渠云芳，段永紅，康娜娜，杜海燁，成 莎，黃晉玲

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801）

色素腺體性狀不同棉花近等基因系的遺傳分析

渠云芳，段永紅，康娜娜，杜海燁，成 莎，黃晉玲

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801）

采用SRAP標記對色素腺體性狀不同棉花近等基因系進行分析。結(jié)果表明，39對SRAP引物組合對2對近等基因系材料共擴增出304條帶，每對引物組合可以擴增出5.69條多態(tài)性帶，多態(tài)性條帶比率達到73%；共擴增出57條特異條帶，特異條帶比例達到18.9%。遺傳相似度分析結(jié)果表明，W1與Y1遺傳相似系數(shù)為0.740 3；Y2與W2的遺傳相似系數(shù)為0.763 6。聚類分析結(jié)果表明，在GS為0.85處，將參試材料分為2個類群，W1與Y1的遺傳相似系數(shù)比較大，歸為一類；W2與Y2的親緣關系比較近，歸為另一類。研究結(jié)果可為近等基因系親緣關系的鑒定以及為腺體基因的進一步研究提供依據(jù)。

棉花；色素腺體；近等基因系；SRAP

棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，不僅是人類所需要的優(yōu)質(zhì)天然纖維的主要來源，而且其種子還是僅次于大豆、棕櫚樹、油菜、向日葵的蛋白資源和油料資源[1-3]。棉花整個植株上分布有呈不規(guī)則形狀的黑褐色色素腺體，色素腺體是錦葵科棉屬植物及其近緣物種所特有的器官[4]。由于色素腺體內(nèi)含有對人和反芻類動物有害的物質(zhì)棉酚，因而被認為是棉屬植物應對生物和非生物脅迫的防御器官，腺體的有無、多少與棉花對脅迫的反應密切相關。目前，棉花色素腺體性狀已經(jīng)開始應用于棉花的育種實踐[5]，一方面通過培育色素腺體多即棉酚含量高的棉花新品種，以提高棉花對病蟲害的抵抗性；另一個方面通過培育棉酚含量低的棉花新品種，以使得棉籽蛋白得以充分利用[6]。

SRAP標記（Sequence-amplified polymorphism，序列相關擴增多態(tài)性）是一種新型的分子標記技術(shù)，該技術(shù)主要是針對開放閱讀框進行擴增[7-8]。與其他分子標記相比，SRAP具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率等特點，能應用于基因定位、克隆、遺傳多樣性分析以及構(gòu)建遺傳圖譜[9]。SRAP現(xiàn)已應用于許多植物的研究，孫紅葉等[10]以西府海棠S19雜交組合的F1為材料，采用SRAP標記對BSA群體進行了分析，最終選出了4條與耐鹽基因連鎖的分子標記。葛海燕等[11]采用SRAP與SSR標記相結(jié)合的方法，構(gòu)建了陸陸雜種遺傳連鎖圖，并且檢測到了1個與抗黃萎病相關的QTL。史紅麗等[12]采用SRAP標記和SSR標記相結(jié)合對47份桃樹進行了遺傳多樣性分析，研究結(jié)果與形態(tài)學聚類相吻合。林忠旭等[13]用SRAP標記對11份陸地棉材料進行遺傳多樣性檢測，結(jié)果表明，在30個引物組合中有15個組合具有多態(tài)性，并得到了22個多態(tài)性條帶，顯示了較高的多態(tài)性比率。高建明等[14]對47個甜高粱品種進行了SRAP指紋分析，結(jié)果建立了可以鑒定不同基因型的SRAP指紋圖譜，為以后的研究提供了參考依據(jù)。賀潤麗等[15]采用SRAP方法對16個款冬居群的遺傳多樣性進行了分析，其結(jié)果從分子水平揭示了不同種質(zhì)之間的遺傳差異。

目前，有關色素腺體形態(tài)解剖學方面的研究較多，而對色素腺體的遺傳規(guī)律、分布模式以及如何運用這些規(guī)律調(diào)控或誘導腺體的發(fā)生還有待于進一步探究[6]。棉花色素腺體性狀不同的近等基因系的培育，為腺體基因的深入研究提供了理想材料。SRAP分子標記在棉花育種上已有所應用，但運用SRAP標記對腺體性狀的研究還較少。

本研究以色素腺體性狀不同近等基因系為研究材料，采用SRAP標記對參試材料進行遺傳多樣性分析，旨在揭示近等基因系材料的親緣關系，為腺體基因的進一步定位提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用材料均是從（亞洲棉（Gossypium arboreum）×比克氏棉（G.bickii））×陸地棉（G.hirsutum）3種雜種后代中，經(jīng)多代回交選育獲得的色素腺體性狀不同而穩(wěn)定的近等基因系（表1）。W1與Y1是一對近等基因系，W2與Y2是一對近等基因系。

表1 材料編號及性狀

1.2 方法

1.2.1 SRAP標記分析方法

1.2.1.1 DNA的提取、純化和檢測 DNA的提取參照CTAB法[16]，并略有改進。

1.2.1.2 SRAP引物及其來源 SRAP分析所用引物參照LI等[7]發(fā)表的引物，由上海生工對所選引物進行合成。引物序列列于表2。

表2 SRAP正向與反向引物序列

1.2.1.3 PCR擴增與電泳 PCR反應在Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler熱循環(huán)儀上進行。PCR反應體積為20μL：包括Buffer（含鎂離子）2μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，引物各0.4 μL，DNA3 μL，0.2 μLTag酶，雙蒸水補足20 μL。

PCR反應程序參照LI等[7]介紹的方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，觀察統(tǒng)計帶型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計SRAP電泳條帶，把同一位點上有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，缺失的記為“2”；采用NTSYS-pversion 2.11[17]軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花基因組DNA檢測

本試驗采用改良CTAB法提取基因組DNA，待DNA溶解后，經(jīng)0.8%瓊脂糖進行電泳檢測（圖1）。從圖1可以看出，參試材料的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，主帶清晰且很集中，DNA信息完整，沒有拖尾現(xiàn)象，適合SRAP分析。

2.2 SRAP引物篩選及多態(tài)性分析

100對SRAP引物組合共篩選出39對擴增條帶穩(wěn)定且多態(tài)性好的引物，對每對引物在參試材料中的擴增情況進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，39對引物共擴增出304條帶，其中，多態(tài)性條帶為222條，多態(tài)性條帶比例介于12.5%～100%，引物組合Me5-Em11，Me8-Em2等的多態(tài)性比例達到100%，而引物組合Me3-Em3，Me2-Em2的多態(tài)性比例僅為25%。引物不同，擴增的多態(tài)性條帶數(shù)也不相同，擴增條帶最少的為4條，最多的為16條，平均每對引物擴增的條帶數(shù)為7.79條；平均多態(tài)性條帶為5.69條，占73%（表3）。表明SRAP技術(shù)的多態(tài)性比較高，適合進行遺傳多樣性分析。從圖2可以看出，材料W1與Y1以及W2與Y2之間存在有明顯的差異條帶。

表3 39個引物組合擴增多態(tài)性

2.3 特異位點分析

39對引物組合對參試材料擴增共產(chǎn)生57條特異條帶（表3）。不同引物組合對不同材料進行擴增，所產(chǎn)生的特異位點數(shù)量存在差異，特異條帶比例為0～57.1%，平均每對引物組合產(chǎn)生的特異條帶為1.46條，占18.9%。其中，有的引物組合沒有產(chǎn)生特異條帶，如Me5-Em3，Me2-Em1等；有的引物產(chǎn)生的特異條帶較多，可以達到5條，如Me8-Em2；其余引物擴增產(chǎn)生的特異條帶介于1～4條。各個材料產(chǎn)生的特異條帶數(shù)也存在差異，有腺體材料擴增產(chǎn)生的特異條帶為33條，無腺體材料擴增產(chǎn)生的特異條帶為22條。利用這些特異條帶就可以進一步對近等基因系進行分析，為色素腺體基因的定位提供了依據(jù)。

2.4 遺傳相似性分析

利用軟件NTSYS對參試材料的遺傳相似性系數(shù)進行了計算，結(jié)果顯示，W1與Y1之間的遺傳相似系數(shù)為0.740 3，Y2與W2之間的遺傳相似系數(shù)為0.763 6（表4），均比理論值0.984 4低，可能是由于W1與Y1，W2與Y2雖然經(jīng)過多代回交，農(nóng)藝性狀上已達到一致，但在分子水平上，由于供體親本存在基因連鎖累贅現(xiàn)象，導致了近等基因系之間還存在比較大的差異。

表4 參試材料的遺傳相似系數(shù)（GS）

2.5 聚類分析

參試材料的聚類分析結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在GS為0.85處，將參試材料分為兩大類，材料W1與Y1由于其親緣關系比較近，歸為一類；材料W2與Y2由于是一對近等基因系，歸為另一類。

3 討論

3.1 色素腺體性狀不同棉花近等基因系近等性評價

近等基因系主要是通過回交而得[18]，它們之間除了目標性狀外，絕大部分遺傳背景相似。課題組前期已對參試材料進行了形態(tài)學調(diào)查，結(jié)果表明，參試材料除了在色素腺體性狀上存在差異外，其他農(nóng)藝性狀已基本穩(wěn)定。本研究采用SRAP對參試材料進行了分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2對近等基因系遺傳多態(tài)性均比較高，W1與Y1的相似系數(shù)為0.740 3，Y2與W2的相似系數(shù)為0.763 6，但均低于理論值0.984 4，劉雅輝等[9]對23個小麥抗葉銹病近等基因系的SRAP分析結(jié)果表明，其參試材料之間的遺傳相似系數(shù)介于0.72～0.92，與本研究結(jié)果一致。理論上，近等基因系之間應存在較低的遺傳多態(tài)性，而造成近等基因系之間遺傳多態(tài)性高的原因可能是由于分子檢測屬于一種抽樣檢測，不可能對全部位點進行整體檢測，故存在一些位點被遺漏[19]。

3.2 SRAP技術(shù)在棉花近等基因系研究中的可行性

SRAP是近幾年來發(fā)展起來的以PCR擴增為基礎的又一種新的分子標記[20]，具有簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標片段的優(yōu)點。伊艷杰等[21]采用240對SRAP引物對小麥感白粉病品種SF42與抗病品種ZB90進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有40%的引物組合能在抗感品種中擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。劉雅輝等[22]以Thatcher和23個以Thatcher為遺傳背景的小麥抗葉銹病的近等基因系以及Tclr與Thatcher雜交的F2植株為材料，采用SRAP分子標記對小麥抗葉銹病基因Lr19進行研究，結(jié)果獲得了一個與小麥抗葉銹病基因相連鎖的SRAP標記。楊在君等[23]采用SRAP標記分析了小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41對多態(tài)性引物共擴增出537條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達到49.5%。汪保華等[24]采用SRAP對3個黃褐棉近等基因系進行了研究，結(jié)果表明，所選出的近等基因系與親本陸地棉相比，它們的遺傳背景基本相同，僅僅是在1，14，19號染色體上存在有黃褐棉的漸滲片段。本研究采用39對引物對參試材料進行擴增，結(jié)果表明，共擴增出304條帶，產(chǎn)生222條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶率為73%，平均每個引物組合產(chǎn)生5.69條多態(tài)性條帶，并在參試材料中能擴增出特異條帶，表明SRAP技術(shù)能夠揭示一些遺傳基礎的實質(zhì)，能夠?qū)⒋嬖诘牟町惓浞直憩F(xiàn)出來。

4 結(jié)論

本研究采用SRAP對2對色素腺體性狀不同的棉花近等基因系進行了分析，結(jié)果表明，39對SRAP引物對2對近等基因系材料共擴增出304條帶，多態(tài)性條帶達到222條，多態(tài)性條帶比率達到73%；共擴增出57條特異條帶，特異條帶比例達到18.9%。遺傳相似度分析表明，W1與Y1遺傳相似系數(shù)為0.740 3，Y2與W2的遺傳相似系數(shù)為0.763 6。聚類分析結(jié)果表明，在GS為0.85處，將參試材料分為2個類群，W1與Y1的遺傳相似數(shù)比較大，歸為一類；W2與Y2的親緣關系比較近，歸為另一類。

［1］ASH M，DOHLMAN E.Oil crops situation and outlook yearbook[R]. Washinton：United States Department ofAgriculture，2006.

［2］ GETASIMIDIS K，F(xiàn)ILLOU D，BABATZIMCPOULOU M，et al. Preparation ofan edible cottonseed protein concentrate and evaluation of its functional properties[J].International journal of food sciences and nutrition，2007，58（6）：486-490.

［3］SUNILKUMAR G，CAMPBELL L M，PUCKHABER L，et al.Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction oftoxic gossypol[J].Proceedings ofthe National Academyof Sciences，2006，103：18054-18059.

［4］邱志堅，劉文哲.棉花色素腺體研究進展[J].魯東大學學報（自然科學版），2008，24（2）：162-167.

［5］朱乾浩.棉族色素腺體的利用 [J].植物雜志，1992，19（1）：36-37.

［6］謝永芳.棉花腺體形成相關基因的研究 [D].重慶：重慶大學，2008.

［7］ LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a newmarker system based on a simple PCR reaction：its application tomappingand gene taggingin Brassica[J].Theoretical and applied genetics，2001，103（2/3）：455-461.

［8］李武，倪薇，林中旭，等.海島棉遺傳多樣性的SRAP標記分析[J].作物學報，2008，34（5）：893-899.

［9］劉雅輝，閆紅飛，楊文香，等.23個小麥抗葉銹病近等基因系SRAP多態(tài)性[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（5）：1333-1340.

［10］孫紅葉，張媛，李中勇，等.蘋果砧木耐鹽性基因SRAP標記的鑒定及序列分析[J].華北農(nóng)學報，2015，30（2）：59-63.

［11］葛海燕，汪業(yè)春，郭旺珍，等.陸地棉抗黃萎病性狀的遺傳及分子標記研究[J].棉花學報，2008，20（1）：19-221.

［12］史紅麗，韓明玉，趙彩平.桃樹遺傳多樣性的SRAP和SSR標記分析[J].華北農(nóng)學報，2009，24（8）：187-192.

［13］林忠旭，張獻龍，聶以春.新型標記SRAP在棉花F2分離群體及遺傳多樣性評價中的適用性分析 [J].遺傳學報，2004，31（6）：622-626.

［14］高建明，羅峰，裴忠有，等.甜高粱重要種質(zhì)材料的SRAP指紋分析[J].華北農(nóng)學報，2010，25（2）：93-98.

［15］賀潤麗，平莉莉，王倫宇，等.不同居群款冬種質(zhì)資源SRAP遺傳多樣性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2014，42（4）：321-323.

［16］CLARKMS.植物分子生物學實驗手冊[M].北京：高等教育出版社，1998.

［17］ROHLF F J.NTSYS pc：Numerical taxonomy and multivariate analysis systemversion 2.1[M].NewYork，USA：Applied Biostatistics Inc，2000.

［18］夏軍紅，鄭用璉.玉米Rf3近等基因系的分子標記輔助回交選育與效益分析[J].作物學報，2002，28（3）：339-344.

［19］龍衛(wèi)華，胡茂龍，高建芹，等.油菜MI CMS恢復基因近等基因系的構(gòu)建與近等性分析 [J].分子植物育種，2011，9（3）：261-269.

［20］蘇亮，白建榮，王秀紅.玉米cDNA-SRAP反應體系的優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2010，38（8）：6-9，60.

［21］伊艷杰，胡楠，劉紅彥，等.小麥白粉病基因SRAP標記的鑒定及序列分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2007，36（3）：60-62.

［22］劉雅輝，閆紅飛，楊文香，等.小麥抗葉銹病基因Lr19的SRAP標記[J].華北農(nóng)學報，2007，22（4）：193-196.

［23］楊在君，彭正，松周永紅.利用SRAP分子標記評價小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景[J].核農(nóng)學報，2012，26（1）：22-27.

［24］汪保華，王為，莊智敏，等.3個黃褐棉近等基因系的選擇及評價[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（24）：45-49.

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《山西農(nóng)業(yè)科學》編輯部

Genetic Analysis of Near-isogenic Lines with Different Pigment Glands on Cotton

QUYunfang，DUANYonghong，KANGNana，DUHaiye，CHENGSha，HUANGJinling
（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Near-isogenic lines with different pigment glands of cotton were analyzed by SRAP marker in this study.The result showed that a total of304 bands were amplified by39 SRAP primers combinations,5.69 bands with polymorphism were amplified by per primer combination.The ratio ofpolymorphic bands was 73%,57 bands（18.9%）were specific bands.The analysis ofgenetic similarity coefficients showed that the genetic similarity coefficient was 0.740 3 between W1 and Y1,the genetic similarity coefficient was 0.763 6 between W2 and Y2.The cluster analysis showed that the materials were divided into two groups at the similarity coefficient of 0.85,W1 and W2 were clusted firstly,because their genetic similarity was bigger,W2 and Y2 were clusted another group,because their genetic relationship was relative close.The result will provide evidence for the identification of genetic relationship from near-isogenic lines and further studyofpigment gland gene.

cotton;pigment gland;near-isogenic lines;SRAP

S562.03

：A

：1002-2481（2017）01-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.01

2016-11-24

山西省科技攻關項目（20130311004-3，20140311004-3）；棉花生物學國家重點實驗室開放課題（CB2015A20）

渠云芳（1973-），女，山西祁縣人，副教授，碩士，主要從事棉花遠緣雜交與雜種優(yōu)勢利用研究工作。黃晉玲為通信作者。