)合尿激酶超聲溶栓的電鏡表現(xiàn)

關(guān)麗娜，王春梅，穆玉明*

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 比較靶向和非靶向微泡聯(lián)合尿激酶超聲溶栓的電鏡表現(xiàn)。方法 將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸片段(RGDS)與尿激酶(UK)以及超聲微泡(SonoVue)通過機(jī)械振蕩法，制備成靶向微泡。于30只新西蘭大白兔單側(cè)股動脈制備在體混合性血栓，并分為單純超聲輻照組(US組)、超聲輻照+非靶向微泡造影劑+UK組(US+M+UK組)、超聲輻照+靶向微泡造影劑+UK組(US+RGDS+UK組)。通過超聲及多普勒血流儀觀察溶栓效果，然后對股動脈離體標(biāo)本行HE染色，并觀察電鏡表現(xiàn)。結(jié)果 溶栓20 min后，與US組和US+M+UK組比較，US+RGDS+UK組血流量明顯恢復(fù)(P均<0.05)，US組與US+M+UK組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。US+M+UK組HE染色顯示管腔內(nèi)充滿血栓，血小板梁呈顆粒狀、不致密，掃描電鏡示粗大束狀的膠原纖維上疏松附著少量細(xì)小纖維蛋白絲，大部分?jǐn)嗔?；透射電鏡示血栓大部分溶解為空泡狀，可見白細(xì)胞或血小板降解的碎片。US+RGDS+UK組HE染色顯示血栓完全溶解；掃描電鏡示血栓的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，纖維蛋白完全的溶解；透射電鏡示血栓降解為高電子密度的顆粒。結(jié)論 血栓結(jié)構(gòu)的空泡化、纖維蛋白網(wǎng)架結(jié)構(gòu)完全崩解和纖維蛋白的完全溶解是靶向微泡和UK聯(lián)合溶栓的主要電鏡改變。

微泡；溶栓治療；超聲檢查

由于血栓缺乏正常的膠原纖維和彈性纖維，質(zhì)地堅硬易碎，彈性小，易被超聲能量分裂和崩解[1]。超聲聯(lián)合微泡技術(shù)可使聚集于血栓局部的微泡產(chǎn)生共振，微泡破裂可軟化血栓；此外超聲與微泡的共振效應(yīng)可以拉長、切斷或損壞血栓中的纖維，導(dǎo)致血栓崩解，從而增加纖溶酶與血栓的結(jié)合位點，加快其結(jié)合速度，進(jìn)而加速纖溶[2]。研究[3-5]表明低頻超聲聯(lián)合微泡及藥物可溶解在體血栓，但其溶栓機(jī)制尚不明確。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)低頻超聲聯(lián)合靶向微泡+藥物和非靶向微泡+藥物對血栓的溶解效果不同。本研究通過建立股動脈內(nèi)混合性血栓動物模型，比較非靶向和靶向微泡聯(lián)合尿激酶(urokinase, UK)超聲溶栓的電鏡表現(xiàn)，探討低頻超聲聯(lián)合靶向微泡和藥物溶栓的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1制備微泡造影劑[7]靶向微泡造影劑的制備：按UK(樣品批號20071011，注射級原料，南京南大藥業(yè)生物化學(xué)有限公司)/精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸片段(Arg-Gly-Asp-Ser segments， RGDS)/造影劑微泡最優(yōu)比例1∶1∶1[8]配置，即UK 3 mg(240 000 U/kg)、RGDS[含熒光標(biāo)記的上述UK(FITC-UK，杭州中肽生化有限公司特約合成)、熒光標(biāo)記的RGDS(5-TAMRA-RGDS，吉爾生化上海有限公司特約合成)]3 mg、微泡造影劑(SonoVue)3 ml，將UK、RGDS、SonoVue微泡混合振蕩30 s，制備成白色、乳狀的微泡混懸液6 ml。采用漩渦混合器(杭州IKA MS)以400轉(zhuǎn)/分振蕩60 s后，室溫下靜置30 min。

非靶向微泡造影劑的制備：將未標(biāo)記RGDS的SonoVue微泡造影劑3 ml和UK 3 mg溶解于3 ml生理鹽水中振蕩，制備6 ml混懸液。采用漩渦混合器以400 rot/min振蕩60 s后，室溫下靜置30 min。

1.2 靶向微泡形態(tài)分析 將1 ml靶向微泡造影劑置于離心管中，加入等量的生理鹽水，在超速離心機(jī)中離心1 min(轉(zhuǎn)速400 rot/min)，使微泡聚集于液相的頂部，去除下清液，加入生理鹽水1 ml，再放入超速離心機(jī)中離心1 min(轉(zhuǎn)速400 rot/min)。重復(fù)洗滌2次，進(jìn)行提純。分析靶向微泡的粒徑；采用流式細(xì)胞儀(Beckman，CYTOMETER)分析洗滌前、后UK和RGDS的攜帶率，應(yīng)用洗滌后的靶向微泡進(jìn)行溶栓實驗。

1.3建立動物模型 選取新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量1.8～2.8 kg。采用戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg體質(zhì)量)麻醉，于耳緣靜脈留置靜脈套管針，建立靜脈通道。將實驗兔仰臥位保定，腹股溝區(qū)備皮，鈍性分離股動脈，結(jié)扎其相應(yīng)的側(cè)支，游離股動脈長約3～5 cm，于其后壁放置一大小2.5 cm×2.5 cm的橡膠薄膜，以保護(hù)動脈周圍組織。于股動脈的近心端放置PWD血流計(Transonic，TS420)監(jiān)測血流量，監(jiān)測數(shù)據(jù)由PowerLab system(AD Instruments Pty Ltd)處理。采用一大小0.5 cm×0.5 cm的浸有10%三氯化鐵(沈陽市新西試劑廠)溶液的濾紙片將股動脈環(huán)繞包裹，使接觸面約為股動脈表面積的3/4。待血流穩(wěn)定后，將股動脈的遠(yuǎn)端夾閉，7～8 min后取出動脈夾，約20 min后取出濾紙片，采用生理鹽水沖洗局部組織。以血流計顯示血流量<0.05 ml/min，同時二維超聲和CDFI均顯示閉塞性血栓為血栓成功形成的標(biāo)志。所有動物的處置均經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批件號：20090317001)，并按照相關(guān)規(guī)定處理。

1.4 實驗分組 將30只新西蘭大白兔隨機(jī)分為單純超聲輻照組(US組)、超聲輻照+非靶向微泡造影劑+UK組(US+M+UK組)、超聲輻照+靶向微泡造影劑+UK組(US+RGDS+UK組)，每組10只。US+M+UK組和US+RGDS+UK組均于5 min內(nèi)經(jīng)耳緣靜脈注射3 ml對應(yīng)混懸液，于20 min內(nèi)靜脈緩慢推注剩余3 ml混懸液，后以生理鹽水沖管。在完全閉塞性血栓形成后溶栓按 1 000 U/kg體質(zhì)量開始前注射。

1.5 超聲檢查 采用GE Vivid 7型超聲診斷儀，高頻探頭i13L，頻率5.7～11.4 MHz，輸出功率-15 dB，機(jī)械指數(shù)0.13，深度3 cm；低頻探頭M3S，頻率1.5～3.1 MHz，機(jī)械指數(shù)為0.08。于血栓形成后，采用高頻

圖1 US+M+UK組 造影示股動脈內(nèi)充滿血栓，僅見散在的造影劑回聲 圖2 US+RGDS+UK組 血栓被完全溶解，管腔內(nèi)充滿強(qiáng)回聲

探頭采集二維及彩色多普勒圖像，觀察血栓的形成情況、血流變化。注射造影劑后，采用低頻探頭，啟動二次諧波模式，將探頭置于股動脈血栓處，照射30 min，使造影劑微泡完全爆破，監(jiān)測血栓變化，共觀察120 min[8]，幀頻27.5幀/秒；并分別于超聲輻照后10、20、30、60、90、120 min時記錄血流量。

1.6 病理檢查 實驗結(jié)束后即刻結(jié)扎股動脈遠(yuǎn)、近端血管，取出股動脈。予過量麻醉處死動物。采用4%甲醛溶液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE染色。采用4%戊二醛固定股動脈標(biāo)本，進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡(JEOL JSM-1230, Nihon Denshi, Tokyo, Japan)檢查。

2 結(jié)果

靶向微泡平均粒徑大小約(1 095.4±260.1)nm；洗滌前、后UK的攜帶率為(73.4±11.0)%、(72.3±9.4)%，RGDS的攜帶率分別為(67.1±10.9)%、(64.6±10.2)%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.8、6.3，P=0.12、0.09)。

溶栓后，二維聲像圖示US組和US+M+UK組股動脈壁均增厚、粗糙，腔內(nèi)充滿低回聲實性團(tuán)塊，回聲不均勻，CDFI未探及明顯血流信號，PWD未見高幅脈沖血流信號，造影顯示血栓內(nèi)無強(qiáng)回聲(圖1)。二維聲像圖示US+RGDS+UK組股動脈壁增厚、粗糙，管腔通暢，CDFI探及動脈血流信號，PWD見高幅脈沖血流信號，造影顯示血栓處呈強(qiáng)回聲(圖2)。

溶栓前后血流量的變化見表1。溶栓前3組血流量的比較差異無統(tǒng)計學(xué)(F=2.981，P=0.068)，溶栓20 min后，3組血流量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，且與US組和US+M+UK組比較，US+RGDS+UK組血流量明顯恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，US組與US+M+UK組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

光鏡下HE染色，US組和US+M+UK組管腔內(nèi)均充滿血栓，血小板梁呈顆粒狀、不致密；US+RGDS+UK組未見血栓結(jié)構(gòu)(圖3)。透射電鏡見US組血小板排列較分散，局部聚集，部分碎裂，內(nèi)部顆粒減少，空泡化(圖4A)；US+M+UK組血栓成分大部分溶解為空泡狀，可見白細(xì)胞或血小板降解的碎片(圖4B)；US+RGDS+UK組可見大量降解碎片及降解顆粒，碎片內(nèi)空泡化，未見完整細(xì)胞和血小板(圖4C)。掃描電鏡見US組纖維蛋白絲較細(xì)，排列較稀疏，可見少量血小板，血管內(nèi)膜表面區(qū)域性血栓脫落(圖5A)；US+M+UK組粗大束狀的膠原纖維上疏松附著少量細(xì)小纖維蛋白絲，大部分?jǐn)嗔?圖5B)；US+RGDS+UK組纖維蛋白網(wǎng)架結(jié)構(gòu)崩解，大部分溶解為細(xì)沙樣，并見多處血細(xì)胞脫落后的空洞(圖5C)。

表1 溶栓前后血流量的變化

注：*：與US+RGDS+UK組比較，P<0.05

圖3 光鏡下病理圖(HE，×4) A.US組； B.US+M+UK組； C.US+RGDS+UK組

圖4 透射電鏡下病理圖(×600) A.US組； B.US+M+UK組； C.US+RGDS+UK組

圖5 掃描電鏡下病理圖(×600) A.US組； B.US+M+UK組； C.US+RGDS+UK組

3 討論

本研究結(jié)果顯示，US組和US+M+UK組均未實現(xiàn)血管的再通，僅US+RGDS+UK組實現(xiàn)血管再通，且溶栓20 min后該組的血流量較另兩組增加；但對其病理結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，3組實驗動物溶栓后無論是否實現(xiàn)血管完全再通，其溶栓表現(xiàn)具有一定的相似性，即血栓結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的空泡化，以及血栓空泡化的降解、血栓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的破壞和纖維蛋白被溶解。既往研究[9-11]表明，超聲微泡產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和微流效應(yīng)等是導(dǎo)致血栓溶解的主要機(jī)制。因此，本研究提示低頻超聲、靶向微泡、非靶向微泡在溶栓中通過發(fā)揮空穴效應(yīng)和微流效應(yīng)對血栓進(jìn)行了不同程度的溶解，但對血栓的溶解程度不同，與既往的研究[9-10]結(jié)果相似。

本研究US+M+UK組為部分血栓溶解，未實現(xiàn)血管再通，電鏡示血栓內(nèi)粗大束狀的膠原纖維上疏松附著少量細(xì)小纖維蛋白絲，大部分纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂、纖維蛋白絲變細(xì)和血栓結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生空泡化；US+RGDS+UK組纖維蛋白網(wǎng)架結(jié)構(gòu)崩解，大部分溶解為細(xì)沙樣，并見多處血細(xì)胞脫落后形成的空洞。兩組溶栓后電鏡表現(xiàn)有一定的相似性，但US+M+UK組由于UK及微泡無靶向性，故聚集在血栓局部的微泡數(shù)量和UK的劑量均較低，導(dǎo)致產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和微流效應(yīng)均較弱，UK對纖維蛋白的溶解作用未能有效發(fā)揮，因而未能實現(xiàn)血管的再通。

由于RGDS可與血栓內(nèi)血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)受體特異性結(jié)合，故將微泡與RGDS連接制備具有靶向性的微泡。本研究中US+RGDS+UK組由于微泡具有靶向性，使得微泡大量聚集于血栓處，導(dǎo)致產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和微流效應(yīng)較強(qiáng)；同時這些物理作用促進(jìn)UK進(jìn)入血栓內(nèi)部，故溶栓效果達(dá)到最大化。此外，UK在具有靶向性后會在血栓局部大量聚集，有助于血栓內(nèi)部纖維蛋白的溶解，進(jìn)而達(dá)到有效溶解血栓的目的。總之，低頻超聲、靶向微泡和UK可導(dǎo)致血小板和纖維素結(jié)構(gòu)完全破壞，纖維網(wǎng)完全崩解，血栓被完全溶解，實現(xiàn)血管再通。

綜上所述，低頻超聲聯(lián)合靶向微泡和UK是通過超聲、超聲與微泡產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和微流效應(yīng)、UK對纖維蛋白的溶解等聯(lián)合作用對血栓產(chǎn)生不同程度的破壞，最終導(dǎo)致血栓的完全溶解。其中，微泡和UK的靶向性可使這種聯(lián)合溶栓作用獲得最大程度的發(fā)揮。

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Manifestations of electron microscopy of targeted and non-targeted microbubble combined with urokinase in thrombolysis with ultrasound in vivo

GUANLina,WANGChunmei,MUYuming*

(DepartmentofEchocardiography,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Objective To explore the electron microscopy changes of thrombolysis using targeted and non-targeted microbubble combined with urokinase with diagnostic ultrasound in vivo. Methods Targeted microbubble with urokinase (UK) were prepared by Arg-Gly-Asp-Ser segments (RGDS), UK and microbubble through acoustic vibration. Thrombi were prepared in 30 New Zealand white rabbits with unilateral femoral artery, and all rabbits were divided into ultrasound (US) group, ultrasound+non-targeted microbubble+UK (US+M+UK) group and ultrasound+targeted microbubble+UK (US+RGDS+UK) group. The effect of thrombolysis was observed by ultrasound and Doppler flowmetry. The femoral artery was stained with HE and observed by electron microscopy. Results The blood flow of US+RGDS+UK group were significantly restored (allP<0.05) after 20 min compared with that of US group and US+M+UK group, and there were no significant differences between US group and US+M+UK group (allP>0.05). In US+M+UK group, HE staining shown that thrombi were filled in the lumens and platelet beams were grainy and not dense in HE staining. Scanning electron microscopy showed that a small amount of fine loose fibrin strands were attached while most of them were broken. Transmission electron microscopy revealed most of the thrombi were dissolved, and white blood cells or platelets degradation fragments were visible. In US+RGDS+UK group, HE staining shown that thrombi were completely dissolved, and destruction of fibrin and complete dissolution of fibrous network were observed by scanning electron microscopy. Transmission electron microscopy revealed that thrombi were degraded into particles of high electron density. Conclusion The major electron microscope changes of targeted microbubble and UK combined with diagnostic ultrasound are vacuolation of thrombus structure, complete disintegration of fibrin network structure and complete dissolution of fibrin.

Microbubble; Thrombolytic theropy; Ultrasonography

國家自然科學(xué)基金(30860267)。

關(guān)麗娜(1977—)，女(錫伯族)，新疆伊犁人，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：心血管超聲診斷與治療。E-mail: sanjin_lsx@163.com

穆玉明，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，830054。E-mail: mym1234@126.com

2016-06-03

2016-11-01

R-332； R445.1

A

1003-3289(2017)01-0001-05

10.13929/j.1003-3289.201606016