尹 全，李 憶，鄧 強(qiáng)，敬 媛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066；2.四川民族學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系，四川康定626001；3.甘孜州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，四川康定626000）

一種可同步檢測(cè)3種外源基因的多重PCR方法

尹 全1，李 憶2，鄧 強(qiáng)1，敬 媛3

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066；2.四川民族學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系，四川康定626001；3.甘孜州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，四川康定626000）

為建立一種可同步檢測(cè)3種外源基因的多重PCR方法，試驗(yàn)選擇較常見(jiàn)的T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat這3個(gè)基因作為多重PCR檢測(cè)對(duì)象，對(duì)多重PCR體系中引物濃度配比和引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，多重PCR適宜的引物終濃度（μmol/L）配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat為0.2∶0.2∶0.2以及適宜的引物退火溫度為56℃；采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對(duì)多重PCR體系靈敏度進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，方法靈敏度為0.5 ng；通過(guò)利用建立的多重PCR方法對(duì)已知樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，試驗(yàn)建立的多重PCR體系具有良好的可靠性。

T-CaMV 35S；P-CaMV 35S；pat；多重PCR；檢測(cè)

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，多種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物（genetic modified crops，GMC）應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，在一定程度上提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量及農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，有效地緩解了世界人口過(guò)多、可耕作土地面積不斷減少以及不可預(yù)測(cè)自然災(zāi)害帶來(lái)的不利影響等。

2015年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第20年，轉(zhuǎn)基因作物種類(lèi)在持續(xù)增加，其種植面積也連續(xù)增加了19 a，在2015年有所下降。截至2015年，全球28個(gè)國(guó)家種植了1.8億hm2的轉(zhuǎn)基因作物，比2014年28個(gè)國(guó)家的1.81億hm2有所減少[1]。種植的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物主要包括大豆、玉米、棉花和油菜。轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展給全球帶來(lái)了很多收益，據(jù)Klumper和 Qaim在2014年全球各地進(jìn)行的調(diào)查試驗(yàn)得到的原始數(shù)據(jù)，結(jié)合過(guò)去20 a的147項(xiàng)已知轉(zhuǎn)基因作物研究綜合分析表明，轉(zhuǎn)基因作物的出現(xiàn)使化學(xué)農(nóng)藥的使用減少了37%、作物產(chǎn)量增加了22%、農(nóng)民收入增加了68%[2]。但隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品及加工產(chǎn)品不斷增多，人們廣泛關(guān)注其安全性問(wèn)題，相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度也被越來(lái)越多國(guó)家制定并實(shí)施[3]。而轉(zhuǎn)基因相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展是保證轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度有效實(shí)施的前提條件。

目前，蛋白檢測(cè)和核酸檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的兩大類(lèi)。其中，核酸檢測(cè)技術(shù)中，主要用于農(nóng)作物及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[4-5]的常規(guī)PCR技術(shù)因其具有快速、敏感、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)而被廣泛采用。然而，利用核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，確認(rèn)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因外源基因成分往往需要對(duì)多個(gè)外源基因進(jìn)行篩選檢測(cè)。盡管常規(guī)PCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)中優(yōu)勢(shì)明顯，但若是對(duì)多個(gè)外源基因分別檢測(cè)時(shí)，也存在耗時(shí)、繁瑣和耗費(fèi)大等問(wèn)題[6]。因此，為解決常規(guī)PCR技術(shù)在檢測(cè)多個(gè)基因時(shí)存在的問(wèn)題，多重PCR應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)是將多對(duì)特異性引物加入一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，針對(duì)多個(gè)DNA模板擴(kuò)增多個(gè)目的片段[7-8]。由于多重PCR具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間、提高效率、降低成本的特點(diǎn)[9-10]，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、病原菌和動(dòng)物源性等方面的檢測(cè)[11-13]。

多重PCR技術(shù)應(yīng)用于作物外源基因檢測(cè)中較為普遍，但在前人研究中并沒(méi)有選擇T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat這3種外源基因作為檢測(cè)組合的多重PCR體系。本研究擬通過(guò)對(duì)多重PCR檢測(cè)方法優(yōu)化，旨在建立包括T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat這3種外源基因的多重PCR篩選檢測(cè)體系。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑

試驗(yàn)材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心保存；離心機(jī)（5424，德國(guó)eppendorf公司），PCR儀（Veritee96-well，美國(guó)ABI公司），DNA超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 1000，美國(guó)Thermo公司），毛細(xì)管電泳儀（QIAxcel Advanced，德國(guó)Qiagen公司）；植物基因組提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix購(gòu)于日本東洋紡績(jī)株式會(huì)社；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 選擇常見(jiàn)的T-CaMV 35S，PCaMV 35S和pat這3個(gè)基因作為檢測(cè)對(duì)象，特異性引物序列參照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.2.2 樣品DNA提取 樣品DNA提取采取試劑盒方法進(jìn)行[16]。

1.2.3 多重PCR方法的優(yōu)化建立

1.2.3.1 單基因特異性 在反應(yīng)總體積為25 μL的PCR體系中進(jìn)行單基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Master Mix（2×）12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min。當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束后，立即對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，確定單基因引物是否具有特異性。

1.2.3.2 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 在25 μL反應(yīng)體系中對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。Master Mix（2×）12.5μL，3對(duì)引物中正反向引物各0.25μL，模板2μL。優(yōu)化反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火溫度設(shè)置64，60，58，56，54，50℃6個(gè)梯度，退火30 s，72℃延伸30 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸3 min。當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束后，立即對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，確定多重PCR反應(yīng)程序中最適宜的退火溫度。

在25 μL反應(yīng)體系中對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。Master Mix（2×）12.5 μL，引物終濃度配比按照表2設(shè)置相應(yīng)的濃度梯度，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)程序按照優(yōu)化后確定的程序進(jìn)行。當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束后，立即對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，確定多重PCR反應(yīng)體系中最適宜的引物終濃度配比。

表2 PCR引物終濃度配比

1.2.4 多重PCR檢測(cè)靈敏度分析 基因組DNA用ddH2O進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)沟梅磻?yīng)體系中基因組DNA總質(zhì)量分別為50，10，3，1，0.5，0.1 ng，使用1.2.3中的反應(yīng)體系及優(yōu)化后的反應(yīng)條件分析多重

為了解當(dāng)前高校英語(yǔ)數(shù)字化教學(xué)資源共建共享情況，筆者進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)調(diào)查和走訪部分學(xué)校，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前高校英語(yǔ)數(shù)字化教學(xué)資源共建共享不容樂(lè)觀，主要存在以下亟待解決的問(wèn)題。

PCR方法的靈敏度。

1.2.5 多重PCR檢測(cè)已知樣品 用優(yōu)化獲得的多重PCR檢測(cè)體系對(duì)已知樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總DNA提取結(jié)果

樣品總DNA通過(guò)超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和質(zhì)量，經(jīng)測(cè)定得知，所有樣品的OD260/OD230值均大于2.0，OD260/OD280值在1.8～2.0，DNA的濃度和質(zhì)量能滿(mǎn)足本試驗(yàn)PCR要求，再將各樣品總DNA濃度稀釋至25 ng/μL。

2.2 單基因特異性驗(yàn)證結(jié)果

從圖1可以看出，3對(duì)引物均能在相應(yīng)目標(biāo)位置處觀察到特異性條帶，而非特異性條帶未見(jiàn)明顯擴(kuò)增。由此可知，本試驗(yàn)選擇的引物可用于多重PCR檢測(cè)體系研究。

2.3 多重PCR體系優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，在64℃條件下，T-CaMV 35S基因的目的條帶未得到有效擴(kuò)增，所以，退火溫度為64℃不適合；在60℃條件下，T-CaMV 35S基因的目的條帶擴(kuò)增量太小，在150，280，540 bp左右處出現(xiàn)了3條非特異性條帶，顯然退火溫度60℃也不適合；在50，58℃條件下，所有目的條帶都能得到擴(kuò)增，但是目的條帶間的擴(kuò)增量不一致，所以，這2個(gè)溫度條件也不適合；而在退火溫度為54℃時(shí)，各目的條帶的擴(kuò)增量相對(duì)一致，但在370，540 bp左右處出現(xiàn)了1條非特異性條帶，退火溫度54℃也不適合；在56℃時(shí)，雖然在540 bp左右處也出現(xiàn)了1條非特異性條帶，但并不影響對(duì)結(jié)果的判斷。因此，最終選擇多重PCR體系的適宜退火溫度為56℃。

引物濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，引物終濃度配比按照方案A，C，D，E，F(xiàn)配比時(shí)，目的基因存在擴(kuò)增效率不一致、無(wú)擴(kuò)增或擴(kuò)增量小等情況，結(jié)果均不太理想；引物終濃度僅按照方案B配比時(shí)，各目的基因間的擴(kuò)增效率相對(duì)較高并且相對(duì)一致。所以適宜的引物終濃度（μmol/L）配比最終確定為T(mén)-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat為0.2∶0.2∶0.2。

2.4 多重PCR反應(yīng)體系靈敏度分析

由圖4可知，只有在模板濃度不低于0.5 ng時(shí)，3個(gè)目標(biāo)片段才可得到有效擴(kuò)增。當(dāng)模板終濃度低至0.5 ng時(shí)，所有目的片段均可得到有效擴(kuò)增，但擴(kuò)增量相對(duì)偏??；在模板濃度低于0.5 ng時(shí)，3個(gè)外源基因幾乎沒(méi)有擴(kuò)增。表明建立的多重PCR檢測(cè)體系靈敏度不低于0.5 ng。

2.5 多重PCR檢測(cè)已知樣品結(jié)果

選擇已知樣品對(duì)優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，所有樣品分子特征顯示的外源基因與擴(kuò)增目的條帶是對(duì)應(yīng)的。此結(jié)果再次驗(yàn)證了多重PCR檢測(cè)體系的可靠性。

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，獲得的轉(zhuǎn)基因生物越來(lái)越多，同時(shí)轉(zhuǎn)入的外源基因類(lèi)型也日益增多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因成分日漸趨于復(fù)雜化。因此，尋求一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法將對(duì)轉(zhuǎn)基因相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)產(chǎn)生有益效果。多重PCR方法被CHAMBERLAIN等[18]于1988年首次提出，截至目前已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)中的各個(gè)領(lǐng)域，包括基因多態(tài)性分析、定性定量分析、微生物耐藥檢測(cè)及動(dòng)物源性檢測(cè)等[19-20]，多重PCR是科研、檢測(cè)工作的主要手段，具有很高的實(shí)用價(jià)值。多重PCR技術(shù)只需一個(gè)反應(yīng)和一次電泳即可同時(shí)檢出多個(gè)目的基因片段，可大大節(jié)約試劑和時(shí)間[21]。李會(huì)等[22]對(duì)多重PCR法快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米多種轉(zhuǎn)化體技術(shù)優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了比較分析研究，結(jié)果表明，與單一PCR檢測(cè)技術(shù)相比，成本降低了75%，檢測(cè)耗時(shí)縮短了63%，檢測(cè)產(chǎn)生的廢液減少了75%。

由于影響多重PCR反應(yīng)的因素很多，要建立起準(zhǔn)確、高效、可靠的多重PCR體系，就需要摸索出多重PCR檢測(cè)體系中各因素的最適宜條件。在多重PCR體系中，由于涉及較多引物，因此較易造成引物錯(cuò)配、產(chǎn)生引物二聚體、出現(xiàn)非特異性帶等現(xiàn)象，從而降低多重PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率及特異性。基于此，本試驗(yàn)采用不同引物濃度梯度對(duì)引物終濃度配比進(jìn)行摸索，在結(jié)果中選擇各基因引物擴(kuò)增效率大體一致、引物二聚體少、無(wú)非特異條帶的引物終濃度配比，最后確定較適宜的引物終濃度配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat為0.2∶0.2∶0.2。

PCR反應(yīng)中，退火溫度對(duì)PCR的擴(kuò)增影響較大，多重PCR體系也是如此，所以在多重PCR反應(yīng)體系中另一個(gè)需要摸索的重要條件就是退火溫度。HENEGARIU等[23]研究表明，盡管單個(gè)目的片段的引物能夠在56～60℃特異性地?cái)U(kuò)增，但在多對(duì)引物共同反應(yīng)的多重PCR體系中，適當(dāng)降低退火溫度能夠更好地?cái)U(kuò)增所有目的片段。本試驗(yàn)對(duì)3對(duì)特異引物間的退火溫度進(jìn)行分析，選取64，60，58，56，54，50℃共6個(gè)溫度梯度，最終根據(jù)目的基因特異性條帶亮度一致性、無(wú)非特異性條帶和引物二聚體少等較優(yōu)條件選擇了56℃作為多重PCR體系的退火溫度。

本試驗(yàn)建立的多重PCR反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)了一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)轉(zhuǎn)基因成分，此方法在很大程度上提高了相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)效率，同時(shí)也避免了單一PCR反應(yīng)容易出現(xiàn)的漏檢現(xiàn)象，從而為轉(zhuǎn)基因相關(guān)初加工產(chǎn)品的檢測(cè)提供了一種更為準(zhǔn)確、有效的方法。

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A Multiplex PCR Method for Simultaneous Detection of Three Exogenous Genes

YINQuan1，LI Yi2，DENGQiang1，JINGYuan3
（1.Analysis and TestingCenter，Sichuan AcademyofAgricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2.Department ofEnvironmental and Life Sciences，Sichuan Universityfor Nationalities，Kangding626001，China；3.Agricultural Product QualitySafetyCenter ofGanzi Cityin Sichuan，Kangding626000，China）

Toestablish a multiplexPCR method for detectingthree kinds ofexogenous genes,the T-CaMV 35S,P-CaMV 35S and pat were selected as parameters ofmultiple PCR detection.The reaction conditions were optimized.The experimental results showed that the optimum annealing temperature of multiple PCR was 56℃,the optimum final concentration of primers（μmol/L）ratio was 0.2∶0.2∶0.2 for T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat.Using the optimized reaction system to test the sensitivity of multiplex PCR system,the results showed that the sensitivity of the method was 0.5 ng.Using the method of multiple PCR to detect the known samples,the test results showed that the multiplexPCR systemwas established with good reliability.

Terminator CaMV 35S;Promoter CaMV 35S;pat;multiplexPCR;detection

Q503

：A

：1002-2481（2017）01-0037-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.10

2016-09-11

四川省財(cái)政現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與示范專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014CXSF-040）；四川省教育廳自然科學(xué)一般項(xiàng)目（15ZB0331）

尹 全（1981-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)工作。李 憶為通信作者。