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        豬肉中β-受體激動劑AlphaLISA檢測方法的建立

        2017-02-14 09:19:37郗存顯聶福平曹淑瑞唐柏彬王國民陳冬東母昭德
        分析測試學報 2017年1期
        關鍵詞:布特倫特羅生物素

        龔 倩,郗存顯,聶福平,曹淑瑞,唐柏彬,王國民,陳冬東,母昭德*

        (1.重慶醫(yī)科大學 藥學院,重慶 400016;2.重慶出入境檢驗檢疫局 重慶市進出口食品安全工程技術研究中心,重慶 400020;3.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室,重慶 400016;4.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100123)

        豬肉中β-受體激動劑AlphaLISA檢測方法的建立

        龔 倩1,3,郗存顯2,聶福平2,曹淑瑞2,唐柏彬2,王國民2,陳冬東4,母昭德1,3*

        (1.重慶醫(yī)科大學 藥學院,重慶 400016;2.重慶出入境檢驗檢疫局 重慶市進出口食品安全工程技術研究中心,重慶 400020;3.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室,重慶 400016;4.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100123)

        建立了快速檢測豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇、溴布特羅和特布他林4種β-受體激動劑的光激化學發(fā)光納米均相時間分辨熒光免疫(AlphaLISA)分析方法。樣品經(jīng)乙酸銨和β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶酶解提取過柱,濃縮至干后,用緩沖溶液定容。樣品與生物素化抗原、抗體、供體微珠和受體微珠進行酶聯(lián)免疫,AlphaLISA進行檢測,基質標準曲線定量。結果表明:沙丁胺醇、克倫特羅、溴布特羅和特布他林在0.1~500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性,相關系數(shù)均大于0.98,沙丁胺醇與克倫特羅、溴布特羅和特布他林的交叉反應率分別為 143.3%,179.2%和95.6%,檢出限為0.03~0.08 ng/mL。在0.5,10,20 μg/kg 3個添加水平下,4種化合物的平均回收率為82.5%~115.9%,相對標準偏差(RSD)均小于 12.0%。該方法操作簡單,快速準確,適用于豬肉中β-受體激動劑的篩選與檢測。

        AlphaLISA;β-受體激動劑;豬肉

        β-受體激動劑(如克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特羅、特布他林等)屬于苯乙胺類藥物[1]。在臨床上,β-受體激動劑可以放松支氣管平滑肌,增加纖毛運動頻率,調節(jié)粘膜纖毛的清除率,可以用于治療支氣管炎和哮喘等疾病[2-3]。在養(yǎng)殖業(yè)中,β-受體激動劑可以增加脂類分解和脂肪細胞中脂類生成,增加肝糖分解和蛋白質的合成,減少橫紋肌纖維蛋白質的水解作用,故常用作促生長劑,以促進飼料轉化率,增加瘦肉率[4-5]。β-受體激動劑易在動物臟器中積聚殘留,并通過食物鏈進入人體,攝入過量會導致心悸、頭疼、惡心,甚至損害肝腎[6-7]。所以對克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特羅和特布他林等β-受體激動劑的監(jiān)測非常必要。

        圖1 研究采用的反向競爭 AlphaLISA反應模式Fig.1 Reverse competition AlphaLISA in this article

        β-受體激動劑的監(jiān)測方法已有很多文獻報道,主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[8]、超高效液相色譜法(UPLC)[9-10]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[11]和氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[3]等。由于色譜法操作繁瑣,不適于現(xiàn)場快速檢測[12]。酶聯(lián)免疫法則存在假陽性、免疫過程時間長和酶標物易失活等問題。而納米均相時間分辨熒光免疫技術(AlphaLISA)法是一個均相的免疫方法,具有快速、 穩(wěn)定、靈敏、免洗、無放射污染以及操作簡單等特點。該技術主要依賴于供體微珠和受體微珠之間的相互作用。當抗原抗體發(fā)生反應使供體微珠和受體微珠相互接近發(fā)生級聯(lián)反應,產(chǎn)生極大放大的信號,并被儀器檢測記錄。即當兩種微珠在680 nm的激光照射下,供體微珠上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉化為更為活躍的單體氧。單體氧將能量傳遞給受體微珠激發(fā)615 nm的光(圖1)。當待測物與生物素化抗原競爭抗體時,供體微珠和受體微珠將無法相互靠近,從而使得單體氧無法擴散到受體微珠,導致光信號下降[13-15]?,F(xiàn)有的AlphaLISA法主要用于血液[16]、蛋白質[17]、病原體[18]、癌癥[19]、新藥研究等領域,而在食品安全檢測方面鮮有應用。本研究將沙丁胺醇抗原進行生物素化后,首次應用AlphaLISA反向競爭模式對肉類中克倫特羅、沙丁胺醇、溴布特羅和特布他林4種β-受體激動劑進行檢測。該方法快速、簡單、靈敏度高,適用于大量樣品的篩選和檢測,為肉類中β-受體激動劑的實際檢驗提供了重要的參考價值。

        1 實驗部分

        1.1 試劑與儀器

        鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特羅、特布他林、西馬特羅、齊帕特羅、噴布特羅、苯乙醇胺A、妥布特羅(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH);偶聯(lián)有BSA的沙丁胺醇抗原和單克隆抗體由北京中檢維康有限公司提供;生物素(B-1001-105,美國Solulink公司);正己烷、乙酸銨(色譜純,Tedia公司);β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(≥100 000 U/mL,Sigma公司);受體微珠,供體微珠,10×buffer緩沖液以及384孔板(美國PerkinElmer公司);MCX 柱(3 mL/60 mg,美國Waters Corporation公司);其他化學品和試劑均為分析純,購于Sigma公司或Dr.Ehrenstorfer GmbH。

        多標記微孔板檢測儀(AlphaLISA儀,EnSpire 2300,美國PerkinElmer公司);BS224S天平(德國Sartorius公司);N-EVAP 116氮吹儀(美國Organomation公司),SR-2DS強力振蕩器(日本Taltec公司),渦旋振蕩器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司),3-30K離心機(德國Sigma公司),IPP500烘箱(美墨爾特公司),超純水儀(Milford,MA,USA)。

        1.2 溶液配制

        1.2.1 微珠溶液的制備根據(jù)說明,將10×buffer用超純水稀釋為1×buffer溶液。用1×buffer溶液將供體微珠稀釋至0.15 mg/mL,受體微珠稀釋至0.18 mg/mL。

        1.2.2 生物素化抗原的制備生物素化抗原通過生物素化方法得到:取偶聯(lián)有BSA的沙丁胺醇抗原32 μL,加至250 μL EP管中,再加入2 μL生物素,混勻離心1 min。室溫下避光放置90 min,4 ℃儲存。

        1.3 標準溶液的配制

        分別準確稱取折算成目標化合物為10 mg(精確至0.000 01 g)的各標準品,溶解在10 mL甲醇溶液中制成濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液并儲存在-20 ℃。將上述標準儲備溶液逐級稀釋成1 mg/L的標準溶液,儲存在4 ℃供日常使用。

        1.4 樣品制備

        豬肉、牛肉組織樣品購于超市。準確稱取5 g樣品,置于50 mL離心管中,并加入20 mL乙酸銨溶液(2 mol/L,pH 5.2)、50 μLβ-葡萄糖苷酸/硫酸酯復合酶以及標準品溶液,渦旋混勻后37 ℃下振蕩提取16 h。7 000 r/min離心5 min,上清液轉移至新的50 mL離心管中。向離心管中加入20 mL 正己烷,振蕩20 min。7 000 r/min離心5 min,棄去正己烷層,水相立即經(jīng)濾紙過濾,并用2 mL乙酸銨溶液洗滌濾紙。待凈化。

        取MCX柱用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL鹽酸(0.1 mol/mL)進行活化,將樣品提取液轉入MCX柱中,用3 mL水、3 mL甲醇-水溶液(1∶1)和3 mL正己烷淋洗,棄去洗脫液,吹干。再用3 mL洗脫液(50 mL乙酸乙酯,45 mL甲醇,5 mL氨水)進行洗脫,收集洗脫液。洗脫液在40 ℃下氮氣吹干。殘留物用1 mL 1×buffer溶解,渦旋混勻2 min,過0.22 μm微孔濾膜。供檢測。

        1.5 檢測方法

        在已優(yōu)化條件下,取白色不透明微孔板,每孔加入5 μL生物素化沙丁胺醇抗原(1∶3 200),5 μL沙丁胺醇抗體,5 μL標準品或者樣品,離心1 min,37 ℃避光孵育30 min后,依次加入 5 μL供體微珠(0.15 mg/mL)和5 μL受體微珠(0.18 mg/mL),離心1 min充分混勻,37 ℃避光孵育60 min。用 AlphaLISA檢測儀測定每個待測孔的光信號強度,繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算樣品中待測物的含量。

        圖2 生物素化抗原和抗體濃度的優(yōu)化Fig.2 Concentration optimization of biotinylated antigen and antibody

        圖3 供體微珠濃度的優(yōu)化Fig.3 Concentration optimization of donor beads

        2 結果與討論

        2.1 抗原-抗體濃度的優(yōu)化

        用1×buffer緩沖溶液將生物素化抗原稀釋至:1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800??贵w做相同系列稀釋倍數(shù),采用棋盤法進行條件優(yōu)化。每個濃度加至孔板中,其中最后1個孔只加Buffer作空白對照。按照“ 1.5”步驟進行檢測,將待測樣品替換成buffer。各濃度的信號強度值如圖2所示,生物素化抗原濃度在1∶3 200~1∶6 400倍稀釋,抗體在1∶1 600~1∶6 400倍稀釋時,信號強度值較高。當抗原和抗體稀釋倍數(shù)均為1∶3 200時,熒光值達到最高。在此濃度范圍內(nèi),綜合考慮熒光強度、抗原抗體成本及用量等,選擇生物素化抗原濃度1∶3 200,抗體濃度1∶3 200作為最適實驗條件。

        2.2 供體微珠和受體微珠濃度的優(yōu)化

        供體微珠和受體微珠用1×buffer緩沖溶液分別稀釋至0.03,0.06,0.09,0.12,0.15,0.18,0.21 mg/mL。按“ 1.5 ”步驟進行條件優(yōu)化(圖3)。結果表明,隨著供體微珠濃度的增加,相應的熒光值也增加,當濃度為0.15 mg/mL時,熒光值達到最大。受體微珠濃度與熒光值的變化規(guī)律與供體微珠類似,當受體微珠濃度為0.18 mg/mL時,熒光值達到最大。故本實驗選擇供體微珠的最佳濃度為0.15 mg/mL,受體微珠的最佳濃度為0.18 mg/mL。

        2.3 基質效應

        采用基質溶液和溶劑分別配制相同濃度的標液,對克倫特羅、沙丁胺醇、溴布特羅和特布他林進行基質效應評價?;|效應強弱的計算方法為:

        當ME%<0 時表示存在抑制效應,ME%>0 時表示存在增強效應。絕對值為20%~50%時存在中等基質效應,絕對值>50%時存在較強的基質效應。計算結果顯示,4種化合物的ME%值為12%~67%,表明基質效應較強。為滿足檢測要求,本實驗采用配制基質標準曲線來消除基質影響。

        2.4 標準曲線與靈敏度

        取1 mg/mL的標準儲備溶液配制成系列標準工作溶液(濃度為0.1,1,5,10,20,50,100,500 ng/mL),優(yōu)化條件下測定。結果顯示,該方法對沙丁胺醇、溴布特羅、克倫特羅及特布他林的檢出限 LOD(IC10)分別為0.06,0.03,0.05,0.08 ng/mL,在范圍為0.1~500 ng/mL進行線性擬合,獲得良好的線性關系,其線性方程分別為y=-0.242 3x+0.682 0,y=-0.194 5x+0.748 5,y=-0.212 4x+0.699 8,y=-0.158 9x+0.671 6,相關系數(shù)均大于0.98。

        表1 沙丁胺醇和其他化合物的交叉率

        2.5 特異性

        將結構或功能相似的10種化合物(鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特羅、特布他林、西馬特羅、齊帕特羅、噴布特羅、苯乙醇胺A和妥布特羅)用1×buffer緩沖溶液分別配成濃度為0.1~500 ng/mL的待測溶液。用已建立的AlphaLISA 方法進行檢測,測定 IC50值(表1)。沙丁胺醇與鹽酸克倫特羅、溴布特羅的交叉反應率>100%,與特布他林的交叉反應率為95.6%,與其余6種化合物無交叉反應。表明該方法可用于沙丁胺醇、克倫特羅、溴布特羅和特布他林的篩選和檢測。

        2.6 樣品的測定

        對市售的豬肉樣品進行提取,采用已建立的AlphaLISA 方法進行檢測,結果表明,豬肉樣品中均未檢出沙丁胺醇、克倫特羅、溴布特羅及特布他林。進一步對豬肉樣品進行加標回收試驗,加標水平分別為0.5,10,20 μg/kg,每個濃度水平重復檢測 3 次,結果見表2。沙丁胺醇、溴布特羅、克倫特羅及特布他林的回收率為82.5%~115.9%,相對標準偏差均小于 12.0%。將已建立的AlphaLISA法與液相色譜-串聯(lián)質譜法進行比較(見表2)。結果顯示,AlphaLISA法的回收率與精密度良好,達到檢測要求,可用于豬肉中沙丁胺醇、克倫特羅、溴布特羅及特布他林4種β-受體激動劑的篩選和檢測。

        表2 豬肉樣品的回收率

        3 結 論

        本文建立了一種準確、快速檢測沙丁胺醇、克倫特羅、溴布特羅和特布他林4種β-受體激動劑的分析方法,該方法靈敏度高,檢測時間短,適用于大量樣品的篩選和檢測,可成功用于豬肉中上述4種β-受體激動劑的篩選和檢測,從而為肉類產(chǎn)品的安全性和可靠性提供了技術保障。

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        Quantitative Determination of β-Agonists in Pork Using the Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay

        GONG Qian1,3,XI Cun-xian2,NIE Fu-ping2,CAO Shu-rui2,TANG Bo-bin2,WANG Guo-min2,CHEN Dong-dong4,MU Zhao-de1,3*

        (1.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Chongqing Engineering Technology Research Center of Import and Export Food Safety,Chongqing 400020,China;3.Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Chongqing 400016, China;4.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100123,China)

        An amplified luminescent proximity homogeneous assay(AlphaLISA) was developed for the determination of four kinds ofβ-agonists(clenbuterol,salbutamol,brombuterol,terbutaline) in pork.The analytes were stepwise extracted with ammonium acetate andβ-glucuronidase/sulfatase,the extract was columned and concentrated to dryness,redisolved in buffer.Samples were reacted with botinylated antigen,antibody,donor beads and acceptor beads,and detected by AlphaLISA with matrix standard curve.As a result,there are good linear relationships in the concentration range of 0.1-500 ng/mL,with correlation coefficients larger than 0.98.The cross-reactivities for clenbuterol,brombuterol,terbutaline were 143.3%,179.2%and 95.6%,respectively,and the limits of detection(LOD) were 0.03-0.08 ng/mL.The average recoveries of four compounds at spiked levels of 0.5,10,20 μg/kg were in the range of 82.5%-115.9%with relative standard deviations(RSD) not less than 12.0%.The method is simple,rapid and accurate,and is suitable for the detection and screening ofβ-agonists in pork.

        AlphaLISA;β-agonists;pork

        10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.020

        2016-08-13;

        2016-09-20

        國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目(2015IK333);質檢公益性行業(yè)科研專項項目(201210086)

        *通訊作者:母昭德,教授,研究方向:藥物分析,Tel:18108396565,E-mail:1281618155@qq.com

        O657.3;TQ460.72

        A

        1004-4957(2017)01-0117-05

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