徐瀟穎，羅金文，陳萬(wàn)勤，趙超群，劉 柱

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052)

磁性多壁碳納米管固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中多組分獸藥殘留

徐瀟穎，羅金文，陳萬(wàn)勤，趙超群，劉 柱*

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052)

建立了以磁性多壁碳納米管為吸附劑的分散固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，對(duì)蜂蜜中3大類44種獸藥殘留進(jìn)行測(cè)定。樣品經(jīng)pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液提取，加入自制磁性多壁碳納米管吸附目標(biāo)物。目標(biāo)物經(jīng)10%氨水-甲醇洗脫后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式進(jìn)行定性定量分析。44種藥物在1～40 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；在3個(gè)不同濃度添加水平下，回收率為78.0%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～8.9%，檢出限為0.2～2.0 μg/kg。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單方便，易于操作，為蜂蜜中磺胺類、喹諾酮類以及硝基咪唑類獸藥殘留的測(cè)定提供了新途徑。

磁性多壁碳納米管；磺胺；硝基咪唑；喹諾酮；蜂蜜

磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類藥物均為抗菌藥，在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。在目前蜂養(yǎng)殖業(yè)中，蜜蜂易得細(xì)菌性疾病，蜂農(nóng)為預(yù)防蜂病的發(fā)生，往往會(huì)給蜜蜂喂食抗菌類藥物，致使蜂蜜中獸藥殘留問題屢禁不止。2002年，歐盟以抗生素殘留超標(biāo)為由，禁止中國(guó)蜂蜜出口，雖然隨后解除了該項(xiàng)禁止，但對(duì)蜂蜜中獸藥殘留的檢測(cè)工作仍持續(xù)開展。由于蜂蜜中糖含量較高，直接測(cè)定痕量的獸藥殘留存在一定困難，檢測(cè)通常以固相萃取小柱凈化來減少雜質(zhì)干擾。目前市場(chǎng)上商品化的固相萃取小柱(MWCNTs)是一種具有高穩(wěn)定性和強(qiáng)吸附性能的納米材料，比表面積大，一般由2～50層石墨片組成，直徑在幾到幾十納米之間，長(zhǎng)度可達(dá)幾十甚至上百微米[2-6]，對(duì)有機(jī)物、金屬離子和有機(jī)金屬化合物等具有較強(qiáng)的富集能力[7]。近年來，MWCNTs因具有類似C18的吸附性能，被作為一種新型的固相萃取劑，廣泛用于農(nóng)藥殘留[8-16]和獸藥殘留[17-18]的檢測(cè)。對(duì)磁性顆粒進(jìn)行表面修飾，不僅能高效地捕集樣品基質(zhì)中的痕量目標(biāo)分析物，而且很好地克服了傳統(tǒng)固相萃取小柱在樣品處理過程中易堵塞和操作繁瑣等問題，使分離和富集過程變得簡(jiǎn)捷、快速和高效。Kumar等[19]將其用于氧氟沙星的富集分析研究，Zhao等[20]在食用油中多環(huán)芳烴的分析檢測(cè)也使用了磁性MWCNTs。本文利用實(shí)驗(yàn)室研制的磁性MWCNTs凈化蜂蜜樣品，并對(duì)凈化過程中的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定了蜂蜜中3大類44種獸藥殘留。該方法簡(jiǎn)單方便，易于操作，從而為蜂蜜中磺胺類、喹諾酮類以及硝基咪唑類獸藥殘留的測(cè)定提供了支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司);氮?dú)獯蹈蓛x(Biotage公司);渦旋混合器(上海琪特公司);酸度計(jì)(Mettler Toledo公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司);甲酸(色譜純，美國(guó)Fluka公司);乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氨水、氯化鐵、氯化亞鐵、濃硝酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);MWCNTs純度>97%，直徑20～40 nm，長(zhǎng)度>5 μm(深圳市納米港有限公司)。

實(shí)驗(yàn)所用44種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg上述標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-18 ℃冰箱中，分別移取20 μL 1 mg/mL的儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后配制成2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用前稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 磁性多壁碳納米管的制備

1.3.1 MWCNTs羧化稱取1.5 g多壁碳納米管粉末置于250 mL單口燒瓶中，加入150 mL濃硝酸，超聲振蕩1 h，移入恒溫水浴槽中，于60 ℃回流12 h，冷卻后，除去上層酸液，反復(fù)水洗至中性，于100 ℃下烘干4 h。

1.3.2 磁 化稱取0.36 g羧化MWCNTs粉末置于250 mL雙口燒瓶中，加入225 mL水，超聲20 min后加入0.18 g無(wú)水氯化鐵，移入恒溫水浴槽中于60 ℃在氮?dú)獗Ｗo(hù)下振搖30 min，加入0.45 g氯化亞鐵后繼續(xù)振搖30 min，加入150 mL 25%氨水振搖2 h后，取出，冷卻，除去上層液體，水洗至中性，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱在50 ℃下烘干24 h。MWCNTs磁化后可被磁鐵吸附，未磁化和磁化后多壁碳納米管的電鏡照片見圖1。

1.4 樣品前處理方法

稱取蜂蜜樣品2 g于250 mL燒杯中，加入100 mg磁性MWCNTs，加200 mL pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine溶液，超聲5 min，使磁性MWCNTs均勻分布于提取液中，提取60 min后，用磁鐵對(duì)磁性MWCNTs進(jìn)行吸附，用吸管吸取清水對(duì)磁性MWCNTs進(jìn)行淋洗后去除洗液，加入10 mL 10%氨水-甲醇后超聲5 min，收集洗脫液，重復(fù)洗脫1次，合并兩次洗脫液，于40 ℃下氮吹近干，用初始比例流動(dòng)相定容至1.0 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)或相同效能色譜柱；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～4 min，90% B；4～8 min，90%～65% B；8～12 min，65%～55% B；12～14 min，55%～70% B；14～16 min,70%～90% B；16～18 min，90% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；源電壓4 kV；毛細(xì)管溫度400 ℃；鞘氣流速12 L/min；獸藥化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下44種藥物的質(zhì)譜條件

*quantitation ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的優(yōu)化

蜂蜜樣品中含有大量糖分，通常用水稀釋后進(jìn)行提取，在對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行加水稀釋后的磁性吸附實(shí)驗(yàn)中，易出現(xiàn)喹諾酮類藥物回收率低。主要是由于不同類抗生素藥物的pKa值范圍較寬的緣故。實(shí)驗(yàn)分別采用pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine溶液、pH 6.0和pH 8.0的磷酸鹽緩沖液以及0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(pH 12.0)作為提取溶液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，使用酸性提取液的提取效果優(yōu)于堿性提取液，其中經(jīng)pH 4.0的Na2EDTA-Mcllvaine溶液稀釋后進(jìn)行磁性碳納米管吸附實(shí)驗(yàn)得到的回收率較高，且基質(zhì)干擾較小，故選擇其作為提取溶液。

2.2 磁性MWCNTs加入量的優(yōu)化

在相同樣品提取液中，磁性多壁碳納米管的加入量對(duì)樣品中多組分獸藥殘留的回收率也存在直接影響，分別稱取20，60，100，150 mg的MWCNTs加入100 mL樣品提取液中，當(dāng)加標(biāo)量為20 μg/kg時(shí)，磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類藥物的回收率隨著MWCNTs加入量的增加而增加，當(dāng)加入量大于100 mg時(shí)回收率變化趨于平緩。因此，當(dāng)樣品稱取量為2 g時(shí)，磁性MWCNTs的最佳加入量為100 mg。

2.3 洗脫條件的優(yōu)化

分別采用甲醇、5%甲酸-甲醇及5%氨水-甲醇作為洗脫液，對(duì)吸附目標(biāo)物的磁性MWCNTs進(jìn)行洗脫。結(jié)果顯示，目標(biāo)物在堿性條件下的洗脫效果優(yōu)于甲醇和5%甲酸-甲醇的洗脫效果。單獨(dú)采用甲醇作為洗脫溶劑時(shí)，喹諾酮類藥物的回收率偏低，主要是因?yàn)樗嵝蕴崛∫菏够前奉?、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物不同程度結(jié)合了質(zhì)子，在甲醇中添加氨水能中和目標(biāo)物結(jié)合的質(zhì)子，使目標(biāo)物呈中性，更利于洗脫，提高其回收率。該現(xiàn)象與文獻(xiàn)[21-22]的研究結(jié)果相一致。在堿性洗脫條件下，進(jìn)一步對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的氨水-甲醇(5%，10%，15%)進(jìn)行比較，結(jié)果表明隨著洗脫液中氨水比例增大，洗脫后的樣液顏色變深，雜質(zhì)干擾變大，當(dāng)洗脫液中氨水比例由10%升至15%時(shí)，3類藥物的回收率增加不明顯。因此，選擇10 mL 10%氨水-甲醇分兩次進(jìn)行洗脫。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

獸藥多殘留檢測(cè)依賴于色譜柱的選擇，不同色譜柱對(duì)不同類別獸藥的分離效果存在一定差異，實(shí)驗(yàn)分別考察了單獨(dú)測(cè)定磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類獸藥殘留時(shí)常用的Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)，Waters Atlantis?T3(150 mm×2.1 mm，5.0 μm)，ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)的分離效果。結(jié)果顯示，Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)在MRM模式下對(duì)44種組分可實(shí)現(xiàn)較好的分離，且各色譜峰峰形較好，雜質(zhì)干擾較小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Thermo C18(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分離。

對(duì)比了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈作為強(qiáng)極性洗脫溶劑，可提高待分離組分的離子化效率，而在水相中加入0.1%甲酸時(shí)，各化合物在ESI+模式下的離子化效果更好，峰形有所改善，靈敏度也相應(yīng)提高，因此本實(shí)驗(yàn)選取乙腈及0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。分四通道對(duì)44種化合物的MRM色譜圖進(jìn)行提取，結(jié)果如圖2所示。

2.5 線性關(guān)系、檢出限與加標(biāo)回收率

采用空白基質(zhì)溶液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各目標(biāo)物的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，3類藥物均在1～40 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99。對(duì)陰性蜂蜜樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加5，10，30 μg/kg 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行，按“1.4”方法進(jìn)行樣品前處理，回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限見表2。20種磺胺類、17種喹諾酮類及7種硝基咪唑類藥物的回收率分別為83.6%～105.1%,78.0%～101.1%及87.7%～99.5%；檢出限為0.2～2.0 μg/kg。磁化后的碳納米管，與曹慧等[21]采用多壁碳納米管進(jìn)行蜂蜜中獸殘測(cè)定，所得的磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物回收率相符，說明磁化處理對(duì)碳納米管的富集作用無(wú)影響。侯建波等[23]采用HLB固相萃取柱進(jìn)行前處理凈化后，測(cè)得磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類藥物的回收率分別為52.5%～114.0%,62.8%～110.0%及67.5%～111.0%，說明本文采用磁性碳納米管對(duì)這3類藥物的回收率可達(dá)到HLB固相萃取柱凈化處理的回收水平。

表2 44種獸藥的回收率測(cè)定結(jié)果及方法檢出限(n=12)

2.6 實(shí)際蜂蜜樣品的分析

應(yīng)用本方法對(duì)96批蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定，其中2批蜂蜜樣品中分別檢出5.6 μg/kg環(huán)丙沙星和7.0 μg/kg諾氟沙星。與各藥物的現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法GB/T 23412-2009的測(cè)定結(jié)果(環(huán)丙沙星和諾氟沙星含量分別為6.7,6.5 μg/kg)進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)假陰性情況。

3 結(jié) 論

與傳統(tǒng)的前處理過程中采用固相萃取小柱凈化相比，磁性MWCNTs在進(jìn)行樣品前處理過程中可均勻分布于提取液中，對(duì)目標(biāo)物的吸附更徹底，待吸附完成后，利用磁性吸引，使吸附目標(biāo)物的磁性MWCNTs快速被收集，磁化后的MWCNTs將磁性分離技術(shù)和固相吸附劑結(jié)合，有效解決了吸附劑難回收問題，大大簡(jiǎn)化了前處理過程，達(dá)到了多類獸殘同時(shí)提取，且凈化效果理想，價(jià)格低。利用自制的磁性MWCNTs固相萃取材料測(cè)定蜂蜜中20種磺胺類、17種喹諾酮類及7種硝基咪唑類獸藥殘留，回收率為78.0%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～8.9%。其中，磺胺類、喹諾酮類及硝基咪唑類的平均回收率分別為88.1%，88.2%，91.5%，與采用固相萃取柱進(jìn)行前處理后測(cè)定的3類獸殘的回收率相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示出磁性MWCNTs在前處理凈化過程中的省時(shí)、節(jié)約、便捷等特點(diǎn)，這為蜂蜜中多組分獸藥殘留的測(cè)定提供了新方法。

[1] He Q,Kong X Q,Li J H,Le A S,Wu S M.Chin.J.Anal.Lab.(何強(qiáng),孔祥虹,李建華,樂愛山,吳雙民.分析試驗(yàn)室),2010,29(8):61-65.

[2] Huang Y,Yuan Y L,Zhou Z D.Appl.SurfaceSci.,2014,292:378-386.

[3] Pistone A,Lannazzo D,Fazio M.PhysiacaB-CondensedMatter,2014,434:88-91.

[4] Demir A,Baykal A,Sozeri H.Synth.Met.,2014,187:75-80.

[5] Yin M,Wang M L,Miao F.Carbon,2012,50(6):2162-2170.

[6] Majidi M R,Salimi A,Alipour E.J.Chin.Chem.Soc.,2013,60(12):1473-1478.

[7] Katsumata H,Matsumoto T,Kaneco S.Microchem.J.,2008,88(1):82-86.

[8] Zhou Q,Xiao J,Wang W.Talanta,2006,68(4):1309-1315.

[9] Guo L,Lee H K.J.Chromatogr.A,2011,1218(52):9321-9327.

[10] Liu X Y,Zhang H X,Liu M C.J.Chromatogr.A,2008,1212(1/2):10-15.

[11] Wang W D,Huang Y M,Shu W Q.J.Chromatogr.A,2007,1173(1/2):27-36.

[12] Liu X Y,Ji Y S,Zhang Y H.J.Chromatogr.A,2007,1165(1/2):10-17.

[13] Zhou Q X,Wang W D,Xiao J P.Anal.Chim.Acta,2006,559(2):200-206.

[14] Zhou Q X,Wang W D,Ding Y J.Chin.Chem.Lett.,2008,19(1):95-98.

[15] Dong M F,Ma Y Q,Zhao E C.Microchim.Acta,2009,165(1/2):123-128.

[16] Rong J F,Wei H,Huang H S,Li Y J,Xu M Z.J.Instrum.Anal.(榮杰峰，韋航，黃伙水，李亦軍，許美珠.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2016,35(1):8-15

[17] Zhao H X,Liu H P,Yan Z Y.Chin.J.Chromatogr.(趙海香,劉海萍,閆早嬰.色譜),2014,32(3):294-298.[18] Xu Y,Chen H Y,Zhao Q.FoodChem.,2013,140(1/2):83-90.

[19] Kumar D R,Manoj D,Santhanalakshmi J.J.Nanosci.Nanotechnol.,2014,13:1-11.

[20] Zhao Q,Wei F,Luo Y B.J.Agric.FoodChem.,2011,59(24):12794-12800.

[21] Cao H,Chen X Z,Zhu Y,Li Z G.Chem.J.Chin.Univ.(曹慧,陳小珍,朱巖,李祖光.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)),2013,12(34):2710-2715.

[22] Cao H,Chen X Z,Zhu Y,Li Z G.NewCarbonMater.(曹慧,陳小珍,朱巖,李祖光.新型碳材料),2015,30(6):572-578.

[23] Hou J B,Xie W,Chen X M,Xi J Y,Qian Y.Chin.J.Chromatogr.(侯建波,謝文,陳笑梅,奚君陽(yáng),錢艷.色譜),2011,29(6):535-542.

Determination of Veterinary Drugs Residues in Honey by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Magnetic Multi-walled Carbon Nanotubes

XU Xiao-ying,LUO Jin-wen,CHEN Wan-qin,ZHAO Chao-qun,LIU Zhu*

(Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)

A method using magnetic multi-walled carbon nanotubes(mMWCNTs) as the absorbent followed by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established for the determination of 44 veterinary drugs residues in honey.Analytes were extracted with Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution(pH 4.0) before self-made mMWCNTs were added to absorb veterinary drugs.After extraction with mMWCNTs and followed by elution with 10% ammonia-methanol,target analytes were analyzed using multiple reaction monitoring(MRM) mode.The correlation coefficients of linear calibration curves were over 0.99 in the concentration range of 1-40 ng/mL.The recoveries of 44 analytes at three spiked concentrations ranged from 78.0% to 105.1%,with relative standard deviations(RSDs) of 1.2%-8.9%.The limits of detection(LODs,S/N≥3) were 0.2-2.0 μg/kg.With the advantages of simplicity,sensitivity and good precision, this method provides a new way for the determination of multi-veterinary drug residues in honey.

magnetic multi-walled carbon nanotubes;sulfonamide;nitroimidazole;quinolone;honey

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.010

2016-07-26；

2016-08-29

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37054)；浙江省科技廳重大項(xiàng)目(2014C02001)

*通訊作者：劉 柱，碩士，中級(jí)工程師，研究方向：食品安全與分析技術(shù)，Tel：0571-87180322，E-mail:zliu82@126.com

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0061-06